臨床ELISA的基本原理

臨床ELISA的基本原理一、ELISA的基本原理ELISA是指以酶作為標(biāo)記物、以抗原和抗體之間免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。因此，一個(gè)ELISA測(cè)定試劑，其有機(jī)組成部分包括：（1）包被的抗原或抗體的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或試管；（2）酶標(biāo)記的抗體或抗原和（3）酶的反應(yīng)底物等?？乖蚩贵w的固相化，并不影響其免疫結(jié)合活性，酶標(biāo)記的抗體或抗原亦是如此，并且標(biāo)記酶的活性不因標(biāo)記過(guò)程而喪失。整個(gè)測(cè)定中，抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)果的判斷，以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)，顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光的強(qiáng)度，與臨床標(biāo)本中待測(cè)物的濃度成正比或反比關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來(lái)完成測(cè)定。二、固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué)通常所提到的抗原與抗體的相互作用，一般指的是在液相狀態(tài)下，而在固相狀態(tài)下，抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)有其相應(yīng)的特點(diǎn)，主要表現(xiàn)在以下四個(gè)方面。（一）固相上抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時(shí)間較液相狀態(tài)下長(zhǎng)通常，固相免疫測(cè)定如ELISA中，抗原與抗體結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時(shí)間，較液相免疫測(cè)定要長(zhǎng)，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當(dāng)在微孔板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對(duì)擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴(lài)性，擴(kuò)散性越強(qiáng)，則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。這一點(diǎn)可通過(guò)旋轉(zhuǎn)振蕩來(lái)達(dá)到，微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進(jìn)入到可與抗體或抗原包被的界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。也可在微孔中放一個(gè)惰性的塞子以使反應(yīng)液體成為一個(gè)小體積，或使用一個(gè)具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纖維素，或使用微顆粒來(lái)做到這一點(diǎn)。微顆粒小于1μm時(shí)，在測(cè)定時(shí)即成膠體懸液，而當(dāng)顆粒或珠較大時(shí)，則會(huì)在沒(méi)有振蕩時(shí)，由于重力的作用而分開(kāi)。所有上述方法均是通過(guò)減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測(cè)定的擴(kuò)散依賴(lài)性。（二）固相上抗原與抗體接觸表面的反應(yīng)體積遠(yuǎn)小于液相測(cè)定此處的反應(yīng)體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測(cè)定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測(cè)定，但比反應(yīng)管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應(yīng)發(fā)生于液體-固相界面，可能處于一級(jí)結(jié)合鍵的引力距離內(nèi)，小于100?。液相中待測(cè)抗原或抗體要進(jìn)入到這個(gè)結(jié)合界面，需要經(jīng)過(guò)擴(kuò)散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。微顆粒的反應(yīng)表面區(qū)域較微孔要大得多，因而處于抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應(yīng)體積的比例亦高得多。因此，結(jié)合反應(yīng)的效率更高。這也是全自動(dòng)化免疫測(cè)定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一。可參與結(jié)合反應(yīng)的抗體或抗原的濃度取決于可參與結(jié)合的反應(yīng)體積，無(wú)法精確計(jì)算這種反應(yīng)體積，從而難以使用通常的質(zhì)量作用定律圖形來(lái)計(jì)算Keq。因此，固相上抗原與抗體反應(yīng)的Keq值與液相抗原與抗體反應(yīng)的Keq值沒(méi)有可比性。（三）固相上抗原和抗體間結(jié)合后的離解速率較液相測(cè)定低固相免疫測(cè)定中固相表面上抗原和抗體間的相互作用，類(lèi)似于細(xì)胞表面上蛋白與其受體間的結(jié)合。研究表明，細(xì)胞表面上的蛋白與受體結(jié)合反應(yīng)的離解速率較液相中的要低兩個(gè)梯度，同樣，固相免疫測(cè)定中，固相上抗原和抗體的離解速率亦同樣緩慢，其基本原理相似，概述如下：（1）細(xì)胞表面上蛋白與其受體的相互作用涉及到細(xì)胞表面受體的聚集，由于多價(jià)復(fù)合物離解的減少，相應(yīng)地親合力增加。研究表明，被動(dòng)吸附于固相的抗原和抗體也是成簇或聚集狀的，因此，反應(yīng)界面的抗原或抗體可能也是“成簇的”。（2）大多數(shù)抗原-抗體的離解所需的能量比防止其結(jié)合所需的能量要大，表明在初始結(jié)合鍵形成后，又形成了次級(jí)結(jié)合鍵。這提示在固相免疫測(cè)定和其它細(xì)胞表面反應(yīng)中，形成了大量的次級(jí)結(jié)合鍵。（3）以成簇出現(xiàn)的和來(lái)自于限定的界面反應(yīng)體積內(nèi)的抗體或抗原，常以很高的濃度存在，這種情況下，即使抗原和抗體有離解發(fā)生，離解的抗原的重新結(jié)合也較液相系統(tǒng)更為快速。這可以解釋為何固相免疫測(cè)定與液相測(cè)定相比時(shí)，其抗體的Keq較高。正是這種極緩慢的離解速率，使得ELISA和固相免疫測(cè)定技術(shù)具有很好的適用性，即使是測(cè)定的反復(fù)洗滌步驟，也可使受體配體的相互作用仍保持處于結(jié)合狀態(tài)。微顆粒小于1μm時(shí)，在測(cè)定時(shí)即成膠體懸液，而當(dāng)顆?；蛑檩^大時(shí)，則會(huì)在沒(méi)有振蕩時(shí)，由于重力的作用而分開(kāi)。（2）酶標(biāo)記的抗體或抗原和（3）酶的反應(yīng)底物等。當(dāng)在微孔板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對(duì)擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴(lài)性，擴(kuò)散性越強(qiáng)，則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。（1）先將HBeAb在碳酸鹽緩沖液中2~8℃過(guò)夜包被，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。（1）先用抗小分子的特異抗體如雙抗體夾心法一樣包被固相并封閉。這可以解釋為何固相免疫測(cè)定與液相測(cè)定相比時(shí)，其抗體的Keq較高。微顆粒小于1μm時(shí)，在測(cè)定時(shí)即成膠體懸液，而當(dāng)顆?；蛑檩^大時(shí)，則會(huì)在沒(méi)有振蕩時(shí)，由于重力的作用而分開(kāi)。HBcAb的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定：雙抗原夾心法測(cè)抗體的模式類(lèi)似于雙抗體夾心法測(cè)抗原,其操作步驟亦基本相同，也可采用類(lèi)似于雙抗體夾心法測(cè)抗原模式的“一步法”，如果在急性感染狀態(tài)下，機(jī)體產(chǎn)生抗體IgG的滴度通常不高，不會(huì)出現(xiàn)明顯的“鉤狀效應(yīng)”，但如果為慢性感染，在抗體滴度很高的情況下，也會(huì)存在“鉤狀效應(yīng)”，如抗-HIV和梅毒抗體測(cè)定的“一步法”雙抗原夾心ELISA試劑盒，就可能出現(xiàn)上述“鉤狀效應(yīng)”，造成漏檢。抗原的固相化在HBcAb的測(cè)定，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）直接包被于固相上，而在HBeAb測(cè)定，則先將特異抗e抗原的抗體包被于固相上，在測(cè)定時(shí)，再將e抗原通過(guò)相應(yīng)特異抗體而間接固相化。此時(shí)，待測(cè)抗原就會(huì)與固相上特異抗體結(jié)合而吸附于固相上。在通常的兩步溫育洗滌方法中，抗原抗體反應(yīng)將遵循下述規(guī)律，即在第一步中加入的待測(cè)標(biāo)本中抗原（Ag），當(dāng)其濃度逐步增加時(shí)，將使固相抗體（Ab）與抗原的結(jié)合逐步達(dá)到飽和，這樣當(dāng)隨后加入一定濃度的酶標(biāo)抗體（Ab*）后，a復(fù)合物的形成將直接與在第一步中形成的b復(fù)合物相關(guān)，因此待測(cè)抗原濃度的逐步增加，導(dǎo)致了顯色的逐步加深，當(dāng)抗原濃度增加到一定程度時(shí)，反應(yīng)顯色達(dá)到平臺(tái)，抗原濃度（橫坐標(biāo)）與比色測(cè)定得到的吸光度（縱坐標(biāo)）之間的關(guān)系成S形變化曲線(xiàn)此時(shí)，待測(cè)抗原就會(huì)與固相上特異抗體結(jié)合而吸附于固相上。這樣不但測(cè)定較為繁瑣，而且影響測(cè)定的特異性和靈敏度。RF（IgM類(lèi)）由于其能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動(dòng)物IgG）反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。（四）微孔內(nèi)特異抗體免疫測(cè)定的親和力依賴(lài)性使用固相包被的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定，與液相測(cè)定相比，有明顯的親和力依賴(lài)性，固相受體-配體相互作用的穩(wěn)定性，似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定親和力依賴(lài)性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因?yàn)椋海?）在所吸附于固相的復(fù)雜抗原中，能與液體中特異抗體結(jié)合的抗原濃度極低。這可能是由于所吸附的抗原因?yàn)樽冃曰蚩臻g位阻而致抗原表位喪失的結(jié)果。（2）抗原表位由于固相吸附發(fā)生改變，使得特異抗體與其結(jié)合的親和力較低。當(dāng)抗原以1~5g/ml濃度被動(dòng)吸附于固相時(shí)，大多數(shù)蛋白抗原的60-80%至少會(huì)以一個(gè)單層而穩(wěn)定的吸附于固相，這樣在固相上的總的抗原就不會(huì)缺乏。如果500-800ng抗原穩(wěn)定的吸附于微孔板孔，對(duì)含500g/ml抗體的血清的1：10,000稀釋可提供大于10倍過(guò)量的抗原，考慮到抗原和抗體間相互作用的合理的Keq，只是從吸附抗原的量的有限性，不能解釋固相上抗原與抗體結(jié)合的低親和力，而更可能是由于空間位阻或吸附引起的變性所致的抗原表位的喪失所致。（五）固相的抗體或抗原與液相中的抗體或抗原在構(gòu)型上不一樣固相化的抗體或抗原可能與液相中的抗體或抗原所展示的構(gòu)型不一樣，對(duì)抗體或抗原由于固相化尤其是被動(dòng)吸附或其它吸附方式所致的構(gòu)型改變已有眾多的文獻(xiàn)報(bào)道三、臨床ELISA測(cè)定的常用模式

ELISA依其測(cè)定抗原和抗體的不同，測(cè)定模式有很多，如直接法、間接法、雙抗體夾心法（直接、間接）、競(jìng)爭(zhēng)抑制法（直接、夾心等）、捕獲法等[4]。在臨床實(shí)驗(yàn)室，常用的ELISA測(cè)定模式有雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法和捕獲法等。在抗原的測(cè)定上，蛋白大分子抗原測(cè)定用的最多的模式是雙抗體夾心法，而對(duì)只有單個(gè)抗原表位的小分子，則使用競(jìng)爭(zhēng)抑制法；抗體的測(cè)定通常使用間接法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法和捕獲法等。（一）抗原測(cè)定ELISA模式

1.雙抗體夾心法對(duì)于含多個(gè)抗原表位的大分子蛋白，使用雙抗體夾心ELISA模式測(cè)定相當(dāng)簡(jiǎn)便，現(xiàn)有的測(cè)蛋白抗原的商品試劑盒基本上都采用此種測(cè)定模式。具體測(cè)定方法如下。（1）首先以雙抗體之一于碳酸鹽緩沖液中2~8℃下過(guò)夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。（2）加入含待測(cè)物的臨床樣本如血清（漿）等，溫育（通常為37℃下）一定時(shí)間后，洗板；此時(shí)，待測(cè)抗原就會(huì)與固相上特異抗體結(jié)合而吸附于固相上。（3）加入酶標(biāo)記的雙抗體之二，溫育（通常為37℃下）一定時(shí)間后，洗板；此時(shí)，在固相上即形成雙抗體與特異抗原的夾心產(chǎn)物。

(4)加入酶底物，溫育（通常為37℃下）顯色測(cè)定.

在該測(cè)定模式中，有兩步溫育及板孔洗滌步驟，從而稱(chēng)為“兩步法”，如果將上述測(cè)定步驟（2）和（3）合并為一步，即將待測(cè)樣本和酶標(biāo)抗體在步驟（2）中同時(shí)加入，這樣就只有一步溫育和洗板過(guò)程，即為通常所說(shuō)的“一步法”。最初的雙體抗夾心測(cè)抗原的ELISA試劑盒，均采用“兩步法”。后來(lái)，為了縮短檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，試劑生產(chǎn)廠(chǎng)家逐步推出了“一步法”試劑盒。目前在我們的臨床實(shí)驗(yàn)室中，測(cè)定大分子抗原如HBsAg、甲胎蛋白（α-fetoprotein,αFP）、前列腺特異抗原（PSA）、CA系列標(biāo)志、hCG及激素等，基本上都采用一步法。一步法相比于兩步法，雖然操作簡(jiǎn)單，但有其固有的缺陷，處理不好，雙抗夾心免疫測(cè)定結(jié)果會(huì)因?yàn)殂^狀效應(yīng)（Hookeffect）的存在而出現(xiàn)假陰性或定量偏低的結(jié)果在通常的兩步溫育洗滌方法中，抗原抗體反應(yīng)將遵循下述規(guī)律，即在第一步中加入的待測(cè)標(biāo)本中抗原（Ag），當(dāng)其濃度逐步增加時(shí)，將使固相抗體（Ab）與抗原的結(jié)合逐步達(dá)到飽和，這樣當(dāng)隨后加入一定濃度的酶標(biāo)抗體（Ab*）后，a復(fù)合物的形成將直接與在第一步中形成的b復(fù)合物相關(guān)，因此待測(cè)抗原濃度的逐步增加，導(dǎo)致了顯色的逐步加深，當(dāng)抗原濃度增加到一定程度時(shí)，反應(yīng)顯色達(dá)到平臺(tái)，抗原濃度（橫坐標(biāo)）與比色測(cè)定得到的吸光度（縱坐標(biāo)）之間的關(guān)系成S形變化曲線(xiàn)而一步法雙抗體夾心ELISA的抗原濃度（橫坐標(biāo)）與比色測(cè)定得到的吸光度（縱坐標(biāo)）之間的關(guān)系則為鐘形曲線(xiàn).也就是說(shuō)測(cè)定顯色隨著待測(cè)標(biāo)本中抗原濃度的增加，在一開(kāi)始其也是增加的，而當(dāng)抗原濃度升高至一定程度后，測(cè)定吸光度即開(kāi)始下降，而像一個(gè)倒立的魚(yú)鉤,即所謂的“鉤狀效應(yīng)”（其曲線(xiàn)像一個(gè)倒立的魚(yú)鉤），抗原進(jìn)一步增加，甚至不出現(xiàn)任何顯色,此時(shí)，強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本會(huì)測(cè)定為陰性，也就是我們?cè)诿庖叱恋碓囼?yàn)中所稱(chēng)的“帶現(xiàn)象”（Zonephenomenon）。也可在微孔中放一個(gè)惰性的塞子以使反應(yīng)液體成為一個(gè)小體積，或使用一個(gè)具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纖維素，或使用微顆粒來(lái)做到這一點(diǎn)。正是這種極緩慢的離解速率，使得ELISA和固相免疫測(cè)定技術(shù)具有很好的適用性，即使是測(cè)定的反復(fù)洗滌步驟，也可使受體配體的相互作用仍保持處于結(jié)合狀態(tài)。（一）固相上抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時(shí)間較液相狀態(tài)下長(zhǎng)此時(shí)，待測(cè)抗原就會(huì)與固相上特異抗體結(jié)合而吸附于固相上。此時(shí)，特異抗原就會(huì)與固相上的特異IgM抗體發(fā)生反應(yīng)。（2）加入含待測(cè)物的臨床樣本如血清（漿）等，溫育（通常為37℃下）一定時(shí)間后，洗板；（一）抗原測(cè)定ELISA模式因此，結(jié)合反應(yīng)的效率更高。當(dāng)在微孔板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對(duì)擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴(lài)性，擴(kuò)散性越強(qiáng)，則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。此時(shí)，在固相上即形成固相抗原－待測(cè)抗體－酶標(biāo)二抗復(fù)合物。（3）加入酶底物，溫育，顯色測(cè)定，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的小分子含量成反比抗原的固相化在HBcAb的測(cè)定，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）直接包被于固相上，而在HBeAb測(cè)定，則先將特異抗e抗原的抗體包被于固相上，在測(cè)定時(shí)，再將e抗原通過(guò)相應(yīng)特異抗體而間接固相化。此步中，待測(cè)樣本中的小分子將與酶標(biāo)小分子競(jìng)爭(zhēng)與固相上特異抗體結(jié)合。這一點(diǎn)可通過(guò)旋轉(zhuǎn)振蕩來(lái)達(dá)到，微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進(jìn)入到可與抗體或抗原包被的界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。當(dāng)在微孔板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對(duì)擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴(lài)性，擴(kuò)散性越強(qiáng)，則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。在臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際工作中，有可能遇到“鉤狀效應(yīng)”較嚴(yán)重的HBsAg測(cè)定ELISA試劑盒，基層實(shí)驗(yàn)室同行也有這方面的反映。因此，還應(yīng)該重視“一步法”試劑盒所致的假陰性問(wèn)題，當(dāng)發(fā)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果明顯與臨床不符或與相關(guān)測(cè)定指標(biāo)互有矛盾，如HBeAg陽(yáng)性樣本HBsAg測(cè)定為陰性時(shí)，就應(yīng)考慮HBsAg測(cè)定可能存在的“鉤狀效應(yīng)”所致假陰性問(wèn)題。綜上所述，一步法ELISA試劑盒作為迎合臨床實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)便快速要求的產(chǎn)物，有著巨大的市場(chǎng)，其雖有潛在缺陷，易導(dǎo)致含高濃度待測(cè)物的標(biāo)本檢測(cè)為陰性（假陰性），但精心的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)包被和酶標(biāo)記抗體仔細(xì)選擇，完全可以將“鉤狀效應(yīng)”出現(xiàn)的可能性降至最低。此外，建議生產(chǎn)HBsAg、αFP、前列腺特異抗原（PSA）、CA系列標(biāo)志、hCG及激素等“一步法”免疫測(cè)定試劑盒的廠(chǎng)家，應(yīng)對(duì)所產(chǎn)的試劑在出廠(chǎng)前對(duì)其“鉤狀效應(yīng)”進(jìn)行充分的研究，并提醒用戶(hù)在使用時(shí)應(yīng)注意之處。雙抗體夾心法測(cè)抗原另一個(gè)所需要注意的是類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）和補(bǔ)體等的干擾。我們知道，RF是一種抗變性IgG的自身抗體，主要為19S的IgM類(lèi)，也可見(jiàn)7S的IgG及IgA。這種自身抗體的特性是其是能多種動(dòng)物的變性IgG的Fc部份結(jié)合。因此，如果血清標(biāo)本中含有RF，在雙抗夾心ELISA檢測(cè)時(shí)，其即可作為固相抗體和酶標(biāo)抗體（均為IgG）之間的橋接抗原，而產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。同樣，抗體也有補(bǔ)體C1q的結(jié)合位點(diǎn)，同樣會(huì)造成類(lèi)似于RF的測(cè)定干擾。2.競(jìng)爭(zhēng)法大分子抗原因其具有兩個(gè)以上的抗原表位，而可用雙抗體夾心法測(cè)定，小分子半抗原如地高辛、茶堿等藥物以及T3、T4、睪酮等激素，因其可能只有一個(gè)抗原表位，或因?yàn)榉肿犹?，結(jié)合一個(gè)抗體后，因空間位阻，無(wú)法再結(jié)合另一個(gè)抗體，所以不能使用雙抗體夾心方法測(cè)定，只能采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法。具體步驟如下。（1）先用抗小分子的特異抗體如雙抗體夾心法一樣包被固相并封閉。（2）同時(shí)加入待測(cè)樣本和酶標(biāo)的小分子，溫育一定時(shí)間后，洗板；此步中，待測(cè)樣本中的小分子將與酶標(biāo)小分子競(jìng)爭(zhēng)與固相上特異抗體結(jié)合。（3）加入酶底物，溫育，顯色測(cè)定，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的小分子含量成反比這種測(cè)定模式中，需要得到小分子與酶的結(jié)合物，而小分子酶結(jié)合物，一則在制備上不如抗體酶結(jié)合物簡(jiǎn)便，二則其純化亦頗為困難，結(jié)合有小分子的酶與游離酶之間分子量區(qū)別小，使用一般的分子篩方法難于分離。因此，有人嘗試在合成二或多聚體小分子的基礎(chǔ)上，建立雙抗體夾心競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小分子，測(cè)定的靈敏度和特異性均有所提高（二）抗體測(cè)定模式1.間接法測(cè)定機(jī)體針對(duì)感染性疾病病原體抗原所產(chǎn)生的抗體，在難以得到高純度且特性明確的抗原以前，或抗原較為復(fù)雜的情況下，一般均使用間接法，其基本操作步驟如下。（1）將特異抗原在碳酸鹽緩沖液中2~8℃過(guò)夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。（2）加入含待測(cè)抗體的臨床樣本如血清等，溫育（通常為37℃下）一定時(shí)間后，洗板。此時(shí)，待測(cè)抗體就會(huì)與固相上特異抗原反應(yīng)而吸附于固相上。（3）加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育（通常為37℃下）一定時(shí)間后，洗板；此時(shí)，在固相上即形成固相抗原－待測(cè)抗體－酶標(biāo)二抗復(fù)合物。

(4)加入酶底物，溫育顯色測(cè)定因此，固相上抗原與抗體反應(yīng)的Keq值與液相抗原與抗體反應(yīng)的Keq值沒(méi)有可比性?？乖墓滔嗷贖BcAb的測(cè)定，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）直接包被于固相上，而在HBeAb測(cè)定，則先將特異抗e抗原的抗體包被于固相上，在測(cè)定時(shí)，再將e抗原通過(guò)相應(yīng)特異抗體而間接固相化。使用固相包被的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定，與液相測(cè)定相比，有明顯的親和力依賴(lài)性，固相受體-配體相互作用的穩(wěn)定性，似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定親和力依賴(lài)性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因?yàn)椋海?）在所吸附于固相的復(fù)雜抗原中，能與液體中特異抗體結(jié)合的抗原濃度極低。（一）抗原測(cè)定ELISA模式抗體的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定不同于只有單個(gè)抗原表位的小分子抗原的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定，其測(cè)定的可靠性，在很大程度上，受競(jìng)爭(zhēng)抗體的特異性和親和力大小的影響，競(jìng)爭(zhēng)抗體與待測(cè)抗體在結(jié)合的特異性及親和力越接近一致，則測(cè)定的可靠性越強(qiáng)，但競(jìng)爭(zhēng)用抗體均為相應(yīng)抗原免疫動(dòng)物所得，與機(jī)體感染病毒后所產(chǎn)生的抗體肯定會(huì)有所差異，因而在目前HBeAb和HBcAb的臨床檢測(cè)中，常有難以解釋的測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)，這與其在方法學(xué)上的固有缺陷是分不開(kāi)的。抗原的固相化在HBcAb的測(cè)定，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）直接包被于固相上，而在HBeAb測(cè)定，則先將特異抗e抗原的抗體包被于固相上，在測(cè)定時(shí)，再將e抗原通過(guò)相應(yīng)特異抗體而間接固相化。因此，固相上抗原與抗體反應(yīng)的Keq值與液相抗原與抗體反應(yīng)的Keq值沒(méi)有可比性。以前使用從細(xì)胞培養(yǎng)得到的病毒裂解后，純化得到的抗原，由于抗原較為復(fù)雜，且難于完全除去培養(yǎng)細(xì)胞所含的主要組織相容性抗原，以此種抗原建立的間接法測(cè)定特異抗體，有可能存在較高假陽(yáng)性。微顆粒的反應(yīng)表面區(qū)域較微孔要大得多，因而處于抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應(yīng)體積的比例亦高得多。此步中，酶標(biāo)抗體將與結(jié)合于固相抗體上的特異抗原結(jié)合；（1）將特異抗原在碳酸鹽緩沖液中2~8℃過(guò)夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。使用固相包被的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定，與液相測(cè)定相比，有明顯的親和力依賴(lài)性，固相受體-配體相互作用的穩(wěn)定性，似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定親和力依賴(lài)性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因?yàn)椋海?）在所吸附于固相的復(fù)雜抗原中，能與液體中特異抗體結(jié)合的抗原濃度極低。研究表明，細(xì)胞表面上的蛋白與受體結(jié)合反應(yīng)的離解速率較液相中的要低兩個(gè)梯度，同樣，固相免疫測(cè)定中，固相上抗原和抗體的離解速率亦同樣緩慢，其基本原理相似，概述如下：（1）細(xì)胞表面上蛋白與其受體的相互作用涉及到細(xì)胞表面受體的聚集，由于多價(jià)復(fù)合物離解的減少，相應(yīng)地親合力增加。（一）固相上抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時(shí)間較液相狀態(tài)下長(zhǎng)也就是說(shuō)測(cè)定顯色隨著待測(cè)標(biāo)本中抗原濃度的增加，在一開(kāi)始其也是增加的，而當(dāng)抗原濃度升高至一定程度后，測(cè)定吸光度即開(kāi)始下降，而像一個(gè)倒立的魚(yú)鉤,即所謂的“鉤狀效應(yīng)”（其曲線(xiàn)像一個(gè)倒立的魚(yú)鉤），抗原進(jìn)一步增加，甚至不出現(xiàn)任何顯色,此時(shí)，強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本會(huì)測(cè)定為陰性，也就是我們?cè)诿庖叱恋碓囼?yàn)中所稱(chēng)的“帶現(xiàn)象”（Zonephenomenon）。現(xiàn)在臨床常用的檢驗(yàn)項(xiàng)目丙型肝炎病毒抗體（抗-HCV）的測(cè)定均為間接法模式，以前人免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV）以及梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定也曾使用過(guò)間接法。從上述的測(cè)定模式可見(jiàn)，間接法測(cè)抗體，嚴(yán)格地講，所測(cè)定的僅為抗體的IgG類(lèi)，不涉及IgM和IgA類(lèi)，這是由酶標(biāo)二抗體所決定的。當(dāng)然，如果酶標(biāo)二抗為羊抗人IgM或IgA，則也可以采用間接法測(cè)定特異的IgM和IgA類(lèi)抗體，目前有些特異的IgM類(lèi)抗體檢測(cè)試劑盒即是采用間接法模式。由于e抗原較核心抗原僅多29個(gè)氨基酸，e抗原很容易轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵目乖虼?，HBcAb和HBeAb的測(cè)定均采用競(jìng)爭(zhēng)法?？贵w的測(cè)定通常使用間接法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法和捕獲法等。此時(shí)，在固相上即形成相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物；此時(shí)，待測(cè)抗原就會(huì)與固相上特異抗體結(jié)合而吸附于固相上。（四）微孔內(nèi)特異抗體免疫測(cè)定的親和力依賴(lài)性最初的雙體抗夾心測(cè)抗原的ELISA試劑盒，均采用“兩步法”。（二）固相上抗原與抗體接觸表面的反應(yīng)體積遠(yuǎn)小于液相測(cè)定液相中待測(cè)抗原或抗體要進(jìn)入到這個(gè)結(jié)合界面，需要經(jīng)過(guò)擴(kuò)散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。間接法測(cè)定機(jī)體針對(duì)感染性疾病病原體抗原所產(chǎn)生的抗體，在難以得到高純度且特性明確的抗原以前，或抗原較為復(fù)雜的情況下，一般均使用間接法，其基本操作步驟如下。同樣，抗體也有補(bǔ)體C1q的結(jié)合位點(diǎn)，同樣會(huì)造成類(lèi)似于RF的測(cè)定干擾。但其測(cè)定具體模式有區(qū)別。HBeAb的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定：我們知道，RF是一種抗變性IgG的自身抗體，主要為19S的IgM類(lèi)，也可見(jiàn)7S的IgG及IgA。因此，使用本法測(cè)IgM，必須對(duì)臨床樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。HBeAb之所以要采用此種模式測(cè)定，主要是HBeAg的不穩(wěn)定所致，如在固相直接包被HBeAg，則會(huì)因?yàn)镠BeAg向HBcAg的易轉(zhuǎn)變性，而導(dǎo)致測(cè)定誤差。影響間接法測(cè)定抗體的一個(gè)較大的因素是包被抗原的純度。以前使用從細(xì)胞培養(yǎng)得到的病毒裂解后，純化得到的抗原，由于抗原較為復(fù)雜，且難于完全除去培養(yǎng)細(xì)胞所含的主要組織相容性抗原，以此種抗原建立的間接法測(cè)定特異抗體，有可能存在較高假陽(yáng)性?，F(xiàn)在間接法測(cè)抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原，如HCV的NS3、NS4、NS5，HIV的gp41、gp120和gp160，以及梅毒螺旋體TpN15、TpN17、TpN47等?；蚬こ炭乖诩兓瘯r(shí)，應(yīng)盡量去除用來(lái)表達(dá)的細(xì)菌如大腸桿菌的抗原，以免由于機(jī)體存在對(duì)這種細(xì)菌的抗原的抗體，而引起假陽(yáng)性反應(yīng)。此外，由于機(jī)體的IgG類(lèi)抗體濃度較高，其中絕大部份為機(jī)體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG，因此，為避免這些高濃度非特異IgG對(duì)固相的吸附所致的假陽(yáng)性反應(yīng)，通常需對(duì)待測(cè)樣本作一定程度的稀釋?zhuān)捎谂R床實(shí)際工作中，如有標(biāo)本稀釋步驟，實(shí)驗(yàn)操作者會(huì)覺(jué)得太麻煩，故通常試劑廠(chǎng)家采取在板孔中先加稀釋液，再加入標(biāo)本的稀釋策略。此時(shí)，標(biāo)本的加入量較通常的雙抗原夾心法要少很多，如10μl。在使用間接法測(cè)IgM抗體時(shí)，由于臨床血清樣本中含有高濃度的IgG抗體，其中部分特異IgG抗體將與IgM抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合，從而干擾IgM抗體的檢測(cè)。因此，在使用間接法測(cè)定IgM抗體時(shí)，通常須將血清樣本用抗人IgG抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）預(yù)處理，以去除IgG的干擾。這樣不但測(cè)定較為繁瑣，而且影響測(cè)定的特異性和靈敏度。2.雙抗原夾心法前面提到，間接法測(cè)抗體依所使用的二抗的種類(lèi)，實(shí)際上測(cè)定的可能只有IgG或IgM或IgA類(lèi)。而雙抗原夾心法所測(cè)定的抗體，則包括所有各類(lèi)特異抗體，且不受非特異IgG的干擾，因此，雙抗原夾心法測(cè)抗體的靈敏度和特異性要高于間接法。目前，為提高抗體測(cè)定的靈敏度，國(guó)內(nèi)的間接法ELISA試劑盒，除抗HCV因其抗原較為復(fù)雜外，已基本采用雙抗原夾心法檢測(cè)模式。雙抗原夾心法測(cè)抗體的模式類(lèi)似于雙抗體夾心法測(cè)抗原,其操作步驟亦基本相同，也可采用類(lèi)似于雙抗體夾心法測(cè)抗原模式的“一步法”，如果在急性感染狀態(tài)下，機(jī)體產(chǎn)生抗體IgG的滴度通常不高，不會(huì)出現(xiàn)明顯的“鉤狀效應(yīng)”，但如果為慢性感染，在抗體滴度很高的情況下，也會(huì)存在“鉤狀效應(yīng)”，如抗-HIV和梅毒抗體測(cè)定的“一步法”雙抗原夾心ELISA試劑盒，就可能出現(xiàn)上述“鉤狀效應(yīng)”，造成漏檢。此外，為了保證測(cè)定的靈敏度和特異性，酶標(biāo)用抗原應(yīng)仔細(xì)加以選擇。3.競(jìng)爭(zhēng)法抗體的測(cè)定一般不使用競(jìng)爭(zhēng)法。當(dāng)抗原中雜質(zhì)難以去除或抗原的結(jié)合特異性不穩(wěn)定時(shí)，可采用這種模式測(cè)定抗體，最典型的例子是乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗體（HBeAb）的測(cè)定。由于e抗原較核心抗原僅多29個(gè)氨基酸，e抗原很容易轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵目乖?，因此，HBcAb和HBeAb的測(cè)定均采用競(jìng)爭(zhēng)法。但其測(cè)定具體模式有區(qū)別?？乖墓滔嗷贖BcAb的測(cè)定，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）直接包被于固相上，而在HBeAb測(cè)定，則先將特異抗e抗原的抗體包被于固相上，在測(cè)定時(shí)，再將e抗原通過(guò)相應(yīng)特異抗體而間接固相化。HBcAb和HBeAbELISA測(cè)定具體操作步驟分述如下。HBcAb的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定：（1）先將HBcAg在碳酸鹽緩沖液中2~8℃過(guò)夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌，去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。（2）同時(shí)加入待測(cè)樣本和酶標(biāo)的特異抗體，溫育（通常為37℃下）一定時(shí)間后，洗板。此步中，待測(cè)樣本中的抗體將與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相上特異抗原結(jié)合。（3）加入酶底物，溫育顯色測(cè)定，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比HBeAb的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定：（1）先將HBeAb在碳酸鹽緩沖液中2~8℃過(guò)夜包被，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。（2）同時(shí)加入待測(cè)樣本和中和抗原HBeAg，溫育（通常為37℃下）一定時(shí)間后洗板；此步中，待測(cè)樣本中的抗體將與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)與中和抗原結(jié)合HBeAg，待測(cè)樣本中HBeAb濃度越高，則與固相HBeAb結(jié)合的HBeAg越少，反之亦然。（3）加入酶標(biāo)的特異抗體，溫育一定時(shí)間后洗板；此步中，酶標(biāo)抗體將與結(jié)合于固相抗體上的特異抗原結(jié)合；（4）加入酶底物，溫育顯色測(cè)定，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比（圖2-9）?，F(xiàn)試劑盒通常將第（2）和第（3）步并為一步，先后加入樣本、酶標(biāo)抗體和HBeAg，此時(shí)，固相抗體、酶標(biāo)抗體和樣本中的特異抗體將一起競(jìng)爭(zhēng)與加入的HBeAg結(jié)合。這樣更能體現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的實(shí)質(zhì)。

HBeAb之所以要采用此種模式測(cè)定，主要是HBeAg的不穩(wěn)定所致，如在固相直接包被HBeAg，則會(huì)因?yàn)镠BeAg向HBcAg的易轉(zhuǎn)變性，而導(dǎo)致測(cè)定誤差?？贵w的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定不同于只有單個(gè)抗原表