4-UV-VIS吸光光度法解析

UV-VIS吸光光度法

ABSORPTIONPHOTOMETRYSunbowofLNPU

吸光光度法（AbsorptionPhotometry）是一種基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的一種分析方法。包括可見吸光光度法、紫外-可見吸光光度法和紅外光譜法等。吸光光度法同滴定分析法、重量分析法相比，有以下一些特點：(一)靈敏度高吸光光度法測定物質(zhì)的濃度下限(最低濃度)一般可達1-10-3%的微量組分。對固體試樣一般可測到10-4%。如果對被測組分事先加以富集，靈敏度還可以提高1-2個數(shù)量級。(二)準確度較高一般吸光光度法的相對誤差為2-5%，其準確度雖不如滴定分析法及重量法，但對微量成分來說，還是比較滿意的，因為在這種情況下，滴定分析法和重量法也不夠準確了，甚至無法進行測定。

(三)操作簡便，測定速度快

(四)應用廣泛幾乎所有的無機離子和有機化合物都可直接或間接地用吸光光度法進行測定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析?？梢娢展庾V：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。物質(zhì)對光的選擇性吸收一、光的基本性質(zhì)光是電磁波。其波長、頻率與速度之間的關(guān)系為：E=hν=hc/λh為普朗克常數(shù)，其值為6.63×10-34J·s二、物質(zhì)對光的選擇性吸收如果我們把具有不同顏色的各種物體放置在黑暗處，則什么顏色也看不到?？梢娢镔|(zhì)呈現(xiàn)的顏色與光有著密切的關(guān)系，一種物質(zhì)呈現(xiàn)何種顏色，是與光的組成和物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)的。（一）

物質(zhì)對光產(chǎn)生選擇性吸收和原因（二）

物質(zhì)的顏色與吸收光的關(guān)系從光本身來說、有些波長的光線，作用于眼睛引起了顏色的感覺，我們把人眼所能看見有顏色的光叫做可見光，其波長范圍大約在400-760nm之間。實驗證明：白光(日光、白熾電燈光、日光燈光等)是由各種不同顏色的光按一定的強度比例混合而成的。如果讓一束白光通過三棱鏡，就分解為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫七種顏色的光，這種現(xiàn)象稱為光的色散。每種顏色的光具有一定的波長范圍。我們把白光叫做復合光；把只具有一種顏色的光，叫做單色光。

實驗還證明，不僅七種單色光可以混合成白光，如果把適當顏色的兩種單色光按一定的強度比例混合，也可以成為白光。這兩種單色光就叫做互補色。如綠光和紫光互補，藍光和黃光互補，等等。對固體物質(zhì)來說，當白光照射到物質(zhì)上時，物質(zhì)對于不同波長的光線吸收、透過、反射、折射的程度不同而使物質(zhì)呈現(xiàn)出不同的顏色。如果物質(zhì)對各種波長的光完全吸收，則呈現(xiàn)黑色；如果完全反射，則呈現(xiàn)白色；如果對各種波長的光吸收程度差不多，則呈現(xiàn)灰色；如果物質(zhì)選擇性地吸收某些波長的光，那么，這種物質(zhì)的顏色就由它所反射或透過光的顏色來決定。二、紫外可見吸收光譜1．光的基本性質(zhì)

光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長

、頻率

、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來描述：

=c；波數(shù)=1/

=

/c

光是由光子流組成，光子的能量：

E=h=hc/

（Planck常數(shù)：h=6.626×10-34J×S)光的波長越短（頻率越高），其能量越大。白光(太陽光)：由各種單色光組成的復合光

單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)

可見光區(qū)：400-750nm

紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm遠紫外區(qū)10-200nm（真空紫外區(qū)）

2.物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線M+熱M+熒光或磷光

E=E2-

E1=h

量子化；選擇性吸收;分子結(jié)構(gòu)的復雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；用不同波長的單色光照射，測吸光度—吸收曲線與最大吸收波長

max；M+

h

M*光的互補：藍

黃基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E2吸收曲線的討論：（1）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。（動畫）（3）③吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。3.紫外—可見分子吸收光譜與電子躍遷物質(zhì)分子內(nèi)部三種運動形式：（1）電子相對于原子核的運動（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動分子具有三種不同能級：電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應的能量分子的內(nèi)能：電子能量Ee、振動能量Ev

、轉(zhuǎn)動能量Er即E＝Ee+Ev+Er

ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

能級躍遷

紫外-可見光譜屬于電子躍遷光譜。

電子能級間躍遷的同時總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。生色基團對紫外吸收光譜的影響共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的分子。如膽甾酮（a）與異亞丙基丙酮（b）分子結(jié)構(gòu)差異很大，但兩者具有相似的紫外吸收峰。兩分子中相同的O=C-C=C共軛結(jié)構(gòu)是產(chǎn)生紫外吸收的關(guān)鍵基團。紫外-可見光區(qū)一般用波長（nm）表示。其研究對象大多在200-380nm的近紫外光區(qū)和/或380-780nm的可見光區(qū)有吸收。紫外-可見吸收測定的靈敏度取決于產(chǎn)生光吸收分子的摩爾吸光系數(shù)。該法儀器設(shè)備簡單,應用十分廣泛。如醫(yī)院的常規(guī)化驗中，95%的定量分析都用紫外-可見分光光度法。在化學研究中，如平衡常數(shù)的測定、求算主-客體結(jié)合常數(shù)等都離不開紫外-可見吸收光譜。討論：（1）轉(zhuǎn)動能級間的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠紅外區(qū)。遠紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜；（2）振動能級的能量差ΔEv約為：0.05～１eV，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；（3）電子能級的能量差ΔEe較大1～20eV。電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在紫外—可見光區(qū)，紫外—可見光譜或分子的電子光譜.討論：（4）吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內(nèi)部能級分布狀況，是物質(zhì)定性的依據(jù)。（5）吸收譜帶強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關(guān)，也提供分子結(jié)構(gòu)的信息。通常將在最大吸收波長處測得的摩爾吸光系數(shù)εmax也作為定性的依據(jù)。不同物質(zhì)的λmax有時可能相同，但εmax不一定相同；（6）吸收譜帶強度與該物質(zhì)分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。三、分子吸收光譜與電子躍遷1．紫外—可見吸收光譜

有機化合物的紫外—可見吸收光譜，是其分子中外層價電子躍遷的結(jié)果（三種）：σ電子、π電子、n電子。分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序為：n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊

⑴Σ→Σ＊躍遷

所需能量最大，σ電子只有吸收遠紫外光的能量才能發(fā)生躍遷。飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠紫外區(qū)(吸收波長λ<200nm，只能被真空紫外分光光度計檢測到)。如甲烷的λ為125nm,乙烷λmax為135nm。

⑵n→σ＊躍遷所需能量較大。吸收波長為150～250nm，大部分在遠紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察到。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*躍遷的λ分別為173nm、183nm和227nm。

⑶Π→Π＊躍遷所需能量較小，吸收波長處于遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)，摩爾吸光系數(shù)εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，屬于強吸收。不飽和烴、共軛烯烴和芳香烴類均可發(fā)生該類躍遷。如：乙烯π→π*躍遷的λ為162nm，εmax為:1×104L·mol-1·cm－1。

⑷n→π＊躍遷需能量最低，吸收波長λ>200nm。這類躍遷在躍遷選律上屬于禁阻躍遷，摩爾吸光系數(shù)一般為10～100L·mol-1·cm-1，吸收譜帶強度較弱。分子中孤對電子和π鍵同時存在時發(fā)生n→π＊

躍遷。丙酮n→π＊躍遷的λ為275nmεmax為22L·mol-1·cm-1（溶劑環(huán)己烷)。生色團與助色團生色團：最有用的紫外—可見光譜是由π→π＊和n→π＊躍遷產(chǎn)生的。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。這類含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C三N等。助色團：有一些含有n電子的基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當它們與生色團相連時，就會發(fā)生n—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。紅移與藍移

有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLλmax和吸收強度發(fā)生變化:

λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。吸收強度即摩爾吸光系數(shù)ε增大或減小的現(xiàn)象分別稱為增色效應或減色效應，如圖所示。2.金屬配合物的紫外—可見吸收光譜

金屬離子與配位體反應生成配合物的顏色一般不同于游離金屬離子(水合離子)和配位體本身的顏色。金屬配合物的生色機理主要有三種類型：⑴配位體微擾的金屬離子d一d電子躍遷和ｆ一ｆ電子躍遷

摩爾吸收系數(shù)ε很小，對定量分析意義不大。⑵金屬離子微擾的配位體內(nèi)電子躍遷

金屬離子的微擾，將引起配位體吸收波長和強度的變化。變化與成鍵性質(zhì)有關(guān)，若靜電引力結(jié)合，變化一般很小。若共價鍵和配位鍵結(jié)合，則變化非常明顯。⑶電荷轉(zhuǎn)移吸收光譜在分光光度法中具有重要意義。電荷轉(zhuǎn)移吸收光譜

當吸收紫外可見輻射后，分子中原定域在金屬M軌道上電荷的轉(zhuǎn)移到配位體L的軌道，或按相反方向轉(zhuǎn)移，這種躍遷稱為電荷轉(zhuǎn)移躍遷，所產(chǎn)生的吸收光譜稱為荷移光譜。電荷轉(zhuǎn)移躍遷本質(zhì)上屬于分子內(nèi)氧化還原反應，因此呈現(xiàn)荷移光譜的必要條件是構(gòu)成分子的二組分，一個為電子給予體，另一個應為電子接受體。電荷轉(zhuǎn)移躍遷在躍遷選律上屬于允許躍遷，其摩爾吸光系數(shù)一般都較大(104左右)，適宜于微量金屬的檢出和測定。電荷轉(zhuǎn)移躍遷在紫外區(qū)或可見光呈現(xiàn)荷移光譜，荷移光譜的最大吸收波長及吸收強度與電荷轉(zhuǎn)移的難易程度有關(guān)。

例：Fe3＋與SCN－形成血紅色配合物，在490nm處有強吸收峰。其實質(zhì)是發(fā)生了如下反應：

[Fe3＋SCN－

]

＋hν=[FeSCN]2＋

四、光的吸收定律

1.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A∝b

（動畫1）（動畫2）

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，其數(shù)學表達式為：

朗伯—比耳定律數(shù)學表達式

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數(shù)，單位L·g－１·cm－１

a與ε的關(guān)系為：

a=ε/M（M為摩爾質(zhì)量）透光度(透光率)T透過度T:描述入射光透過溶液的程度:

T=It/I0吸光度A與透光度T的關(guān)系:

A＝－lgT

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。應用于各種光度法的吸收測量；

摩爾吸光系數(shù)ε在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；吸光系數(shù)a(L·g-1·cm-1）相當于濃度為1g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。2.摩爾吸光系數(shù)Ε的討論

（1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；

（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；（3）可作為定性鑒定的參數(shù)；

（4）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達到的最大靈敏度。

摩爾吸光系數(shù)Ε的討論（5）εmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。ε>105：超高靈敏；

ε=(6～10）×104：高靈敏；

ε<2×104：不靈敏。（6）ε在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。3.偏離朗伯—比耳定律的原因

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學性因素。（1）物理性因素難以獲得真正的純單色光。朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

非單色光作為入射光引起的偏離

假設(shè)由波長為λ1和λ2的兩單色光組成的入射光通過濃度為c的溶液，則：

A

1＝lg（Ｉo1/Ｉt1）＝ε1bc

A

2＝lg(Ｉo2/Ｉt2）＝ε2bc故：式中：Ｉo1、Ｉo2分別為λ1、λ2的入射光強度；

Ｉt1、Ｉt2分別為λ1、λ2的透射光強度；

ε1、ε2分別為λ1、λ2的摩爾吸光系數(shù)；因?qū)嶋H上只能測總吸光度A總，并不能分別測得A1和A2，故

A總＝lg（Ｉo總/Ｉt總)＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉt1+Ｉt2）

＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉo110-ε1bc

+Ｉo210-ε2bc

）令：ε1-ε2＝

；設(shè)：Ｉo1＝Ｉo2A總＝lg(2Io1)/Ｉt1(1＋10-

εbc

）

＝

A1+lg2-lg(1＋10-

εbc

)

討論:

因?qū)嶋H上只能測總吸光度A總，并不能分別測得A1和A2，故：討論:

A總=A1+lg2-lg(1＋10－

εbc

)

(1)

=0；即：

1=

2=

則：

A總

＝lg（Ｉo/Ｉt）＝

bc(2)

≠0

若

<0；即

2<

1；－

bc>0,

lg(1＋10

bc)值隨c值增大而增大，則標準曲線偏離直線向c軸彎曲，即負偏離；反之，則向A軸彎曲，即正偏離。討論:

A總=A1+LG2-LG(1＋10－

ΕBC

)

(3)｜

｜很小時，即ε1≈ε2：

可近似認為是單色光。在低濃度范圍內(nèi)，不發(fā)生偏離。若濃度較高，即使｜

｜很小，A總

≠Ａ1，且隨著c值增大，

A總

與A1的差異愈大，在圖上則表現(xiàn)為A—c曲線上部(高濃度區(qū))彎曲愈嚴重。故朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。(4)為克服非單色光引起的偏離，首先應選擇比較好的單色器。此外還應將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。(2)化學性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當溶液濃度c>10－2mol/L時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。

故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學平衡時。使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。

例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時溶液pH對測定有重要影響。儀器可見分光光度計儀器紫外-可見分光光度計一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。（動畫）

2.單色器

將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理二、分光光度計的類型1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復雜，價格較高。3.雙波長將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。△

=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數(shù)光譜。吸光光度法分析條件的選擇一、顯色反應及其條件的選擇（一）顯色反應和顯色劑

1.顯色反應在分光光度分析中，將試樣中被測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應叫顯色反應。顯色反應可分兩大類，即絡(luò)合反應和氧化還原反應，而絡(luò)合反應是最主要的顯色反應。與被測組分化合成有色物質(zhì)的試劑稱為顯色劑。同一組分?？膳c若干種顯色劑反應，生成若干有色化合物，其原理和靈敏度亦有差別。一種被測組分究競應該用哪種顯色反應，可根據(jù)所需標準加以選擇。選擇顯色反應的一般標準:(1)選擇性要好。一種顯色劑最好只與一種被測組分起顯色反應，這樣干擾就少?；蛘吒蓴_離子容易被消除、或者顯色劑與被測組分和干擾離子生成的有色化合物的吸收峰相隔較遠。

(2)靈敏度要高。由于吸光光度法一般是測定微量組分的，靈敏度高的顯色反應有利于微量組分酌測定。靈敏度的高低可從摩爾吸光系數(shù)值的大小來判斷，κ值大靈敏度高，否則靈敏度低。但應注意，靈敏度高的顯色反應，并不一定選擇性就好，對于高含量的組分不一定要選用靈敏度高的顯色反應。(3)對比度要大。即如果顯色劑有顏色，則有色化合物與顯色劑的最大吸收波長的差別要大，一般要求在60nm以上。

(4)有色化合物的組成要恒定,化學性質(zhì)要穩(wěn)定。有色化合物的組成若不確定，測定的再現(xiàn)性就較差。有色化合物若易受空氣的氧化、日光的照射而分解，就會引入測量誤差。

(5)顯色反應的條件要易于控制。如果條件要求過于嚴格，難以控制，測定結(jié)果的再現(xiàn)性就差。2.顯色劑(1)無機顯色劑許多無機試劑能與金屬離子起顯色反應，如Cu2+與氨水形成深藍色的絡(luò)離子Cu(NH4)42+，SCN-與Fe3+形成紅色的絡(luò)合物Fe(SCN)2+或Fe(SCN)63-等。但是多數(shù)無機顯色劑的靈敏度和選擇性都不高，其中性能較好，目前還有實用價值的有硫氰酸鹽、鉬酸銨、氨水和過氧化氫等。(2)有機顯色劑許多有機試劑，在一定條件下，能與金屬離子生成有色的金屬螯合物(具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物)。

將金屬螯合物應用于光度分析中的優(yōu)點是：

1．大部分金屬螯合物都呈現(xiàn)鮮明的顏色，摩爾吸光系數(shù)大于104，因而測定的靈敏度很高；

2．金屬螯合物都很穩(wěn)定，一般離解常數(shù)都很小，而且能抗輻射；

3．專用性強，絕大多數(shù)有機整合劑，在一定條件下，只與少數(shù)或其一種金屬離子絡(luò)合，而且同一種有機螯合劑與不同的金屬離子絡(luò)合時，生成具有特征顏色的螯合物4．雖然大部分金屬螯合物難溶于水，但可被萃取到有機溶劑中，大大發(fā)展了萃取光度法。

5．在顯色分子中，金屬所占的比率很低，提高了測定的靈敏度。因此，有機顯色劑是光度分析中應用最多最廣的顯色劑，尋找高選擇性、高靈敏度的有機顯色劑，是光度分析發(fā)展和研究的重要內(nèi)容。

在有機化合物分子中，凡是包含有共軛雙鍵的基團如—N＝N—、—N＝O、—NO2、對醌基、＝C＝O(羰基)、＝C＝S(硫羰基)等，一般都具有顏色，原因是這些基團中的л電子被光激發(fā)時，只需要較小的能量，能吸收波長大于200nm的光，因此，稱這些基團為生色團；某些含有未共用電子對的基團如胺基—NH2，RHN—，R2N—(具有一對未共用電子對)，羥基-OH(具有兩對末共用電子對)，以及鹵代基—F，—Cl，—Br，—I等，它們與生色基團上的不飽和鍵互相作用，引起永久性的電荷移動，從而減小了分子的活化能促使試劑對光的最大吸收“紅移”

(向長波方向移動)，使試劑顏色加深，這些基團稱為助色團。

含有生色基團的有機化合物常常能與許多全屬離子化合生成性質(zhì)穩(wěn)定且具有特征顏色的化合物，且靈敏度和選擇性都很高，這就為用光度法測定這些離子提供了很好的條件。有機顯色劑的種類很多，下面僅將應用較廣泛的幾種介紹如下：

1.鄰二氮菲2.雙硫腙

3.二甲酚橙4.偶氮胂III5．鉻天青S（二）顯色反應條件的選擇顯色反應能否完全滿足光度法的要求，除了與顯色劑的性質(zhì)有主要關(guān)系外，控制好顯色反應的條件也是十分重要的，如果顯色條件不合適，將會影響分析結(jié)果的準確度。1.顯色劑的用量顯色就是將被測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，表示：

M+R=MR(被測組分)(顯色劑)(有色化合物)

反應在一定程度上是可逆的。為了減少反應的可逆性，根據(jù)同離子效應，加入過量的顯色劑是必要的，但也不能過量太多，否則會引起副反應，對測定反而不利。2.溶液的酸度溶液酸度對顯色反應的影響很大，這是由于溶液的酸度直接影響著金屬離子和顯色劑的存在形式以及有色絡(luò)合物的組成和穩(wěn)定性。因此，控制溶液適宜的酸度，是保證光度分析獲得良好結(jié)果的重要條件之一。

(1)酸度對被測物質(zhì)存在狀態(tài)的影響大部分高價金屬離子都容易水解，當溶液的酸度降低時，會產(chǎn)生一系列羥基絡(luò)離子或多核羥基絡(luò)離子。高價金屬離子的水解象多元弱酸的電離一樣，是分級進行的。隨著水解的進行，同時還發(fā)生各種類型的聚合反應。聚合度隨著時間增大，而最終將導致沉淀的生成。顯然，金屬離子的水解，對于顯色反應的進行是不利的，故溶液的酸度不能太低。(2)酸度對顯色劑濃度和顏色的影響光度分析中所用的大部分顯色劑都是有機弱酸。顯色反應進行時，首先是有機弱酸發(fā)生離解，其次才是絡(luò)陰離子與金屬離子絡(luò)合。

M+HR＝MR+H+

從反應式可以看出，溶液的酸度影響著顯色劑的離解,并影響著顯色反應的完全程度。當然，溶液酸度對顯色劑離解程度影響的大小，也與顯色劑的離解常數(shù)有關(guān)，Ka大時，允許的酸度可大；Ka很小時，允許的酸度就要小些。

許多顯色劑本身就是酸堿指示劑，當溶液酸度改變時，顯色劑本身就有顏色變化。如果顯色劑在某一酸度時，絡(luò)合反應和指示劑反應同時發(fā)生，兩種顏色同時存在，就無法進行光度測定。例如、二甲酚橙在溶液的pH＞6.3時呈紅色，在pH＜6.3時呈檸檬黃色，在pH＝6.3時，呈中間色，故pH＝6.3時,是它的變色點。而二甲酚橙與金屬離子的絡(luò)合物卻呈現(xiàn)紅色。因此，二甲酚橙只有在pH＜6的酸性溶液中可作為金屬離子的顯色劑。如果在pH＞6的酸度下進行光度測定，就會引入很大誤差。

(3)對絡(luò)合物組成和顏色的影響對于某些逐級形成絡(luò)合物的顯色反應、在不同的酸度時，生成不同絡(luò)合比的絡(luò)合物。例如鐵與水楊酸的絡(luò)合反應，當

pH＜4[Fe3+(C7H4O3)2-]+

紫色

4＜pH＜9[Fe3+(C7H4O3)22-]-

紅色

pH＞9[Fe3+(C7H4O3)32-]3-

黃色在這種情況下，必須控制合適的酸度，才可獲得好的分析結(jié)果。

3.時間和溫度顯色反應的速度有快有慢。顯色反應速度，幾乎是瞬間即可完成，顯色很快達到穩(wěn)定狀態(tài)，并且能保持較長時間。大多數(shù)顯色反應速度較慢，需要一定時間，溶液的顏色才能達到穩(wěn)定程度。有些有色化合物放置一段時間后，由于空氣的氧化，試劑的分解或揮發(fā)，光的照射等原因，使顏色減退。適宜的顯色時間和有色溶液穩(wěn)定程度，也必須通過實驗來確定。實驗方法是配制一份顯色溶液，從加入顯色劑計算時間、每隔幾分鐘測定一次吸光度，繪制A-t曲線，根據(jù)曲線來確定適宜的時間。

不同的顯色反應需要不同的溫度，一般顯色反應可在室溫下完成。但是有些顯色反應需要加熱至一定的溫度才能完成；也有些有色絡(luò)合物在較高溫度下容易分解。因此，應根據(jù)不同的情況選擇適當?shù)臏囟冗M行顯色。溫度對光的吸收及顏色的深淺也有一定的影響，故標樣和試樣的顯色溫度應保持一樣。合適顯色溫度也必須通過實驗確定,做A-C曲線即可求出。

4.有機溶劑和表面活性劑溶劑對顯色反應的影響表現(xiàn)在下列幾方面。（1）溶劑影響絡(luò)合物的離解度許多有色化合物在水中的離解度大，而在有機溶劑中的離解度小，如在Fe(SCN)3溶液中加入可與水混溶的有機試劑(如丙酮)，由于降低了Fe(SCN)3的離解度而使顏色加深提高了測定的靈酸度。（2）溶劑改變絡(luò)合物顏色的原因可能是各種溶劑分子的極性不同、介電常數(shù)不同，從而影響到絡(luò)合物的穩(wěn)定性，改變了絡(luò)合物分子內(nèi)部的狀態(tài)或者形成不同的溶劑化物的結(jié)果。（3）溶劑影響顯色反應的速度例如，當用氯代磺酚S測定Nb時，在水溶液中顯色需幾小時，如果加入丙酮后,僅需30分鐘。表面活性劑的加入可以提高顯色反應的靈敏度，增加有色化合物的穩(wěn)定性。其作用原理一方面是膠束增溶，另一方面是可形成含有表面活性劑的多元絡(luò)合物。

5.共存離子的干擾及消除共存離子存在時對光度測定的影響有以下幾種類型：

(1)與試劑生成有色絡(luò)合物。如用硅鉬藍光度法測定鋼中硅時，磷也能與鉬酸銨生成絡(luò)合物，同時被還原為鉬藍，使結(jié)果偏高。

(2)干擾離子本身有顏色。如Co2+(紅色)、Cr3+(綠色)、Cu2+(藍色)。

(3)與試劑結(jié)合成無色絡(luò)合物消耗大量試劑而使被測離子絡(luò)合不完全。如用水揚酸測Fe3+時，Al3+、Cu2+等有影響。

(4)與被測離子結(jié)合成離解度小的另一化合物。如由于F-的存在，能與Fe3+以FeF63-形式存在，F(xiàn)e(SCN)3本不會生成，因而無法進行測定。

消除干擾的方法主要有以下三種：（1）控制酸度控制顯色溶液的酸度，是消除干擾的簡便而重要的方法。許多顯色劑是有機弱酸，控制溶液的酸度，就可以控制顯色劑R的濃度，這樣就可以使某種金屬離子顯色，使另外一些金屬離子不能生成有色絡(luò)合物。當溶液的情況比較復雜，或各種常數(shù)值不知道隊則溶液最適合的pH值須通過實驗方法來確定。（2）加入掩蔽劑在顯色溶液里加一種能與干擾離子反應生成無色絡(luò)合物的試劑，也是消除干擾的有效而常用的方法。例如用硫氰酸鹽作顯色劑測定Co2+,Fe3+有干優(yōu)可加入氟化物，使Fe3+與F-結(jié)合生成無色而穩(wěn)定的FeF63-，就可以消除干擾。在另外的情況下，也可通過氧化—還原反應，改變干擾離子的價態(tài)以消除于擾。（3）采用萃取光度法用適當?shù)挠袡C溶劑萃取有色組分,如用丁二酮肟測定鈀時,鈀與丁二酮肟所形成的內(nèi)絡(luò)鹽,可被氯仿從酸性溶液中選擇性地萃取。許多干擾離子則不被萃取。（4）在不同波長下測定兩種顯色配合物的吸光度,對它們進行同時測定。（5）尋找新的顯色反應如將二元配合物改變?yōu)槿浜衔?。?）分離干擾離子在沒有適當掩蔽劑時，干擾離于可用電解法，淀法或離子交換法等分離除去。此外，還可以通過選擇適當?shù)臏y量條件，消除干擾離子的影響。二、吸光光度法的測量誤差及測量條件的選擇

光度分析法的誤差來源有兩方面，一方面是各種化學因素所引入的誤差，另一方面是儀器精度不夠，測量不準所引入的誤差。（一）儀器測量誤差任何光度計都有一定的測量誤差。儀器測量誤差主要是指光源的發(fā)光強度不穩(wěn)定，光電效應的非線性，電位計的非線性、雜散光的影響、濾光片或單色器的質(zhì)量差(譜帶過寬)，比色皿的透光率不一致，透光率與吸光度的標尺不準等因素。對給定的光度計來說，透光率或吸光度的讀數(shù)的準確度是儀器精度的主要指標之一，也是衡量測定結(jié)果準確度的重要因素。

光度計主要儀器測量誤差是表頭透射比的讀數(shù)誤差。光度計的讀數(shù)標尺上透射比T的刻度是均勻的，故透射比的讀數(shù)誤差ΔT（絕對誤差）與T本身的大小無關(guān)，對于一臺給定儀器它基本上是常數(shù)，一般大0.002-0.01之間，僅與儀器身身的精度有關(guān)。（二）測量條件的選擇選擇適當?shù)臏y量條件，是獲得準確測定結(jié)果的重要途徑。擇適合的測量條件，可從下列幾個方面考慮。

1.測量波長的選擇由于有色物質(zhì)對光有選擇性吸收，為了使測定結(jié)果有較高的靈鍍度和準確度，必須選擇溶液最大吸收波長的入射光。如果有干擾時，則選用靈敏度較低但能避兔干擾的入射光，就能獲得滿意的測定結(jié)果。2.吸光度范圍的控制吸光度在0.15-0.80時，測量的準確度較高。為此可以從下列幾方面想辦法：（1）計算而且控制試樣的稱出量，含量高時，少取樣，或稀釋試液；含量低時，可多取樣，或萃取富集。（2）如果溶液已顯色，則可通過改變比色皿的厚度來調(diào)節(jié)吸光度大小。

3.參比溶液的選擇參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀器工作零點的，若參比溶液選得不適當，則對測量讀數(shù)準確度的影響較大。選擇的辦法是：（1）當試液、試劑、顯色劑均無色時，可用蒸餾水作參比液。（2）試劑和顯色劑均無色時，而樣品溶液中其他離子有色時，應采用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。（3）試劑和顯色劑均有顏色時，可將一份試液加入適當掩蔽劑，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，然后把顯色劑、試劑均按操作手續(xù)加入，以此做參比溶液，這樣可以消除一些共存組分的干擾。

此外，對于比色皿的厚度、透光率、儀器波長，讀數(shù)刻度等應進行校正，對比色皿放置位置、光電池的靈敏度等也應注意檢查。第五節(jié)吸光光度法的應用

吸光光度法除了廣泛地用于測定微量成分外，也能用于常量組分及多組分的測定。同時，還可以用于研究化學平衡、絡(luò)合物組成的測定等。下面簡要地介紹有關(guān)這些方面的應用。一、定量分析（一）單組分的測定1.一般方法

A-c標準曲線法2.示差法當被測組分含量高時，常常偏離朗伯-比耳定律。即使不偏離，由于吸光度太大，也超出了準確讀數(shù)的范圍，就是把分析誤差控制在5%以下，對高含量成分也是不符合要求的。如果采用示差法，就能克服這一缺點，也能使測定誤差降到±0.5％以下。示差法與普通光度法的主要區(qū)別在于它采用的參比溶液不同，它不是以c=0的試劑空白作參比，而是以一個濃度比試液cx稍小的標準溶液cs作參比，然后再測定試液的吸光度。

As=-lgTs=κbcsAx=-lgTx=κbcx

實際測得吸光度Af為

Af=Ax-A