分光光度分析法

2024年12月1日第12章分光光度法12.1概述

12.1.1定義分光光度法是基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法，包括比色法、可見(jiàn)及紫外分光光度法及紅外光譜法等。本章重點(diǎn)討論可見(jiàn)光區(qū)的分光光度法。2024年12月1日12.1.2分光光度法的特點(diǎn)a靈敏度高。常用于測(cè)定試樣中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%~10-5的微量組分,甚至可測(cè)定低至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-6~10-8的痕量組分。b準(zhǔn)確度較高。目視比色法的相對(duì)誤差為5%~10%,分光光度法為2%~5%。c應(yīng)用廣泛。幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物都可以直接或間接地用目視比色法或分光光度法進(jìn)行測(cè)定。d儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、快速。2024年12月1日12.1.3溶液的顏色與光吸收的關(guān)系

光是一種電磁波。根據(jù)波長(zhǎng)或頻率排列,得到如表的電磁波譜表。2024年12月1日相關(guān)概念*吸收光譜:原子吸收光譜和分子吸收光譜。是因物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。*單色光:具同一波長(zhǎng)的光。*復(fù)合光:由不同波長(zhǎng)組成的光。*波段:各種色光的波長(zhǎng)范圍不同。2024年12月1日*互補(bǔ)色光:按一定比例混合，得到白光。*物質(zhì)的顏色是因物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。2024年12月1日*吸收光譜曲線或光吸收曲線:以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。*最大吸收波長(zhǎng):光吸收程度最大充處的波長(zhǎng)，用λmax表示。*吸光度A(也稱消光度E或光密度D):溶液對(duì)光的吸收程度。2024年12月1日在可見(jiàn)光,KMnO4溶液對(duì)波長(zhǎng)525nm附近綠色光的吸收最強(qiáng),而對(duì)紫色和紅色的吸收很弱。λmax=525nm。濃度不同時(shí),光吸收曲線形狀相同,λmax不變,吸光度不同。2024年12月1日12.2光吸收基本定律12.2.1朗伯-比爾定律當(dāng)一束平行單色光通過(guò)任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質(zhì)時(shí),一部分被吸收,一部分透過(guò)介質(zhì),一部分被器皿的表面反射。如圖所示,設(shè)入射光強(qiáng)度為I0,吸收光強(qiáng)度為Ia,透過(guò)光強(qiáng)度為It,反射光強(qiáng)度為Ir。2024年12月1日在分光光度分析法中,試液和空白溶液分別置于同樣質(zhì)料及厚度的吸收池中,然后讓強(qiáng)度為I0的單色光分別通過(guò)這兩個(gè)吸收池,再測(cè)量其透過(guò)光的強(qiáng)度。此時(shí)反射光強(qiáng)度基本上是不變的,且其影響可以相互抵消。透光度或透光率透過(guò)光強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度Io之比稱為透光度或透光率,用T表示溶液的透光度愈大,表示它對(duì)光的吸收愈小;相反,透光度愈小,表示它對(duì)光的吸收愈大。2024年12月1日朗伯(LambertJH)和比爾(BeerA)分別于1760和1852年研究了光的吸收與溶液層的厚度及溶液濃度的定量關(guān)系，二者結(jié)合稱為朗伯-比爾定律，也稱為光的吸收定律。當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的平行單色光垂直照射到長(zhǎng)度為b的液層、濃度為c的溶液時(shí)，由于溶液中吸光質(zhì)點(diǎn)(分子或離子)的吸收，通過(guò)溶液后光的強(qiáng)度減弱為I:定量分析的理論基礎(chǔ)。2024年12月1日比例常數(shù)K與吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長(zhǎng)及溫度等因素有關(guān)。含有多種吸光物質(zhì)的溶液，如果各吸光物質(zhì)對(duì)某一波長(zhǎng)的單色光均有吸收作用，且各吸光物質(zhì)的吸光質(zhì)點(diǎn)之間相互不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，則:這一規(guī)律稱吸光度的加和性。2024年12月1日*摩爾吸收系數(shù)當(dāng)濃度c用mol·L-1,液層厚度b用cm為單位表示,則K用另一符號(hào)ε來(lái)表示。ε稱為摩爾吸收系數(shù),單位為L(zhǎng)·mol-l·cm-1,它表示物質(zhì)的量濃度為lmol·L-1,液層厚度為lcm時(shí)溶液的吸光度。12.2.2摩爾吸收系數(shù)和桑德?tīng)栰`敏度2024年12月1日例濃度為25.5μg/50mL的Cu2+溶液,用雙環(huán)已酮草酰二腙光度法測(cè)定,在波長(zhǎng)600nm處用2cm比色皿測(cè)量A=0.297,計(jì)算摩爾吸光系數(shù)。解:2024年12月1日*桑德?tīng)?Sandell)靈敏度(靈敏度指數(shù))S指當(dāng)儀器的檢測(cè)極限A=0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)出來(lái)的吸光物質(zhì)的最低含量，其單位為μg·cm-2，S與ε及吸光物質(zhì)摩爾質(zhì)量M的關(guān)系為:桑德?tīng)栰`敏度越小,表示顯色反應(yīng)越靈敏。2024年12月1日12.3光度分析的方法和儀器12.3.1目視比色法用眼睛觀察、從管口垂直向下觀察（比色管）,比較待測(cè)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的深淺,以確定物質(zhì)含量的方法。優(yōu)點(diǎn)是儀器簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,適宜于大批試樣的分析。靈敏度高,因?yàn)槭窃趶?fù)合光-白光下進(jìn)行測(cè)定,故某些顯色反應(yīng)不符合朗伯-比爾定律時(shí),仍可用該法進(jìn)行測(cè)定。主要缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度不高,標(biāo)準(zhǔn)系列不能久存,需要在測(cè)定時(shí)臨時(shí)配制。2024年12月1日12.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線法借助分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)被測(cè)試液的吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得被測(cè)物質(zhì)的濃度或含量。12345樣品標(biāo)液C1C2C3C4C5CXAA1A2A3A4A5AX特點(diǎn):入射光是純度較高的單色光，故使偏離朗伯-比爾定律的情況大為減少，標(biāo)準(zhǔn)曲線直線部分的范圍更大，分析結(jié)果的準(zhǔn)確度較高。AλCXAX2024年12月1日12.3.3比較法:在一定條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在λmax下測(cè)A標(biāo)準(zhǔn)溶液As=εCsL被測(cè)溶液Ax=εCxLCx=CsAx/As注意:Cs與Cx大致相當(dāng)2024年12月1日1為選好的測(cè)定波長(zhǎng)，一般為待測(cè)物質(zhì)的max2為選好的參比波長(zhǎng)，一般為待測(cè)物質(zhì)的min測(cè)得的是樣品在兩種波長(zhǎng)1和2處的吸光度之差A(yù)，A為扣除了背景吸收的吸光度A=A1-A2=（ε1-ε2）CL優(yōu)點(diǎn):（1）大大提高了測(cè)定準(zhǔn)確度，可完全扣除背景（2）可用于微量組分的測(cè)定（3）可用于混濁液和多組分混合物的定量測(cè)定12.3.4扣除法2024年12月1日EFAλλ1測(cè)λ2

參ab12.3.5多組分定量方法由于吸光度具有加合性,因此可以在同一試樣中測(cè)定多個(gè)組份。設(shè)X,Y組份在波長(zhǎng)1和2處的摩爾吸光系數(shù)可由已知濃度的X,Y純?nèi)芤簻y(cè)得。解上述方程組可求得cx及cy。2024年12月1日12.3.6分光光度計(jì)及其基本部件分光光度計(jì)的基本部件:光源、單色器、樣品池（比色皿）、檢測(cè)器和顯示裝置。光源單色器樣品池檢測(cè)器顯示裝置2024年12月1日*光源光源的作用是提供輻射--連續(xù)復(fù)合光可見(jiàn)光區(qū)鎢燈320-2500nm優(yōu)點(diǎn):發(fā)射強(qiáng)度大、使用壽命長(zhǎng)紫外光區(qū)氫燈或氘燈180-375nm氘燈的發(fā)射強(qiáng)度比氫燈大4倍玻璃對(duì)這一波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收，必須用石英光窗。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)同時(shí)具有可見(jiàn)和紫外兩種光源。2024年12月1日*單色器

單色器的作用是將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。分為棱鏡和光柵。

*比色皿也稱吸收池或樣品池。用于盛放試液的容器。它是由無(wú)色透明、耐腐蝕、化學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的玻璃或石英制成,按其厚度分為0.5cm,lcm,2cm,3cm和5cm。使用比色皿時(shí)應(yīng)注意保持清潔、透明,避免磨損透光面。紫外光只能用石英比色皿；可見(jiàn)光可用石英或玻璃比色皿。2024年12月1日*檢測(cè)器接受從比色皿發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。分為光電管和光電倍增管。*顯示裝置

作用是把放大的信號(hào)以吸光度A或透射比T的光度分析法的設(shè)計(jì)方式顯示或記錄下來(lái)。分光光度計(jì)常用的顯示裝置是檢流計(jì)、微安表、數(shù)字顯示記錄儀。2024年12月1日12.4顯色反應(yīng)和顯色條件12.4.1顯色反應(yīng)待測(cè)物質(zhì)本身有較深的顏色,直接測(cè)定；待測(cè)物質(zhì)是無(wú)色或很淺的顏色,需要選適當(dāng)?shù)脑噭┡c被測(cè)離子反應(yīng)生成有色化合物再進(jìn)行測(cè)定,此反應(yīng)稱為顯色反應(yīng),所用的試劑稱為顯色劑。按顯色反應(yīng)的類(lèi)型來(lái)分,主要有氧化還原反應(yīng)和絡(luò)合反應(yīng)兩大類(lèi),而絡(luò)合反應(yīng)是最主要的。2024年12月1日（1）顯色反應(yīng)的選擇A選擇性好,干擾少,或干擾容易消除;靈敏度高,有色物質(zhì)的ε應(yīng)大于104。B有色化合物的組成恒定,符合一定的化學(xué)式。C有色化合物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,至少保證在測(cè)量過(guò)程中溶液的吸光度基本恒定。這就要求有色化合物不容易受外界環(huán)境條件的影響。D有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大,即顯色劑對(duì)光的吸收與絡(luò)合物的吸收有明顯區(qū)別,要求兩者的吸收峰波長(zhǎng)之差Δλ(稱為對(duì)比度)大于60nm。2024年12月1日（2）顯色劑無(wú)機(jī)顯色劑不多,因?yàn)樯傻慕j(luò)合物不穩(wěn)定,靈敏度和選擇性也不高。如用KSCN顯色測(cè)鐵、鉬、鎢和鈮；用鉬酸銨顯色測(cè)硅、磷和釩;用H2O2顯色測(cè)鈦等(Ti4+能與過(guò)氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生橙黃色)。2024年12月1日A磺基水楊酸OO型螯合劑,可與很多高價(jià)金屬離子生成穩(wěn)定的螯合物,主要用于測(cè)Fe3+。B丁二酮肟NN型螯合顯色劑,用于測(cè)定Ni2+。C1,10-鄰二氮菲NN型螯合顯色劑,測(cè)微量Fe2+。D二苯硫腙含S顯色劑,萃取光度測(cè)定Cu2+,Pb2+,Zn2+,Cd2+,Hg2+等。E偶氮胂Ⅲ(鈾試劑Ⅲ)偶氮類(lèi)螯合劑,強(qiáng)酸性溶液中測(cè)Th(Ⅳ),Zr(Ⅳ),U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中測(cè)稀土金屬離子。F鉻天青S三苯甲烷類(lèi)顯色劑,測(cè)定Al3+。G結(jié)晶紫三苯甲烷類(lèi)堿性染料,測(cè)定Tl3+。有機(jī)顯色劑2024年12月1日實(shí)驗(yàn)條件包括:溶液酸度，顯色劑用量，試劑加入順序，顯色時(shí)間，顯色溫度，有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。12.4.2顯色條件的選擇（1）溶液的酸度

M+HR＝MR+H+*影響顯色劑的平衡濃度和顏色*影響被測(cè)金屬離子的存在狀態(tài)*影響絡(luò)合物的組成

*pH與吸光度關(guān)系曲線確定pH范圍。2024年12月1日（2）顯色劑的用量M(被測(cè)組分)+R(顯色劑)＝MR(有色絡(luò)合物)為使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全,需加入過(guò)量的顯色劑。但顯色劑不是越多越好。有些顯色反應(yīng),顯色劑加人太多,反而會(huì)引起副反應(yīng),對(duì)測(cè)定不利。在實(shí)際工作中根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定顯色劑的用量。2024年12月1日（3）顯色反應(yīng)時(shí)間有些顯色反應(yīng)瞬間完成,溶液顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持不變;有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成,但有色絡(luò)合物的顏色很快開(kāi)始褪色;有些顯色反應(yīng)進(jìn)行緩慢,溶液顏色需經(jīng)一段時(shí)間后才穩(wěn)定。制作吸光度-時(shí)間曲線確定適宜時(shí)間。（4）顯色反應(yīng)溫度顯色反應(yīng)大多在室溫下進(jìn)行。但是,有些顯色反應(yīng)必需加熱至一定溫度完成。2024年12月1日（5）溶劑有機(jī)溶劑降低有色化合物的解離度,提高顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮顏色加深。溶劑還可能提高顯色反應(yīng)的速率,影響有色絡(luò)合物的溶解度和組成等。2024年12月1日（6）干擾及其消除方法試樣中存在干擾物質(zhì)會(huì)影響被測(cè)組分的測(cè)定:例如干擾物質(zhì)本身有顏色或與顯色劑反應(yīng)，在測(cè)量條件下也有吸收，造成正干擾。干擾物質(zhì)與被測(cè)組分反應(yīng)或與顯色劑反應(yīng)，使顯色反應(yīng)不完全，也會(huì)造成干擾。干擾物質(zhì)在測(cè)量條件下從溶液中析出，便溶液變混濁，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定溶液的吸光度。為消除以上原因引起的干擾，可采取以下幾種方法。2024年12月1日a.控制溶液酸度b.加入掩蔽劑選取的條件是掩蔽劑不與待測(cè)離子作用,掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成的絡(luò)合物的顏色應(yīng)不干擾待測(cè)離子的測(cè)定；c.利用氧化還原反應(yīng),改變干擾離子的價(jià)態(tài)；d.利用校正系數(shù)；e.用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾；f.選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)；g.當(dāng)溶液中存在有消耗顯色劑的干擾離子時(shí),可通過(guò)增加顯色劑的用量來(lái)消除干擾；h.分離以上方法均不奏效時(shí),采用預(yù)先分離的方法。2024年12月1日在分光光度分析中,儀器測(cè)量不準(zhǔn)確也是誤差的主要來(lái)源。任何光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差。這些誤差可能來(lái)源于光源不穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)條件偶然變動(dòng),讀數(shù)不準(zhǔn)確等。在光度計(jì)中,透射比的標(biāo)尺刻度均勻。吸光度標(biāo)尺刻度不均勻。對(duì)于同一儀器,讀數(shù)的波動(dòng)對(duì)透射比為一定值；而對(duì)吸光度讀數(shù)波動(dòng)則不再為定值。吸光度越大,讀數(shù)波動(dòng)所引起的吸光度誤差也越大。12.5儀器測(cè)量測(cè)量誤差和測(cè)量條件12.5.1儀器測(cè)量誤差2024年12月1日透光率很小或很大時(shí),濃度測(cè)量誤差都較大。當(dāng)△T=0.01，作圖或?qū)ι鲜皆偾髮?dǎo)，可求得:當(dāng)A=0.434(或透光率T=36.8%)時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小。一般情況下使待測(cè)溶液的透光率T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，來(lái)保證測(cè)量的相對(duì)誤差較小。

將此式對(duì)T微分:兩邊同除以A，得:2024年12月1日（1）測(cè)量波長(zhǎng)的選擇為了使測(cè)定結(jié)果有較高的靈敏度,應(yīng)選擇被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)的光作為入射光,這稱為“最大吸收原則”。選用這種波長(zhǎng)的光進(jìn)行分析,不僅靈敏度高,且能減少或消除由非單色光引起的對(duì)朗伯-比爾定律的偏離。但是,在最大吸收波長(zhǎng)處有其他吸光物質(zhì)干擾測(cè)定時(shí),則可選另一靈敏度稍低,但能避免干擾的入射光波長(zhǎng)。12.5.2測(cè)量條件的選擇2024年12月1日例丁二酮肟光度法測(cè)鋼中鎳,絡(luò)合物丁二酮肟鎳的最大吸收波長(zhǎng)為470nm,但試樣中的鐵用酒石酸鈉掩蔽后,在470nm處也有一定吸收,干擾鎳的測(cè)定。為避免鐵的干擾,可以選擇波長(zhǎng)520nm進(jìn)行測(cè)定,雖然測(cè)鎳的靈敏度有所降低,但酒石酸鐵不干擾鎳的測(cè)定。2024年12月1日（2）吸光度范圍的選擇從儀器測(cè)量誤差的角度來(lái)看,為使測(cè)量結(jié)果得到較高準(zhǔn)確度,一般控制標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測(cè)試液的吸光度在0.2~0.8范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)控制溶液的濃度或選擇不同厚度的吸收池來(lái)達(dá)到目的。(3)參比溶液的選擇利用參比溶液來(lái)調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn),可消除由吸收池壁及溶劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來(lái)的誤差,扣除干擾的影響。2024年12月1日參比溶液選擇:a試液及顯色劑均無(wú)色，蒸餾水作參比溶液；b顯色劑為無(wú)色，被測(cè)試液中存在其他有色離子，用不加顯色劑的被測(cè)試液作參比溶液；c顯色劑有顏色，被測(cè)試液無(wú)色，可選擇不加試樣溶液的試劑空白作參比溶液。d顯色劑和試液均有顏色，可加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測(cè)組分掩蔽起來(lái)，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其他試劑均按試液測(cè)定方法加入，以此作為參比溶液，這樣就可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。2024年12月1日(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

有時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過(guò)原點(diǎn)可能是由于參比溶液選擇不當(dāng),吸收池厚度不等,吸收池位置不妥,吸收池透光面不清潔等原因所引起的。若有色絡(luò)合物的解離度較大,特別是當(dāng)溶液中還有其他絡(luò)合劑時(shí),常便被測(cè)物質(zhì)在低濃度時(shí)顯色不完全。找出原因,盡量加以避免。2024年12月1日12.5.3對(duì)朗伯-比爾定律的偏離在分光光度分析中,經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈直線的情況,特別是當(dāng)吸光物質(zhì)濃度較高時(shí),明顯地看到通過(guò)原點(diǎn)向濃度軸彎曲的現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進(jìn)行定量,將會(huì)引起較大的誤差。

偏離朗伯－比爾定律的原因主要是儀器或溶液的實(shí)際條件與朗伯-比爾定律所要求的理想條件不一致。2024年12月1日（1）非單色光引起的偏離*朗伯-比爾定律只適用于單色光,但由于單色器色散能力的限制和出口狹縫需要保持一定的寬度,所以目前各種分光光度計(jì)得到的入射光實(shí)際上都是具有某一波段的復(fù)合光。由于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度的不同,因而導(dǎo)致對(duì)朗伯－比爾定律的偏離。較平坦不平坦2024年12月1日*克服非單色光引起的偏離的措施◎使用比較好的單色器,從而獲得純度較高的“單色光”,使標(biāo)準(zhǔn)曲線有較寬的線性范圍。◎入射光波長(zhǎng)選擇在被測(cè)物質(zhì)的最大吸收處,保證測(cè)定有較高的靈敏度,此處的吸收曲線較為平坦,在此最大吸收波長(zhǎng)附近各波長(zhǎng)的光的ε值大體相等,由于非單色光引起的偏離要比在其他波長(zhǎng)處小得多。◎測(cè)定時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶?使吸光度讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。2024年12月1日（2）介質(zhì)不均勻引起的偏離朗伯－比爾定律要求吸光物質(zhì)的溶液是均勻的。如果被測(cè)溶液不均勻,是膠體溶液、乳濁液或懸浮液時(shí),入射光通過(guò)溶液后,除一部分被試液吸收外,還有一部分因散射現(xiàn)象而損失,使透射比減少,因而實(shí)測(cè)吸光度增加,便標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向吸光度軸彎曲。故在光度法中應(yīng)避免溶液產(chǎn)生膠體或混濁。2024年12月1日（3）由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離溶液中的吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而改變其濃度,因而導(dǎo)致偏離朗伯—比爾定律。2024年12月1日12.6分光光光度法的應(yīng)用絡(luò)合物組成的測(cè)定固定一種組分(通常是金屬離子M)的濃度,改變絡(luò)合劑(R)的濃度,得到一系列[R]/[M]比值不同的溶液,并配制相應(yīng)的試劑空白作參比液,分別測(cè)定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo),[R]/[M]為橫坐標(biāo)作圖