腫瘤個(gè)體化分子病理檢測(cè)和臨床應(yīng)用資料

腫瘤個(gè)體化分子病理檢測(cè)以及臨床應(yīng)用山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院病理科 楊香山腫瘤個(gè)體化分子病理檢測(cè)及臨床應(yīng)用一、開展腫瘤個(gè)體化分子病理檢測(cè)的意義二、分子病理檢測(cè)的標(biāo)本選擇三、分子病理檢測(cè)的方法四、分子病理檢測(cè)的項(xiàng)目一.開展腫瘤個(gè)體化分子檢測(cè)的意義--個(gè)體化分子診斷是個(gè)體化治療的基石。 --靶向治療是為攻擊特異性靶分子而設(shè)計(jì),所以用藥前,必需檢測(cè)患者是否存在對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),才能發(fā)揮其療效。衛(wèi)生部原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2011)----- --IV期肺癌在開始治療前,建議先獲取腫瘤組織進(jìn)行表皮生長因子受體(EGFR)是否突變的檢測(cè),根據(jù)EGFR突變狀況制定相應(yīng)的治療策略。 中國腫瘤界正在致力于推動(dòng)腫瘤個(gè)體化分子病理診斷的規(guī)范化,同時(shí)也希望臨床能夠與病理科緊密配合,共同實(shí)現(xiàn)規(guī)范化診斷、規(guī)范化治療的目標(biāo),以造?；颊摺Ｍ饪剖中g(shù)標(biāo)本(石蠟切片）10

um

X2切片

活檢標(biāo)本（石蠟切片）10um

X4切片穿刺標(biāo)本（新鮮組織）至少芝麻粒大小胸腹水標(biāo)本不少于10mL。二.分子病理檢測(cè)的標(biāo)本選擇--盡量避開腫瘤間質(zhì)、出血灶、壞死物質(zhì)等--腫瘤細(xì)胞所占的比例也是必須要考慮的因素。--目前尚不清楚滿足分子學(xué)檢測(cè)需要的最低限度腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。--獲得質(zhì)、量俱佳的腫瘤標(biāo)本是EGFR檢測(cè)的重要前提條件，涉及到從臨床標(biāo)本采集到完成最終檢測(cè)實(shí)驗(yàn)等多個(gè)環(huán)節(jié)。--離體后及時(shí)（30分鐘內(nèi)）固定于10%中性緩沖福爾馬林液中。--固定時(shí)間:小標(biāo)本6-12h，大標(biāo)本6-48h。腫瘤組織標(biāo)本采集后進(jìn)行組織切片,然后可行病理學(xué)評(píng)估。腫瘤組織標(biāo)本包括固定包埋組織和新鮮/冰凍組織。固定包埋組織的手術(shù)標(biāo)本可得足量腫瘤DNA,但DNA片段化；小活檢標(biāo)本可得腫瘤DNA量少且片段化。新鮮/冰凍組織的手術(shù)標(biāo)本是最好的標(biāo)本,可得高質(zhì)量腫瘤DNA；小活檢標(biāo)本量少,但腫瘤DNA質(zhì)量仍好。組織切片過程包括取一張切片H&E染色用于病理評(píng)估,其余白片用于提取DNA；建議手術(shù)標(biāo)本切片數(shù)量為5μm×4,小活檢標(biāo)本為5μm×8。病理學(xué)評(píng)估可對(duì)非小細(xì)胞性肺癌進(jìn)行診斷并判斷其病理類型；測(cè)序法至少要有50%的腫瘤細(xì)胞,ARMS法至少2%的腫瘤細(xì)胞,且是在不考慮遺傳異質(zhì)性的情況下。細(xì)胞總數(shù)至少要超過200個(gè)才能確保腫瘤細(xì)胞的數(shù)量足夠用于突變檢測(cè),且標(biāo)識(shí)腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細(xì)胞用于突變檢測(cè)。腫瘤組織標(biāo)本病理學(xué)評(píng)估組織切片非小細(xì)胞性肺癌診斷及病理類型足夠的腫瘤細(xì)胞比例:測(cè)序法，至少50%腫瘤細(xì)胞；ARMS法，至少2%的腫瘤細(xì)胞(不考慮遺傳異質(zhì)性)足夠多的腫瘤細(xì)胞總數(shù):>200個(gè)腫瘤細(xì)胞標(biāo)識(shí)腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細(xì)胞取一張切片H&E染色用于病理評(píng)估其余白片用于提取DNA建議切片數(shù)量:—手術(shù)標(biāo)本,5μm×5—小活檢標(biāo)本,5μm×10固定包埋組織手術(shù)標(biāo)本:可得足量腫瘤DNA，但DNA片段化小活檢標(biāo)本:可得腫瘤DNA量少且片段化新鮮/冰凍組織手術(shù)標(biāo)本:最好標(biāo)本，可得高質(zhì)量腫瘤DNA小活檢標(biāo)本:量少，但腫瘤DNA質(zhì)量仍好腫瘤組織樣本的采集及病理評(píng)估PirkerR,etal.JThoracOncol2010;5(10):1706-1713.三.分子病理檢測(cè)的方法基因試劑盒價(jià)格適中、靈敏度,特異性高、所需時(shí)間短。PCR通用設(shè)備平臺(tái)基因芯片特定設(shè)備,價(jià)格高測(cè)序法檢測(cè)PCR通用設(shè)備平臺(tái),靈敏度,特異性低、所需時(shí)間長。價(jià)格便宜（一）技術(shù)簡(jiǎn)介腫瘤個(gè)體化治療是指實(shí)施治療前根據(jù)患者的個(gè)體差異（基因差異）,“量體裁衣”（基因檢測(cè)）地制定某個(gè)患者的治療方案,即檢查某種靶向藥物對(duì)患者是否有效或是在多種化療藥物中篩選最有效的藥物?；焸€(gè)體化可顯著提高治療效果,有效緩解疾病,避免藥物的毒副作用,提高患者的生活質(zhì)量,避免因反復(fù)嘗試不同藥物帶來的身體損害、錯(cuò)過最佳治療時(shí)間以及浪費(fèi)金錢。使用靶向藥物前必須基因檢測(cè),從而判斷該藥是否適用該患者。熒光定量PCR與基因測(cè)序法檢測(cè)基因突變的比較熒光定量PCR與基因測(cè)序法檢測(cè)基因突變的比較基因檢測(cè)過程示意圖標(biāo)本采集與運(yùn)輸要求基因突變檢測(cè)方法----國際肺癌協(xié)會(huì)共識(shí)測(cè)序法與ARMS法比較測(cè)序法和ARMS法在不同標(biāo)本類型中突變率的比較ARMS法更適合用于小標(biāo)本檢測(cè)四.分子病理檢測(cè)的項(xiàng)目分子靶向治療基因檢測(cè):EGFR（29種、4種）KRAS（7種突變）BRAF基因突變（V600E突變）Jak2基因突變（V617F突變）PIK3CA基因突變（5種熱點(diǎn)突變）C-KIT基因突變（D816V突變）RET基因突變（M918T突變）PDGFRA基因突變（D842V突變）BCR-ABL基因突變（T315I突變）EML4-ALK融合基因（RT-PCR法)藥物敏感基因檢測(cè):□ERCC1基因表達(dá)□P53基因突變（6種突變）□BRCA1基因表達(dá)□RRM1基因表達(dá)□TYMS基因表達(dá)□DPD基因表達(dá)□STMN1基因表達(dá)□TYMP基因表達(dá)□BRCA1基因表達(dá)□TOP2A基因表達(dá)□TUBB3基因表達(dá)（二）化療藥物對(duì)應(yīng)的基因檢測(cè)項(xiàng)目臨床應(yīng)用擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification

refractory

mutationsystem,ARMS)又稱等位基因特異性擴(kuò)增（Allele-specific

amplificationASA）。利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理,設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物,在嚴(yán)格的條件下,只有在引物3’堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶,從而檢測(cè)出突變。該法省去了探針雜交操作,通過設(shè)計(jì)兩個(gè)5’端引物,一個(gè)與正常DNA互補(bǔ),一個(gè)與突變DNA互補(bǔ),對(duì)于純和性突變,分別加入兩種引物及3’端引物進(jìn)行兩個(gè)平行的PCR,結(jié)合有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可以延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。細(xì)胞經(jīng)處理后,采用常規(guī)方法分離提純DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNAladder.如果細(xì)胞量很少,還可在分離提純DNA后,用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記,然后進(jìn)行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細(xì)胞中DNAladder的形成。1.大分子染色體DNA片段的測(cè)定細(xì)胞凋亡的期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí),即達(dá)到分辨力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA,DNA像通過彎管一樣,以其一端指向電場(chǎng)一極而通過凝膠,這種遷移模式稱之為“爬行”.因此,細(xì)胞凋亡 期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后,大的DNA分子便滯流在爬行管中,直至新的電場(chǎng)軸向重新定向后,才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大,這種重排所需要的時(shí)間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí),DNA就可以按其分子量大小分開。2.DNALadder測(cè)定 方法:收獲細(xì)胞（1′107）沉淀，細(xì)胞裂解液，13000rpm′5min,收集上