微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 21項(xiàng)目二十一：弧菌科鑒定

項(xiàng)目二十一弧菌科鑒定學(xué)習(xí)目標(biāo)1．掌握霍亂弧菌和副溶血性弧菌的主要生物學(xué)特性、微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及鑒定依據(jù)。2．熟悉氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬主要生物學(xué)特性、微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及鑒定依據(jù)。3．了解常見弧菌科細(xì)菌的臨床意義。4．具有正確采集和處理常見弧菌科細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本及進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)的能力。5．能正確選擇試驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)常見弧菌科細(xì)菌進(jìn)行檢驗(yàn)，能正確判斷和分析試驗(yàn)結(jié)果并發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告。項(xiàng)目二十一弧菌科鑒定項(xiàng)目二十一弧菌科鑒定一、弧菌屬的鑒定項(xiàng)目二十一弧菌科鑒定一、弧菌屬鑒定概述1.弧菌屬（Vibrio）弧菌屬是一類需氧或兼性厭氧，分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，氧化酶陽性，賴氨酸脫羧酶陽性，精氨酸水解酶陰性，嗜堿，耐鹽，不耐酸的細(xì)菌。本屬細(xì)菌種類多，分布廣泛，尤其是水中最為常見。2.形狀短小，約0.5×(1～5)微米，因彎曲如弧而得名。分散排列，偶爾互相連接成S狀或螺旋狀。革蘭氏染色陰性，菌體一端有單鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑。無芽胞，無莢膜。3.與人類密切相關(guān)的有霍亂弧菌、副溶血性弧菌弧菌，感染后主要癥狀為腹瀉。1.生物學(xué)性狀（1）形態(tài)與染色：革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點(diǎn)狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜。一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌1.生物學(xué)性狀（2）培養(yǎng)特性：營(yíng)養(yǎng)要求不高，在PH8.8～9.0的堿性蛋白胨水或平板中生長(zhǎng)良好。在堿性平板上菌落直徑為2mm,圓形，光滑，透明。在TCBS瓊脂平板菌落呈黃色，分解蔗糖。一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌1.生物學(xué)性狀（3）生化反應(yīng)：硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，當(dāng)培養(yǎng)在含硝酸鹽及色氨酸的培養(yǎng)基中，產(chǎn)生靛基質(zhì)與亞硝酸鹽，在濃硫酸存在時(shí)，生成紅色，稱為霍亂紅反應(yīng)，埃爾托型弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應(yīng)有所不同。前者Vp陽性而后者為陰性。前者能產(chǎn)生強(qiáng)烈的溶血素，溶解羊紅細(xì)胞，在血平板上生長(zhǎng)的菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血環(huán)，古典型霍亂弧菌則不溶解羊紅細(xì)胞。個(gè)別埃爾托型弧菌菌株亦不溶血。一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌1.生物學(xué)性狀（4）抗原構(gòu)造

根據(jù)弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個(gè)血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個(gè)生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個(gè)血清型：含AC者為原型（又稱稻葉型），含AB者為異型（又稱小川型），A、B、C均有者稱中間型（彥島型）菌體（O）抗原。一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌1.生物學(xué)性狀（5）抵抗力：霍亂弧菌古典生物型對(duì)外環(huán)境抵抗力較弱，埃爾托生物型抵抗力較強(qiáng)，在河水、井水、海水中可存活1～3周，在鮮魚，貝殼類食物上存活1～2周。霍亂弧菌對(duì)熱，干燥，日光，化學(xué)消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿。濕熱55℃，15分鐘，100℃，1～2分鐘，水中加0.5ppm氯15分鐘可被殺死。0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達(dá)到消毒目的。在正常胃酸中僅生存4分鐘。一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌2.臨床意義（1）主要致病物質(zhì)：

霍亂弧菌產(chǎn)生腸毒素，是一種劇烈的致泄毒素。該毒素作用于腸壁促使腸黏膜細(xì)胞極度分泌從而使水和鹽過量排出，導(dǎo)致嚴(yán)重脫水虛脫；進(jìn)而引起代謝性酸中毒和急性腎功能衰竭。（2）所致疾?。阂鹆倚阅c道傳染病霍亂，為我國(guó)的甲類法定傳染病。在自然情況下，人類是霍亂弧菌的唯一易感者。主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。（3）藥物敏感性：霍亂的治療主要為及時(shí)補(bǔ)充液體和電解質(zhì)及應(yīng)用抗菌藥物如鏈霉素、氯霉素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方SMZ-TMP等。一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（1）標(biāo)本采集：標(biāo)本以糞便為主，在發(fā)病早期，盡可能在患者用藥之前采集標(biāo)本。用無菌棉拭子采集自然排出的新鮮糞便，亦可采集嘔吐物或采集肛門拭子。采集的標(biāo)本應(yīng)及時(shí)接種于堿性蛋白胨水增菌，不能及時(shí)接種者，應(yīng)將標(biāo)本置于文臘二氏保存液或卡-布運(yùn)送培養(yǎng)基中由專人運(yùn)送。一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（2）檢驗(yàn)程序一、弧菌屬鑒定（一）霍亂弧菌糞便、肛拭子、嘔吐物增菌（堿性蛋白胨水）直接涂片、革蘭染色鏡檢魚群狀排列的革蘭陰性弧菌可初步報(bào)告初步鑒定：菌落特征、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查、動(dòng)力及制動(dòng)試驗(yàn)最后鑒定：生化反應(yīng)、血清學(xué)鑒定分離培養(yǎng)（堿性瓊脂平板、TCBS瓊脂平板）報(bào)告3.微生物學(xué)檢驗(yàn)

（一）霍亂弧菌一、弧菌屬鑒定（3）檢驗(yàn)方法1）直接涂片染色鏡檢：糞便、肛拭子、嘔吐物標(biāo)本直接涂片革蘭染色，油鏡下觀察到魚群狀排列的革蘭陰性弧菌可初步報(bào)告。2）制動(dòng)試驗(yàn)：取急性期患者的水樣糞便或堿性胨水增菌培養(yǎng)6小時(shí)左右的表層生長(zhǎng)物，先作暗視野顯微鏡檢，觀察動(dòng)力。如有穿梭樣運(yùn)動(dòng)物時(shí)，則加入O1群多價(jià)血清一滴，若是O1群霍亂弧菌，由于抗原抗體作用，則凝集成塊，弧菌運(yùn)動(dòng)即停止。如加O1群血清后，不能制止運(yùn)動(dòng)，應(yīng)再用O139血清重作試驗(yàn)。3）分離培養(yǎng)：常用TCBS瓊脂平板或堿性瓊脂平板。選擇可疑或典型菌落，進(jìn)行鑒定。3.微生物學(xué)檢驗(yàn)

（一）霍亂弧菌一、弧菌屬鑒定（3）檢驗(yàn)方法4）血清學(xué)鑒定：霍亂弧菌的鑒定按下述3個(gè)步驟進(jìn)行：

確定血清群：取可疑菌落與O1群多價(jià)血清做凝集實(shí)驗(yàn)，確定屬于O1群還是非O1群霍亂弧菌；

確定血清型：若為O1群霍亂弧菌，再取可疑菌落分別與O1群?jiǎn)蝺r(jià)分型血清A、B、C做凝集實(shí)驗(yàn)，確定血清型；

生物分型：根據(jù)生物學(xué)特性，做生化試驗(yàn)進(jìn)行生物分型，確定是古典生物型還是埃爾托生物型。近年來國(guó)外亦有應(yīng)用霍亂毒素基因的DNA探針，作菌落雜交，可迅速鑒定出產(chǎn)毒O1群霍亂弧菌?；魜y弧菌與其他弧菌的鑒別（一）霍亂弧菌一、弧菌屬鑒定試驗(yàn)Ⅰ群Ⅱ群Ⅲ群Ⅳ群Ⅴ群Ⅵ群霍亂弧菌擬態(tài)弧菌梅氏弧菌辛辛那弧菌豪氏弧菌美人魚弧菌河流弧菌弗尼斯弧菌溶藻弧菌副溶血弧菌創(chuàng)傷弧菌哈氏弧菌0%NaCl++----------1%NaCl++++++++++++蔗糖+-++--+++--/++/-氧化酶++-+++++++++硝酸鹽++-+++++++++甘露醇++++--++++-/++/-葡萄糖產(chǎn)氣-------+----精氨酸--+/---+++----賴氨酸++-/++/--+/---++++V-P+/--+--+--+--+/-8%NaCl---/++/---+/-+/-++/---鳥氨酸++------+/-++/--肌醇---/++--------1.生物學(xué)特性（1）形態(tài)與染色：革蘭染色陰性菌，為多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌，無芽孢，無莢膜，有單鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑。（2）培養(yǎng)特性：兼性厭氧菌，此菌營(yíng)養(yǎng)要求不高。溫度30℃—37℃，含鹽2.5%—3%(若鹽濃度低于0.5%則不生長(zhǎng)），pH值為8.0—8.5時(shí)生長(zhǎng)良好。對(duì)酸較敏感，當(dāng)pH6以下即不能生長(zhǎng)。在普通食醋中1一3min即死亡。在固體培養(yǎng)基上菌落常隆起，圓形，表面光滑，濕潤(rùn)。在3%一3．5%含鹽水中繁殖迅速，每8～9min為一周期。（二）副溶血性弧菌一、弧菌屬鑒定1.生物學(xué)特性（3）生化反應(yīng)：該菌在3.5%NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，鹽濃度低于0.5%和高于10%則不生長(zhǎng)。從糞便中分離的致病菌株能使人或兔紅細(xì)胞發(fā)生溶血，對(duì)馬紅細(xì)胞不容血，稱為神奈川現(xiàn)象。（4）抵抗力：該菌嗜鹽畏酸，在普通食醋中1一3min即死亡。對(duì)高溫抵抗力小，50℃20min；65℃5min或80℃1min即可被殺死。對(duì)常用消毒劑抵抗力很弱，可被低濃度的酚和煤酚皂溶液殺滅。（二）副溶血性弧菌一、弧菌屬鑒定2.臨床意義

副溶血性弧菌主要引起的食物中毒，一般表現(xiàn)為發(fā)病急，潛伏期2-24h，一般為10h發(fā)病。主要的癥狀為腹痛，優(yōu)勢(shì)腹痛在臍部附近劇烈。腹痛是本病的特點(diǎn)，多為陣發(fā)性絞痛，并有腹瀉、惡心、嘔吐、畏寒發(fā)熱，大便似水樣。便中混有黏液或膿血，部分病人有里急后重，重癥患者因脫水，使皮膚干燥及血壓下降造成休克。少數(shù)病人可出現(xiàn)意識(shí)不清、痙攣、面色蒼白或發(fā)紺等現(xiàn)象，若搶救不及時(shí)，呈虛脫狀態(tài)，可導(dǎo)致死亡。一、弧菌屬鑒定（二）副溶血性弧菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)一、弧菌屬鑒定（二）副溶血性弧菌（1）標(biāo)本采集：采集患者糞便、肛門拭子和可疑食物。采集的標(biāo)本應(yīng)及送檢，如不能及時(shí)送檢，應(yīng)將標(biāo)本置于3.5%NaCl蛋白胨水或卡-布運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢。3.微生物學(xué)檢驗(yàn)一、弧菌屬鑒定（二）副溶血性弧菌（2）檢驗(yàn)方法1）增菌培養(yǎng)：取0.5-1ml標(biāo)本于3.5%NaCl蛋白胨水中，350C培養(yǎng)，數(shù)小時(shí)后若出現(xiàn)明顯渾濁，即可分離培養(yǎng)。2）分離培養(yǎng)：將標(biāo)本或增菌培養(yǎng)物接種于TCBS瓊脂平板或3.5%NaCl瓊脂平板，350C培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在TCBS瓊脂平板上因不發(fā)酵蔗糖，形成1-2mm、綠色或藍(lán)綠色、不透明的菌落。3.微生物學(xué)檢驗(yàn)一、弧菌屬鑒定（二）副溶血性弧菌（2）檢驗(yàn)方法3）生化鑒定：根據(jù)形態(tài)、染色性等特點(diǎn)，以及在選擇培養(yǎng)基上的菌落特征，取可疑菌落做進(jìn)一步生化鑒定。一、弧菌屬鑒定（二）副溶血性弧菌生化試驗(yàn)結(jié)果生化試驗(yàn)結(jié)果氧化酶+0%NaCl中生長(zhǎng)-吲哚+1%NaCl中生長(zhǎng)+甲基紅+7%NaCl中生長(zhǎng)+V-P試驗(yàn)-10%NaCl中生長(zhǎng)-枸櫞酸鹽利用-葡萄糖-精氨酸雙水解-乳糖-鳥氨酸+麥芽糖+賴氨酸+蔗糖-硫化氫-甘露醇+尿素酶+/-阿拉伯糖+/-副溶血性弧菌的生化特征二、氣單胞菌屬的鑒定項(xiàng)目二十一弧菌科鑒定二、氣單胞菌屬的鑒定1.形態(tài)與染色

革蘭陰性直桿菌，大小為（1～4）μm×（0.1～1）/μm，菌體兩端鈍圓，單極鞭毛，運(yùn)動(dòng)極為活潑（除殺鮭氣單胞菌外）。無芽胞，有窄的莢膜。（一）生物學(xué)特性二、氣單胞菌屬的鑒定2.培養(yǎng)特性

需氧或兼性厭氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在血瓊脂上形成灰白、光滑、濕潤(rùn)、凸起直徑約2mm的菌落，多數(shù)菌株有β溶血環(huán)，3～5天后菌落呈暗綠色；在腸道選擇培養(yǎng)基上，大多數(shù)菌株形成乳糖不發(fā)酵菌落；在TCBS瓊脂上生長(zhǎng)不良；液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁。（一）生物學(xué)特性3.生化反應(yīng)

發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，氧化酶和觸酶試驗(yàn)陽性，在65g/LNaCl中不生長(zhǎng)。（一）生物學(xué)特性二、氣單胞菌屬的鑒定試驗(yàn)嗜水氣單胞菌豚鼠氣單胞菌維隆氣單胞菌簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌舒伯特氣單胞菌易損氣單胞菌溫和型維隆型吲哚+++++-+葡萄糖產(chǎn)氣+-++++-精氨酸+++-+++鳥氨酸---+---V-P+-+++--阿拉伯糖++-----乳糖-+-----蔗糖++++---氨芐青霉素RRRRRRS氣單胞菌屬主要生化反應(yīng)

人類接觸該菌后可引起感染，是人類急性腹瀉的重要病原菌。特別是5歲以下的兒童易發(fā)生氣單胞菌性腹瀉，大多數(shù)病例屬于這一年齡段。除了胃腸炎，氣單胞菌還與傷口感染、骨髓炎、腹膜炎、敗血癥、呼吸道感染等有關(guān)。臨床常見的有嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和維隆氣單胞菌等。患嚴(yán)重氣單胞菌性腹瀉的患者可給予特殊抗菌治療。嗜水氣單胞菌對(duì)頭孢噻吩、氨芐西林、羧芐西林耐藥，四環(huán)素敏感性不定，對(duì)廣譜頭孢菌素大多敏感。嗜水氣單胞和溫和氣單胞菌通常對(duì)復(fù)方磺胺異惡唑、氟喹諾酮、氨基糖苷類抗生素敏感。（二）臨床意義二、氣單胞菌屬的鑒定1.標(biāo)本采集

根據(jù)不同疾病采集糞便或肛拭子、血液、膿汁、腦脊液、尿液等標(biāo)本。2.檢驗(yàn)方法（1）直接涂片：標(biāo)本涂片革蘭染色鏡檢，呈革蘭陰性短桿菌。懸滴標(biāo)本觀察動(dòng)力，運(yùn)動(dòng)活潑。（2）分離培養(yǎng)：血液標(biāo)本經(jīng)肉浸液或胰化酪蛋白大豆肉湯內(nèi)增菌后轉(zhuǎn)種血瓊脂平板或含氨芐青霉素血平板；膿汁、分泌物等直接接種血瓊脂平板；糞便標(biāo)本接種腸道選擇培養(yǎng)基。另一部分標(biāo)本可接種于PBS，置4℃冷增菌后，于1、3、5、7、17天移種分離平板上。標(biāo)本接種后，經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48h后可觀察菌落特征。（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)二、氣單胞菌屬的鑒定2.檢驗(yàn)方法（3）生化鑒定：（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)二、氣單胞菌屬的鑒定1）初步鑒定：挑可疑菌落移種KIA、MIU做初步生化反應(yīng)，KIA：K/A、產(chǎn)氣+/-、H2S-，MIU：++-；氧化酶陽性。2）最后鑒定：氧化酶試驗(yàn)陽性可與腸桿菌科細(xì)菌鑒別，發(fā)酵葡萄糖可與非發(fā)酵菌鑒別。三、鄰單胞菌屬的鑒定項(xiàng)目二十一弧菌科鑒定1.形態(tài)與染色

革蘭陰性直桿菌，大小為0.8～1.0μm×3.0μm，菌體兩端鈍圓，成雙或短鏈狀排列，有1-5根極端鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑。在血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后可形成灰色平滑、不透明、大小1.5mm的菌落，無溶血現(xiàn)象?？稍邴溈祫P平板上生長(zhǎng)，呈不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵型。在HE瓊脂平板上不發(fā)酵乳糖菌落呈藍(lán)綠色。三、鄰單胞菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性HE平板大便培養(yǎng)物，其中綠色菌落為類志賀鄰單胞菌，橙色為正常菌群三、鄰單胞菌屬的鑒定（二）臨床意義

類志賀鄰單胞菌導(dǎo)致腸胃炎，好發(fā)于夏季，通常為散發(fā)流行，臨床癥狀可以是短時(shí)間的水樣瀉或痢疾樣腹瀉，患者有進(jìn)食生水或海產(chǎn)品史。腸道外感染在機(jī)體抵抗力下降的人群中發(fā)生，可引起菌血癥、腦膜炎。鄰單胞菌腦膜炎常見于助產(chǎn)分娩的嬰兒，病死率高達(dá)70%。另外，類志賀鄰單胞菌偶爾也可以在傷口分泌液、膽汁、關(guān)節(jié)液、淋巴結(jié)中分離到。三、鄰單胞菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)

根據(jù)不同疾病采集可疑標(biāo)本送檢，盡可能在抗生素使用前采集。標(biāo)本接種于血瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，取可疑菌落涂片革蘭染色。該菌氧化酶和觸酶試驗(yàn)陽性，吲哚試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，發(fā)酵葡萄糖和其他