Western-Blot實驗(蛋白質(zhì)印跡法)

WB實驗細節(jié)詳述時間：2016-05-07一:蛋白定量（實驗前處理）組織:到手的組織狀態(tài):冰袋快遞:組織腐爛，蛋白含量減少干冰快遞:基本無影響甲醛處理:石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒需用勻漿器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨裂解液量:組織（g）:裂解液（ml）=1:10細胞:一般為細胞懸液實驗前需確定細胞大概濃度裂解液量:107數(shù)量細胞加入1ml裂解液

一:蛋白定量（裂解液詳述）裂解液使用時加入PMSF:1ml裂解液加1ulPMSFPMSF（苯甲基磺酰氟）是一種蛋白酶抑制劑，可抑制絲氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巰基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）PMSF在水液體溶液中不穩(wěn)定，見水易分解，需使用前加入。RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:RIPA裂解液:一:蛋白定量（原理）在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍色復(fù)合物,在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比,據(jù)此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線做對比,即可計算待測蛋白的濃度。一:蛋白定量（實驗過程）加標(biāo)樣+水（共10ul）樣品5ul+水5ul混勻放置37℃培養(yǎng)30min,測OD值,562nm標(biāo)樣(ul)01246810水(ul)10986420加入200ul（A+B)工作液，A液:B液=50:1一:蛋白定量（數(shù)據(jù)處理）OD蛋白濃度（ug/ul）最大上樣量為35ul蛋白濃度30ug保證每個孔蛋白量相同二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（配膠）分離膠試劑分離膠濃度6%8%10%12%15%18%分子量（kDa)≥9470-9455-7020-5510-20≤10去離子水（ml）5.34.64.03.32.31.330％丙烯酰胺（ml）22.73.34.05.06.01.5MTris－HCl（PH8.8）（ml）2.52.52.52.52.52.510％SDS（ml）0.10.10.10.10.10.110％AP（ml）0.10.10.10.10.10.1TEMED（ul）0.0080.0060.0040.0040.0040.004總體積（ml）10ml（兩塊膠的量）作用:使蛋白樣品分離對于分離膠來說，pH8.8與甘氨酸的pka接近，從而使不同分子量的蛋白產(chǎn)生不同的泳動速度，從而使不同分子量的蛋白分開。二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（配膠）濃縮膠作用:使蛋白樣品濃縮對于濃縮膠來說，pH6.8可以通過甘氨酸和和氯離子的作用產(chǎn)生壓縮，從而使蛋白條帶壓細。試劑濃縮膠濃度5%水（ml）230％丙烯酰胺（ml）0.51.0MTris－HCl（PH6.8）(ml)0.3810％SDS（ml）0.0310％AP（ml）0.03TEMED（ul）0.03總體積（ml）3（兩塊膠的量）制分離膠時10%AP加入后迅速混勻再加TEMED制膠,沿壁灌注,灌注時盡量不要產(chǎn)生氣泡,如有氣泡,用移液器將氣泡吸出,留出濃縮膠所需空間（梳齒長再加1cm）。覆蓋水層于分離膠溶液上,夏天將制膠器放室溫20min,冬天放37度培養(yǎng)箱20min-30min待分離膠和水層之間會出現(xiàn)清晰界面,表明分離膠充分聚合（可微微傾斜模具,檢測凝膠是否聚合）,倒掉并用濾紙吸干水在已聚合分離膠上直接灌注濃縮膠液體,立即插入加樣梳（緩慢插入,避免產(chǎn)生氣泡）。將凝膠在室溫或者37℃靜置20-30min（視具體情況而定）,直到濃縮膠完全凝固。二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（配膠）配膠過程要點:灌制分離膠隔絕空氣灌制濃縮膠插入梳子二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（原理）主要依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量對其進行分離SDS與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),并使其穩(wěn)定地存在于一個廣泛均一的溶液中。SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,而電荷因素可以被忽略。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種:化學(xué)聚合法和光聚合法?；瘜W(xué)聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（原理）在濃縮膠中:在進入分離膠前由于等速電泳現(xiàn)象而被濃縮。這是由于在電泳緩沖液中主要存在三種陰離子，Cl離子、甘氨酸陰離子以及蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，在濃縮膠的pH6.8下，甘氨酸只有少量的電離，所以其電泳遷移率最小，而Cl離子的電泳遷移率最大。在電場的作用下，Cl離子最初的遷移速度最快，這樣在Cl離子后面形成低離子濃度區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)，而低電導(dǎo)區(qū)會產(chǎn)生較高的電場強度，因此Cl離子后面的離子在較高的電場強度作用下會加速移動。達到穩(wěn)定狀態(tài)后，Cl離子和甘氨酸之間形成穩(wěn)定移動的界面。而蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物由于相對量較少，聚集在甘氨酸和Cl離子的界面附近而被濃縮成很窄的區(qū)帶（可以被濃縮三百倍），所以在濃縮膠中Cl離子是快離子（前導(dǎo)離子），甘氨酸是慢離子（尾隨離子）。在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中,制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng),濃縮膠是pH6.8,分離膠pH8.8；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。當(dāng)甘氨酸到達分離膠后,由于分離膠的pH8.8,甘氨酸離解度加大,電泳遷移速度變大超過蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物,甘氨酸和Cl離子的界面很快超過蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物。這時蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在分離膠中以本身的電泳遷移速度進行電泳,向正極移動。由于蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在單位長度上帶有相等的電荷,所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠,進入分離膠后,由于聚丙烯酰胺的分子篩作用,小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑,阻力小,遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后,這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。溴酚藍指示劑是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置。當(dāng)指示劑到達凝膠底部時,停止電泳,從平板中取出凝膠。二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（裝膠）取凝固好的SDS膠,將凝膠放入電泳槽內(nèi),將電泳緩沖液加入內(nèi)外電泳槽中,使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中,小心拔出加樣梳。二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（上樣）將處理好的蛋白樣品按照預(yù)定的順序用移液器加到SDS膠上樣孔內(nèi),最后記得點上預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker。對于10孔梳子1mm厚度凝膠,每孔上樣量（蛋白質(zhì)混合物）約30ug。二:聚丙烯酰胺凝膠電泳（電泳）將電極插頭與電源上對應(yīng)的電極連接,電流應(yīng)流向正極；將電壓調(diào)至80V,預(yù)計20min后待染料遷移至分離膠時,將電壓調(diào)至100V,60min待溴酚藍到達凝膠底部時,停止電泳,關(guān)閉電源,從電源上拔掉電極插頭,從平板中取出凝膠。電壓可以根據(jù)具體情況作適當(dāng)調(diào)整,但是不能電壓過大,電壓過大易導(dǎo)致內(nèi)槽因電泳液溫度過高出現(xiàn)膠融或條帶變形。三:轉(zhuǎn)膜（原理）Westernblotting轉(zhuǎn)膜一般采用“濾紙-凝膠-膜-濾紙”夾心法，凝膠靠近負極，膜靠近正極。因為蛋白上結(jié)合有SDS，因而帶負電，在電流的作用下會從負極向正極運動，從而轉(zhuǎn)移到膜上。10x轉(zhuǎn)膜緩沖液:Tris30.3gGly151.1g加超純水至1L（使用前進行冷卻）1x轉(zhuǎn)膜緩沖液（4度保存）200ml甲醇720ml水80ml10x轉(zhuǎn)膜緩沖液

甲醇能使SDS與蛋白分離，使蛋白充分轉(zhuǎn)到膜上，甲醇濃度越高SDS與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對蛋白會有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來。一般來說甲醇的濃度為20%甲醇的另一個作用是降溫，電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時電流或電壓變化更快、溫度升高也更快三:轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）PVDF膜是用來吸附從各種凝膠中轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)的最佳用膜。這種疏水膜呈均一控制的孔結(jié)構(gòu),具有極強的吸附生物分子的能力。與硝酸纖維素膜相比,PVDF膜具有易于操作,染色性能好、抗溶劑能力強和信噪比高的特點,提高了檢測的靈敏度。其開放的孔結(jié)構(gòu)使其容易接近被吸收的蛋白質(zhì),并去除背景上沒有吸附的探針。可以說,它是免疫檢測理想的印跡膜。三:轉(zhuǎn)膜（操作過程）剝膠:用切膠板切去濃縮膠和多余的分離膠準(zhǔn)備濾紙和硝酸纖維素膜，切濾紙和膜時一定要戴手套，大小與膠一致鑷子、切膠板、浸泡膠、濾紙和海綿墊用1x轉(zhuǎn)膜液浸泡，PVDF膜用甲醇浸泡開門通風(fēng)三明治的制作:按順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)放置海綿、3層濾紙、膠、膜、3層濾紙、海綿，保證每層之間沒有氣泡。組裝順序:轉(zhuǎn)膜夾黑色面（負極）－海綿墊－濾紙－膠－膜－濾紙－海綿墊－紅色面（正極）。切記:每層之間將其中的氣泡全部趕出，組裝順序和電極正確。轉(zhuǎn)膜:100v60min（冰上電轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)膜時間:根據(jù)目的蛋白的大小來調(diào)整轉(zhuǎn)膜時間（1KD/1min）四:麗春紅染色（原理）麗春紅帶負電荷,可以與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合,同時麗春紅也可以與蛋白的非極區(qū)相結(jié)合,從而形成紅色的條帶。

麗春紅對蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸餾水,PBS或其它適當(dāng)溶液洗去。立春紅隨時間變長液體內(nèi)會出現(xiàn)黑色沉淀,多個月后需重新配置四:麗春紅染色（過程）轉(zhuǎn)膜完成后用鑷子取出PVDF膜放入容器中用麗春紅浸沒1-2分鐘后待有明顯條帶將麗春紅回收,用清水漂洗多次直至濾去液體無明顯紅色將膜放入容器中準(zhǔn)備封閉五:封閉（原理）惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑可以結(jié)合膜上的未結(jié)合位點從而降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的標(biāo)位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。最常見的封閉劑是BSA.脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20（0.05-0.1%）稀溶液。五:封閉（過程）麗春紅染色漂洗完成后。清洗干凈的膜放入盛有5%BSA的容器中，室溫封閉60-90min，或者4度過夜。5%BSA:秤取2gBSA加40ml1xPBS(或TBST)六:一抗孵育（查詢抗體）決定二抗屬性條帶大小適用實驗一抗稀釋比例六:一抗孵育（過程）封閉完成前，參照說明書將一抗用5%BSA稀釋到足夠?qū)嶒炐枨蟮牧浚o特殊要求，一抗稀釋液用封閉液）。封閉完成后，從膜上剪下寬度為1.5cm左右相應(yīng)蛋白大小條帶，倒掉封閉液，加入稀釋好的一抗溶液，搖床上平緩搖動，室溫孵育120min或4℃孵育過夜。一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗體，回收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗主要漂洗BSA，沖刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在液體中，每次10min。10xTBS配方:Tris:24.2gNacl80gPH調(diào)至7.6配制成1*TBST時100ml10*TBS定容至1L加3mlTween20七:二抗孵育（過程）一抗孵育完成前，將對應(yīng)一抗種屬的酶標(biāo)二抗1:2000稀釋到實驗需要的量（5%BSA稀釋）。將清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育60min。二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液（可回收抗體，回收二抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，漂洗方式和漂洗一抗相同，每次30min。八:ECL發(fā)光（原理）一般的發(fā)光試劑含魯米諾和H2O2.發(fā)光增強劑等物質(zhì)。發(fā)光試劑中的魯米諾被HRP和H2O2氧化，產(chǎn)生熒光，這個過程被發(fā)光增強劑加強，增強劑在HRP-魯米諾-H2O2體系中扮演著核心角色。八:ECL發(fā)光（化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)過程）將漂洗好的膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光液A液、B液按1:1配成,現(xiàn)配現(xiàn)用（一張完整的膜需500ul左右,具體量看膜大?。┎僮鲀x器拍出最佳圖片