脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷時核因子-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及鹽酸氨溴索的作用

脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷時核因子－ＫＢ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及鹽酸氨溴索的作用目的探討脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷(acutelunginjury，ALl)時核因子kB(NF-kB)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及鹽酸氨溴索(AMB)對其的作用。方法雄性sD大鼠108只，實驗分為兩部分：第一部分選擇其中90只，采用隨機(jī)排列表法分為6組(n=15)：A組無菌生理鹽水(Ns)0.5ml腹腔注射1h后，再腹腔注射Ns0.5ml；B組腹腔注射AMB10m／kg1h后腹腔注射NS0.5ml；c組腹腔注射Ns0.5ml1h后腹腔注射LPS5mg／kg；D、E、F組分別腹腔注射AMB5、10、20mg／kg后1h腹腔注射LPS5mg／kg。各組分別按1、2、4h再分為3個亞組，每組5只。采用酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)測定肺泡灌洗液(BALF)中腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-1β(IL-1β)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白－2(MIP-2)水平，并測定BALF中乳酸脫氫酶(LDH)與總蛋白量的變化。采用蛋白印跡法(Westernblot)測定肺組織細(xì)胞胞核中NF-kBp65、胞漿中NF-kB抑制蛋白-α(IxBα)及c－Jun氨基末端激酶(JNK)的表達(dá)。第二部分選擇18只大鼠按上述分組法隨機(jī)分為6組(n=3)，A、B、c、D、E、F組，給藥方法同第一部分，腹腔注射Ns(A組、B組)或腹腔注射LPS(c、D、E、F組)后4h觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果第一部分：與A組比較，c、D、E、F組BALF中LDH、總蛋白量、TNF-α、IL-1β和MIP-2均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)；與c組比較，E、F組上述指標(biāo)均降低(p＜0.05或P＜0.01)。與A組比較，c、D、E、F組肺組織細(xì)胞中的NF-kBp65與JNK表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，而IKBα的表達(dá)量減少(P＜0.01)；與c組比較，E、F組NF-tcBI65與磷酸化JNK的表達(dá)減少(P＜0.05或P＜0.01)，而IxBα的表達(dá)量增多(P＜0.05)或P＜0.01)。第二部分：A、B組肺組織形態(tài)學(xué)正常，c組呈明顯的肺損傷病理形態(tài)學(xué)改變，D組肺損傷程度與c組相似，E、F組肺損傷程度較c組減輕。結(jié)論AMB可以減輕LPS誘導(dǎo)大鼠ALl，其機(jī)制可能與抑制肺組織細(xì)胞NF-kBp65與JNK的活化，并促進(jìn)IxBα的表達(dá)，以及下調(diào)TNF-a、IL1β和MIP-2的表達(dá)有關(guān)，且呈劑量依賴性。標(biāo)簽：急性肺損傷；脂多糖；核因子-KB；c-Jun氨基末端激酶；鹽酸氨溴索急性肺損傷(ALI)是一種常見的臨床危重綜合癥，嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷及休克等因素均可導(dǎo)致其發(fā)生。其臨床表現(xiàn)主要為急性起病、嚴(yán)重的低氧血癥，以及胸部x線示彌漫性滲出等，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生和釋放是導(dǎo)致ALI發(fā)生的重要機(jī)制。核因子-kB(NF-kB)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)眾多炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，而抑制NF-kB的激活可阻止炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。筆者研究了脂多糖(lipopolysaccaride，LPS)誘導(dǎo)的大鼠ALl時NF-kBp65亞基(NF-nBp65)、NF-xB抑制蛋白(IxBα)與e-Jun氨基末端激酶(JNK)的表達(dá)，炎癥介質(zhì)(TNF-a、IL-1、MIP-2)等的變化以及鹽酸氨溴索(AMB)對其的作用。1材料與方法1.1實驗動物與分組108只清潔級雄性sD大鼠，體重196～273g，平均237g，12～14周齡(浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)。實驗前禁食12h，不禁水。實驗分為第一、第二部分。第一部分選擇其中90只大鼠，采用隨機(jī)排列表法分為6組(n=15)：A組無菌生理鹽水(Ns)0.5ml腹腔注射1h后，再腹腔注射Ns0.5ml；B組腹腔注射AMB10mg／kg后1h腹腔注射NSO.5ml；C組腹腔注射Ns0.5ml1h后腹腔注射LPS5mg／kg；D、E、F組分別腹腔注射AMB5、10、20mg／kg1h后腹腔注射LPS5mg／kg。各組分別按1、2、4h再分為3個亞組，每組5只。第二部分選擇其中18只大鼠隨機(jī)分為6組(n=3)，A、B、c、D、E、F組，給藥方法同上，但不作肺泡灌洗，作病理形態(tài)學(xué)觀察。1.2動物模型動物以硫噴妥鈉30mg／kg腹腔注射麻醉。(1)腹腔注射Ns(A、B組)或腹腔注射LPS(c、D、E、F組)后1、2、4h大鼠腹腔注射加倍劑量的硫噴妥鈉處死。行氣管切開術(shù)，插入自制14G血管留置導(dǎo)管，深度約1cm，縫線結(jié)扎固定以防BALF溢出。經(jīng)導(dǎo)管緩慢注入無菌冰Ns8m1，并回抽，反復(fù)5次后將動物置于頭低足高位，回收BALF，回收率均>70％。BALF在4℃時以2000r／min離心10min，取上清液于－80qC保存。(2)動物經(jīng)胸骨正中切開，取出肺臟，置液態(tài)氮罐內(nèi)，于－80℃保存。1.3藥品及試劑內(nèi)毒素(LPS，Escherichiacoli055：B5，L2880，Sigma公司，美國)，抗鼠TNF-α、IL-1β和MIP-2的ELISA試劑盒(LIFEKEYBioMeditech公司，美國)，抗兔NF-kBp65、IxBα與磷酸化JNK單抗(SantaCruz公司，美國)，鹽酸氨溴索(AMB，批號325741，BoehingerIngelheim公司，德國)，二抗(上海華美生物工程公司)。1.4肺組織核蛋白與胞漿液的提取參照Derykere等的方法改進(jìn)：將冷凍肺組織與液氮一道碾磨；放入組織勻漿器，加入5ml細(xì)胞裂解液(0.6％NP-40，150mmol／LNaCl，10mmol／LHEPESpH7.9，1mmol／LEDTA，0.5mmol／LPMSF)，用碾棒碾磨，并移至4m1試管中，以2000r／rain離心30s以去除未碎組織；上清液于冰中孵育5rain，隨后5000r／min離心5rain(取沉淀)；核團(tuán)重懸于100μ1胞核裂解液(25％glycerol，10mmol／LHEPESpH7.9.420mmol／LNaCl1.2mmol／LMgCb．0.2mmol／LEDTA，0.5mmol／LDTr，0.5mmol／LPMSF，5μg／mlpepstatin，5μg／m1leupeptin，5μg／mlaprotinin)中，震蕩15s，于冰中孵育30rain；溶解的核移至微離心試管中，14000r／min離心2min，使細(xì)胞碎片聚集成團(tuán)；上清液含DNA結(jié)合蛋白，液氮速凍，-80℃下保存?zhèn)溆谩?.5肺組織病理腹腔注射Ns(A、B組)或LPS(C、D、E、F組)后4h處死動物，取肺臟浸泡于10％福爾馬林溶液中，分離肺葉，矢狀切開，石蠟包埋，制成μm厚切片，HE染色。1.6檢測方法與指標(biāo)1.6.1酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)以ELISA測定BALF中腫瘤壞死因子．－a(TNF-a)、白介素．1J3(IL－1p)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白－2(MIP-2)濃度，操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。1.6.2蛋白印跡法(Westernblot)以Westernblot檢測肺組織細(xì)胞NF-xBp65、IxBa與磷酸化JNK的表達(dá)，操作均參照抗體說明書進(jìn)行，并重復(fù)3次。以凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)測定目標(biāo)帶灰度值。1.6.3光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSSl3.0統(tǒng)計軟件包處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1BALF中LDH、總蛋白含量的比較在相同時間點A組與B組之間LDH差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與A組比較，C、D、E、F組均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)；與c組比較，E、F組上述三指標(biāo)均降低(p＜0.05或p＜0.01)。c、D、E、F組LDH在2h時達(dá)到高峰，而總蛋白量隨時間的增加而逐漸升高，在4h時達(dá)到峰值。2.2BALF中TNF-a、IL-1B、MIP-2的比較在相同時間點A組與B組之間TNF-a差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)；與A組比較，C、D、E、F組均明顯升高(P＜0.01)；與c組比較，E、F組上述三指標(biāo)均降低(p＜0.05或P＜0.01)。c、D、E、F組IL-1β和MIP-2均隨時間的增加而逐漸升高，在4h時達(dá)到峰值，TNF-a達(dá)到峰值的時間為2h。2.3肺組織細(xì)胞NF-KBp65、IKBa、JNK表達(dá)量的比較與A組比較，C、D、E、F組NF-kBp65、JNK表達(dá)明顯增多(p＜0.01)，其峰值時間均為2h.2.4病理形態(tài)學(xué)的比較A組與B組肺泡腔清晰，結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔均勻一致，壁光滑，可見少量白細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)無滲出液；C組肺組織毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張、充血，白細(xì)胞附壁，肺泡隔明顯增厚，大量白細(xì)胞滲出、聚集，肺泡腔中可見滲出液和漏出聚集的紅細(xì)胞，大片肺泡腔萎陷不張；D組肺組織損傷程度與C組相似；E組肺泡隔增厚，部分肺泡萎陷不張，白細(xì)胞滲出及聚集較C組減少；F組肺泡結(jié)構(gòu)尚可，肺泡隔增厚、肺泡腔萎陷及白細(xì)胞滲出等與c、D組比較明顯減輕。3討論目前，ALI的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，其死亡率依然居高不下。許多肺內(nèi)和肺外疾病均可導(dǎo)致ALI的發(fā)生，其中嚴(yán)重感染是常見的致病因素。ALl主要的病理生理改變?yōu)榉蚊?xì)血管通透性增加、彌漫性滲出、透明膜形成、廣泛性的微小肺不張，以及后期形成的肺間質(zhì)纖維化等。目前，認(rèn)為炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生和釋放，以及中性粒細(xì)胞的激活是導(dǎo)致ALI發(fā)生的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示大鼠腹腔內(nèi)注射LPS5mg／kg后4h出現(xiàn)明顯的肺損傷病理形態(tài)學(xué)改變，在BALF中的LDH和總蛋白量，以及TNF-a、IL-1β與MIP-2也明顯升高。表明成功建立了ALl模型，與su等報道相符。LDH與總蛋白量的升高反映肺毛細(xì)血管的通透性JNK在A、B組均未見表達(dá)，而IxBα的表達(dá)明顯減少(P＜0.01)；與C組比較，E、F組NF-kBp65、JNK表達(dá)明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)，而IxBα的表達(dá)明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)。增加，而TNF-a、IL-1j3與MIP-2的大量產(chǎn)生和釋放表明肺的炎癥反應(yīng)加重。NF-tcB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)眾多炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，而其中許多炎癥介質(zhì)與ALI的發(fā)病有關(guān)。NF-kB最常見的形式是由多肽鏈p50和p65兩個亞基所構(gòu)成的異二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF-kB與IxB結(jié)合而滯留在胞漿內(nèi)，IxB可掩蔽其核定位信號(nuclearlocationsignal，NIS)，并阻止其進(jìn)入到細(xì)胞核。當(dāng)細(xì)胞暴露于激活信號，如LPS、IL-1β與TNF-α等結(jié)合到細(xì)胞表面受體后，IxBα激酶(IfcBkinase，IKK)被激活，使IteB蛋白在32S和36S位上被磷酸化并泛素化，而降解于蛋白酶小體中。在與IxB分離后，NF-kB進(jìn)入到細(xì)胞核，并結(jié)合到靶基因啟動子／增強(qiáng)子區(qū)的特異性片段上以指導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在ALI的發(fā)病過程中起了極為重要的作用。因而，以NF-kB作為靶向治療，通過調(diào)控其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制由NF-kB介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)，以及免疫細(xì)胞抗凋亡作用，可減輕肺臟和其他臟器的損害。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)大鼠ALI時，肺組織細(xì)胞胞核中的NF-kBp65表達(dá)量明顯增加，而胞漿中的IkBα明顯減少。JNK為絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，屬于一種應(yīng)激激活的蛋白激酶。當(dāng)JNK激活后，可選擇性地激活I(lǐng)KK-β，使IxB磷酸化，并最終導(dǎo)致NF-tcB活化。本研究結(jié)果表明，給予LPS后大鼠肺組織細(xì)胞胞漿內(nèi)JNK的表達(dá)量明顯增多。提示JNK作為一種NF-kB的上游激酶參與了ALI的發(fā)病過程。另外，本研究結(jié)果也顯示AMB可通過抑制肺組織細(xì)胞胞漿中的NF-kBp65進(jìn)入胞核，并促進(jìn)胞漿中IxBα的表達(dá)，使BALF中LDH與總蛋白量，以及TNF-α、IL-β與MIP-2等的產(chǎn)生減少，從而抑制肺的炎癥反應(yīng)。由于總蛋白量、IL-1β、MIP-2達(dá)到峰值的時間為4h，而NF-kBp65表達(dá)量在2h時最多，但當(dāng)給予AMB后，NF-kBp65與JNK的表達(dá)量明顯減少，而此時總蛋白量、IL-1β與MIP-2也明顯降低，表明NF-kB與JNK激活后可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，并參與肺的炎癥反應(yīng)。但LDH與TNF-α在2h時達(dá)到峰值，我們認(rèn)為可能存在其他蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有待進(jìn)一步研究。AMB為一種臨床上常用的黏液溶解劑，近年來大劑量的AMB已被應(yīng)用于治療ARDS患者，并取得了一定的療效。至于AMB的作用機(jī)制，有學(xué)者認(rèn)為可能與其促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)的分泌和合成、抗氧化作用、抑制炎癥介質(zhì)的活性，以及降