DB32T 1769-2011 馬鏈球菌獸疫亞種的檢測PCR 方法　

ICS65.020.30備案號：DB32MethodofPCRfordetectin江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB32/T1769—2011為規(guī)范馬鏈球菌獸疫亞種分子生物學(xué)檢測技術(shù)，提高馬鏈球菌獸疫亞種檢測的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》編寫。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：倪艷秀、何孔旺、呂立新、張雪寒、周俊明、俞正玉、茅愛華、溫立斌、郭容利、李成仁、李彬、王小敏。1DB32/T1769—2011馬鏈球菌獸疫亞種的檢測PCR方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鏈球菌獸疫亞種的檢測PCR方法所用的儀器設(shè)備和主要試劑、引物、方法步驟、結(jié)果判定、廢棄物處理和防止污染的措施等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鏈球菌獸疫亞種的PCR檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3原理PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GenBank上公布的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白基因序列，在其保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物，經(jīng)過了PCR條件的優(yōu)化、特異性實驗、敏感性實驗等，對馬鏈球菌獸疫亞種的鑒定具有很高的準(zhǔn)確性。4儀器設(shè)備和主要試劑4.1儀器設(shè)備4.1.1高速離心機4.1.2水浴鍋4.1.3PCR儀4.1.4核酸電泳儀4.1.5凝膠成像系統(tǒng)4.2主要試劑除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。4.2.1生理鹽水4.2.2蛋白酶K4.2.3Taq酶4.2.4dNTP4.2.5瓊脂糖，電泳級2DB32/T1769—2011上游引物：5′-GCAGCCCTCTTGGTTGGT-3′；下游引物：5′-CTGCGTCAGCGTCTCCAT-3′。6方法步驟試驗用水：按照GB/T6682-2008三級水標(biāo)準(zhǔn)。6.1樣品處理6.1.1病料樣品處理采用差速離心法：取約5g病料，剪碎研磨，用5mL生理鹽水混懸，先2000r/min離心2min，去除大組織塊，取上清液，后10000r/min離心5min，棄上清液，沉淀以滅菌水重懸，備用。6.1.2可疑培養(yǎng)物樣品處理取可疑培養(yǎng)物1mL10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以200μL滅菌水重懸，備用。陰性對照：液體培養(yǎng)基。陽性對照：馬鏈球菌獸疫亞種液體培養(yǎng)物。陰性、陽性對照也同樣處理，對每個樣品進(jìn)行編號標(biāo)記。6.2DNA提取取ddH2O溶解的樣品，每200μL加入3μL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，10000r／min離心5min，上清作為模板。6.3PCR擴增6.3.1反應(yīng)條件按25μL體系進(jìn)行，10×buffer2.5μL，MgCl2（25mM）1.5μL，dNTP（2.5mM）1.0μL，上游引物（50pmol/μL）0.5μL，下游引物（50pmol/μL）0.5μL，模板DNA3.0μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，滅菌水15.5μL。按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。95℃5min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃1min，60.2℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。6.3.2電泳將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120V，時間30min。6.3.3結(jié)果觀察用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并進(jìn)行拍照。7結(jié)果判定7.1試驗結(jié)果成立條件陽性對照的PCR產(chǎn)物電泳后在364bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后沒有條帶，試驗結(jié)果成立；否則，結(jié)果不成立。7.2結(jié)果判定7.2.1在試驗結(jié)果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在364bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條DB32/T1769—2011帶，判為陽性，即該樣品為馬鏈球菌獸疫亞種核酸陽性。7.2.2在試驗結(jié)果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在364bp的位置上未出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陰性，即該樣品為馬鏈球菌獸疫亞種核酸陰性。7.2.3如果陽性對照無相應(yīng)的目的條帶，可能是存在操作失誤，該試驗需要做重復(fù)試驗；如果陰性對照有相應(yīng)的目的條帶，可能是陰性對照存在污染或是操作失誤，該試驗需要做重復(fù)試驗。8廢棄物處理和防止污染的措施檢測過程中的廢棄物，應(yīng)收集后高壓滅菌處理。檢測過程中防止交叉污染的措施見附錄A。4DB32/T1769—2011(規(guī)范性附錄)檢測過程中防止交叉污染的措施A.1抽樣和制樣過程抽樣和制樣工具，應(yīng)清洗干凈，121℃,15～20min滅菌，一套清潔工具限于一個樣品使用。存放樣品的容器應(yīng)該經(jīng)過清洗、滅菌，或為一次性滅菌容器。A.2檢測過程A.2.1PCR實驗室應(yīng)分為樣品制備區(qū)、前PCR區(qū)、PCR區(qū)、后PCR區(qū)。將模板提取、PCR反應(yīng)液配制、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行。實驗室的運作應(yīng)從“凈區(qū)”到“臟區(qū)”單方向進(jìn)行。A.2.2實驗過程中，應(yīng)穿實驗服和戴手套，手套要經(jīng)常更換。各區(qū)要有專用實驗服，經(jīng)常清洗。A.2.3各區(qū)所有的試劑、器材(尤其是移液器)、儀器都應(yīng)專用，不得帶出該區(qū)。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃,15～20min滅菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每種溶液應(yīng)使用高質(zhì)量的成分和新蒸餾的雙蒸水。在20～25℃貯存的試劑中，可加0.025%的疊氮鈉。所有試劑應(yīng)該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。A.2