分子生物學(xué)第六章?lián)p傷與修復(fù)

分子生物學(xué)第六章?lián)p傷與修復(fù)1哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷的發(fā)生頻率234自發(fā)性復(fù)制錯(cuò)誤堿基脫落或部分脫落活性氧族物理因素紫外線電離輻射化學(xué)因素烷化劑堿基類似物修飾劑DNA第一節(jié)DNA損傷的原因及后果病原生物基因的整合5一、DNA分子的自發(fā)性損傷(一)DNA復(fù)制產(chǎn)生誤差大腸桿菌中DNA復(fù)制為例：堿基配對(duì)的錯(cuò)誤率為10-1～10-2復(fù)制后經(jīng)校正系統(tǒng)校正，錯(cuò)配率為10-9左右6（二）DNA的自發(fā)性化學(xué)變化1.堿基的異構(gòu)互變DNA分子中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化(例如酮式-烯醇式或氨基-亞氨基之間的結(jié)構(gòu)互變)，使配對(duì)堿基間的氫鍵改變。7堿基的互變異構(gòu)效應(yīng)堿基T和G能夠以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)堿基C和A能夠以氨基式或亞氨基式兩種互變狀態(tài)出現(xiàn)一般生理?xiàng)l件下，堿基互變平衡反應(yīng)傾向于酮式或氨基式，故AT和CG堿基配對(duì)

…‥8互變異構(gòu)效應(yīng)引起不正常的堿基配對(duì)堿基T以稀有的烯醇式形式，新合成鏈中T對(duì)應(yīng)的不再是A，而是G

堿基C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，則它對(duì)應(yīng)的不是G，而是A9

2.堿基的脫氨基作用堿基的環(huán)外氨基有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，從而胞嘧啶(C)變成尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)變成次黃嘌呤(H)、鳥(niǎo)嘌呤（G）變成黃嘌呤(X)等。復(fù)制時(shí)U與A配對(duì)、H和X都與C配對(duì)就會(huì)導(dǎo)致子代DNA序列的錯(cuò)誤變化。103．脫嘌呤與脫嘧啶即堿基脫落，是指從DNA上丟失了嘌呤或嘧啶，形成無(wú)堿基位點(diǎn)，稱為AP部位（apurine,apyrimidinesite,AP）。11復(fù)制時(shí)可以插入任何核苷酸。脫落堿基后的脫氧核糖3ˊ端的磷酸二酯鍵易被水解，造成DNA鏈斷裂。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中，每天每個(gè)細(xì)胞因N-糖苷鍵自發(fā)水解約丟失10000個(gè)嘌呤堿基和200個(gè)嘧啶堿基。12細(xì)胞在正常生理活動(dòng)中產(chǎn)生的活性氧會(huì)造成DNA損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可引起DNA單鏈斷裂等損傷。每個(gè)哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為五萬(wàn)次。4．堿基修飾與鏈斷裂135.環(huán)出效應(yīng)14二、物理因素引起的DNA損傷(一)紫外線照射引起的DNA損傷當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長(zhǎng)(～260nm)的紫外線照射時(shí)，同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成二聚體，相鄰的兩個(gè)T、或兩個(gè)C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)(cyclobutanering)連成二聚體，其中最容易形成的是T-T二聚體。二聚體導(dǎo)致復(fù)制不能進(jìn)行。

151617皮膚因受紫外線照射而形成二聚體的頻率可達(dá)每小時(shí)5×104／細(xì)胞，紫外線不能穿透皮膚，因此損傷只局限在皮膚中。此外，紫外線照射還能引起DNA鏈斷裂等損傷。18電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應(yīng)，直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷；間接效應(yīng)是指DNA周?chē)渌肿?主要是水分子)吸收射線能量而產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基，進(jìn)而損傷DNA。(二)電離輻射引起的DNA損傷19電離輻射引起DNA損傷的機(jī)理20電離輻射引起DNA損傷的機(jī)制自由基損害損傷DNA修復(fù)系統(tǒng)

MCI假說(shuō)(mobilechargeinteraction)直接與DNA分子鏈發(fā)生作用，作用的靶點(diǎn)是DNA分子中移動(dòng)的電子。21電離輻射引起DNA損傷的類型產(chǎn)生－OH自由基，導(dǎo)致堿基變化

脫氧核糖分解

DNA鏈斷裂

交聯(lián)包括DNA鏈交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)22電離輻射導(dǎo)致DNA鏈的斷裂單鏈斷裂：

雙鏈斷裂：23

三、化學(xué)因素引起的DNA損傷(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物大分子的親核位點(diǎn)起反應(yīng)，使DNA發(fā)生各種類型的損傷。1．堿基烷基化烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上,烷基化的嘌呤堿基配對(duì)會(huì)發(fā)生變化。24鳥(niǎo)嘌呤胞嘧啶O6-乙基鳥(niǎo)嘌呤胸腺嘧啶堿基烷基化25(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷2.堿基脫落

烷化鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上的無(wú)堿基位點(diǎn)，復(fù)制時(shí)可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。26(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷3．?dāng)噫淒NA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷基化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。27(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷4.交聯(lián)烷化劑有兩類，一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個(gè)位點(diǎn)烷基化；另一類是雙功能基烷化劑，如化學(xué)武器氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個(gè)功能基可同時(shí)使兩個(gè)位點(diǎn)烷基化。28(二)堿基類似物、修飾劑對(duì)DNA的損傷

人工合成的堿基類似物如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2-氨基腺嘌呤等，其結(jié)構(gòu)與正常堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常堿基摻入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制。例如5-溴尿嘧啶的結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近。29

5-BrdU（5-BrdU-A；5-BrdU-G）酮式烯醇式堿基類似物、修飾劑對(duì)DNA的改變

亞硝酸鹽能使C脫氨基變成U（C→U）

羥胺能使T脫甲基變成C（T→C）

黃曲霉素B（攻擊堿基）30DNA損傷類型

堿基脫落堿基修飾&去氨基化鏈內(nèi)交聯(lián)

DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)

DNA鏈斷裂

DNA重組31(二)堿基類似物、修飾劑對(duì)DNA的損傷3．脫嘌呤與脫嘧啶DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷基化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。(二)堿基類似物、修飾劑對(duì)DNA的損傷抗癌藥（如順鉑和絲裂霉素）當(dāng)DNA復(fù)制受阻/DNAdamaged核苷酸切除修復(fù)(基因組修復(fù)–人)(二)電離輻射引起的DNA損傷不識(shí)別任何特殊的堿基損失，而是識(shí)別雙螺旋形狀的改變；激活RecA-p的proteinase活性單鏈斷裂：(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷受損堿基移除是由多個(gè)酶來(lái)完成的。復(fù)制后經(jīng)校正系統(tǒng)校正，錯(cuò)配率為10-9左右RecA-P的三種功能四、DNA損傷的后果DNA損傷后分子最終改變，有以下幾種類型：1.點(diǎn)突變(pointmutation)DNA鏈上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤(A與G之間的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)稱為轉(zhuǎn)換(transition)；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換(transvertion)。2.缺失(deletion)DNA鏈上一個(gè)或一段核苷酸消失。323.插入(insertion)指一個(gè)或一段核苷酸插入DNA鏈。4.倒位或轉(zhuǎn)位(transposition)指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。5.DNA斷裂3334突變或誘變對(duì)生物可能產(chǎn)生4種后果：①致死性;②喪失某些功能;③改變基因型(genotype)而不改變表現(xiàn)型(phenotype);④發(fā)生有利于物種生存的結(jié)果,使生物進(jìn)化。

35第二節(jié)DNA修復(fù)DNA的修復(fù)主要類型:錯(cuò)配修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)重組修復(fù)跨損傷修復(fù)(SOS修復(fù))36一、錯(cuò)配修復(fù)在DNA復(fù)制過(guò)程中,DNA聚合酶能夠利用其3ˊ一5ˊ外切核酸酶活性去除錯(cuò)配核苷酸，但是這種校正作用并不十分可靠,某些錯(cuò)配核苷酸可能逃避檢測(cè),出現(xiàn)于新合成的DNA鏈中。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)能夠發(fā)現(xiàn)和修復(fù)這些錯(cuò)配核苷酸。37

1.E.coli錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶)解旋酶Helicase、SSB、外切核酸酶(Ⅰ、Ⅶ、X和RecJ)、DNApolymeraseⅢ、連接酶MCE(mismatchcorrectenzyme)mutL激活內(nèi)切核酸酶mutHmutS掃描新生鏈中錯(cuò)配堿基mutH識(shí)別非甲基化DNA鏈;酶切含錯(cuò)配堿基的DNA區(qū)段錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)組成（Mismatchrepairsystem）38錯(cuò)配修復(fù)

39錯(cuò)配修復(fù)(大腸桿菌)Mis-pairedbases40錯(cuò)配修復(fù)(大腸桿菌)412.真核細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制424344錯(cuò)配修復(fù)(人)45二、直接修復(fù)1.DNA斷裂口直接修復(fù)在DNA5ˊ-P端和3ˊ-OH端未受損傷的情況下，連接酶能夠直接修復(fù)DNA的斷裂口。462.光復(fù)合酶直接修復(fù)二聚體473.直接修復(fù)烷基化堿基O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶。甲基從DNA轉(zhuǎn)移至烷基轉(zhuǎn)移酶上,已經(jīng)甲基化的酶不能再轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆?因此,此種修復(fù)又稱為該酶的自殺性修復(fù)。48

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無(wú)嘌呤位點(diǎn)，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識(shí)別結(jié)合，并在K＋存在下催化游離的嘌呤堿基或脫氧核苷與DNA無(wú)嘌呤部位形成糖苷鍵。且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴(yán)格配對(duì)，使DNA完全恢復(fù)。4．直接插入嘌呤49三、堿基切除修復(fù)（BaseExcisionRepair，BER）指切除和替換由內(nèi)源性化學(xué)物作用產(chǎn)生的DNA堿基損傷,是切除修復(fù)的一種。受損堿基移除是由多個(gè)酶來(lái)完成的。主要針對(duì)DNA單鏈斷裂和小的堿基改變及氧化性損傷。5051三、堿基切除修復(fù)（BaseExcisionRepair，BER）核苷酸切除修復(fù)(基因組修復(fù)–人)另一類是雙功能基烷化劑，如化學(xué)武器氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個(gè)功能基可同時(shí)使兩個(gè)位點(diǎn)烷基化。LexAgeneon一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個(gè)位點(diǎn)烷基化；堿基T和G能夠以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)DNA分子中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化(例如酮式-烯醇式或氨基-亞氨基之間的結(jié)構(gòu)互變)，使配對(duì)堿基間的氫鍵改變。DNA堿基損傷,是切除修復(fù)的一種。(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷倒位或轉(zhuǎn)位(transposition)指DNA鏈重組使其中RecA-P的三種功能亞硝酸鹽能使C脫氨基變成U（C→U）RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性核苷酸切除修復(fù)(轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)-人類)LexAgeneon52堿基切除修復(fù)（人）53四、核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcisionrepair）

體內(nèi)識(shí)別DNA損傷最多的修復(fù)通路。不識(shí)別任何特殊的堿基損失，而是識(shí)別雙螺旋形狀的改變；修復(fù)時(shí)切除含有損傷堿基的那一段DNA。545556核苷酸切除修復(fù)(大腸桿菌)UvrA:識(shí)別損傷部位UvrB:解旋雙鏈紫外線誘導(dǎo)uvrA、uvrB、uvrC和uvrD四種基因表達(dá)57烷化鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上的無(wú)堿基位點(diǎn)，復(fù)制時(shí)可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個(gè)位點(diǎn)烷基化；(二)堿基類似物、修飾劑對(duì)DNA的損傷指切除和替換由內(nèi)源性化學(xué)物作用產(chǎn)生的酮式烯醇式一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。例如5-溴尿嘧啶的結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近。第一節(jié)DNA損傷的原因及后果同源重組：需要多種蛋白參與,在減數(shù)分裂、細(xì)胞有絲分裂后期S/G2期起主要作用。RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷正在復(fù)制的DNA聚合酶可能遇到尚未修復(fù)的DNA損傷，例如胸腺嘧啶二聚體或無(wú)嘌呤位點(diǎn)，復(fù)制體必須設(shè)法跨越損傷進(jìn)行復(fù)制，或者被迫暫停復(fù)制。（無(wú)復(fù)制受阻，無(wú)DNA損傷，無(wú)TTdimer）另一類是雙功能基烷化劑，如化學(xué)武器氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個(gè)功能基可同時(shí)使兩個(gè)位點(diǎn)烷基化?？拱┧帲ㄈ珥樸K和絲裂霉素）UvrC:5ˊ末端內(nèi)切UvrB:

3ˊ末端內(nèi)切58UvrD:解旋酶5960核苷酸切除修復(fù)(基因組修復(fù)–人)61核苷酸切除修復(fù)(轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)-人類)62GGR和TCR的共同修復(fù)通路6364五、重組修復(fù)大腸桿菌重組修復(fù)65五、重組修復(fù)根據(jù)DNA末端連接需要的同源性分為:同源重組：需要多種蛋白參與,在減數(shù)分裂、細(xì)胞有絲分裂后期S/G2期起主要作用。非同源末端連接：DNA分子之間不需要廣泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重組時(shí)對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行連接，在細(xì)胞有絲分裂G1/G0期起主要作用。66同源重組修復(fù)DNA雙鏈斷裂（人）67非同源末端連接修復(fù)DSB68六、SOS修復(fù)

正在復(fù)制的DNA聚合酶可能遇到尚未修復(fù)的DNA損傷，例如胸腺嘧啶二聚體或無(wú)嘌呤位點(diǎn)，復(fù)制體必須設(shè)法跨越損傷進(jìn)行復(fù)制，或者被迫暫停復(fù)制。即使細(xì)胞不能修復(fù)這些損傷，自動(dòng)防故障系統(tǒng)能夠使復(fù)制體繞過(guò)損傷部位，這一機(jī)制就是跨損傷DNA合成。SOS修復(fù)存在于大腸桿菌，不存在于人類。697071RecA-P的三種功能a.

DNA重組活性b.與S.S.DNA結(jié)合活性c.

proteinase活性當(dāng)DNA正常復(fù)制時(shí)（無(wú)復(fù)制受阻，無(wú)DNA損傷，無(wú)TTdimer）

RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性72復(fù)制時(shí)U與A配對(duì)、H和X都與C配對(duì)就會(huì)導(dǎo)致子代DNA序列的錯(cuò)誤變化。一、DNA分子的自發(fā)性損傷插入(insertion)指一個(gè)或一段核苷酸插入DNA鏈。酮式烯醇式(一)烷化劑對(duì)DNA的損傷受損堿基移除是由多個(gè)酶來(lái)完成的。另一類是雙功能基烷化劑，如化學(xué)武器氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸