生物浙科版學(xué)案：課堂探究第二章第三節(jié)動(dòng)物的克隆

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精課堂探究動(dòng)物克隆技術(shù)的基礎(chǔ)是動(dòng)物的細(xì)胞和組織培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)主要是體外人工培養(yǎng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞全能性的揭示、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)控制機(jī)理的分析、癌變機(jī)理和衰老原因的研究，都與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)密不可分。一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和克隆形成1．動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就停止分裂增殖.(1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，首先將組織塊剪碎，用機(jī)械法或胰酶處理，使其分散成許多單個(gè)細(xì)胞,然后,在人工控制的條件下，使這些細(xì)胞生存和生長、分裂乃至接觸抑制和有規(guī)律的衰老、死亡等生命活動(dòng)現(xiàn)象。由于細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞之間并非彼此獨(dú)立而是在生命活動(dòng)中相互依存，所以在某種程度上像體內(nèi)一樣呈現(xiàn)一定的組織特性。（2）動(dòng)物組織培養(yǎng)的含義胰酶能使細(xì)胞分散開的原因是可分解細(xì)胞間的膠原蛋白，使細(xì)胞間的聯(lián)系性減小。動(dòng)物組織在體外及人工條件下維持生活狀態(tài)或生長特性.（3）動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的關(guān)系①二者在離體情況下，都能培養(yǎng)并表現(xiàn)正常的生命活動(dòng)；②不同點(diǎn)是，動(dòng)物組織培養(yǎng)在得到離體組織后,需要機(jī)械處理或胰蛋白酶處理得到分散的細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)動(dòng)物組織培養(yǎng)過程中可以伴隨組織分化。2．動(dòng)物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展(1)發(fā)展簡史及近況①萌芽時(shí)期在19世紀(jì)，1885年，雞神經(jīng)板在生理鹽水中培養(yǎng)成活。②1903年，皮膚及白細(xì)胞培養(yǎng)在腹水及血清中細(xì)胞存活時(shí)間長達(dá)1個(gè)月。③1907年真正的組織培養(yǎng)開始，并在蛙胚神經(jīng)管培養(yǎng)中看到了神經(jīng)纖維末端的阿米巴運(yùn)動(dòng).（2）動(dòng)物組織培養(yǎng)的流程取動(dòng)物組織塊→剪碎組織→用胰蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞→制成細(xì)胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)→放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化即正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而形成具有癌性的細(xì)胞.①原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞、組織培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后(一般10代以內(nèi)）停止生長，需要重新更換培養(yǎng)基。②傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶,叫傳代培養(yǎng)。有時(shí)也把最初的若干次傳代培養(yǎng)歸入原代培養(yǎng)范圍。正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞傳到一定代數(shù)便會(huì)衰老、死亡,不能無限制地傳下去，但有些突變和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻無限傳代。如HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位黑人宮頸癌患者的癌細(xì)胞培養(yǎng)至今而形成的腫瘤細(xì)胞系。3．細(xì)胞系、細(xì)胞株（1)細(xì)胞系:可連續(xù)傳代的細(xì)胞。①特點(diǎn):無限增殖。②類型a．連續(xù)細(xì)胞系：能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系。是發(fā)生轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞系,大多數(shù)具有異倍體核型，有的是惡性細(xì)胞系,具有異體致癌性，有的連續(xù)細(xì)胞系獲得了不死性，但保留接觸抑制現(xiàn)象，不致癌.b．有限細(xì)胞系：不能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系。二倍體細(xì)胞一般為有限細(xì)胞系。細(xì)胞系泛指可傳代的細(xì)胞，細(xì)胞株是具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞系.(2）細(xì)胞株:從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞，能夠繁殖50代左右。①特點(diǎn)：能始終保持特征。②類型a．連續(xù)細(xì)胞株:可連續(xù)多次傳代的細(xì)胞株。b．有限細(xì)胞株:可傳代次數(shù)有限的細(xì)胞株.4．克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法可以得到純系的細(xì)胞系。(1)克?。阂喾Q無性繁殖系或簡稱無性系。對細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。（2)克隆培養(yǎng)法（細(xì)胞克?。喊岩粋€(gè)單細(xì)胞從群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的技術(shù)。(3)克隆的基本要求：必須保證分離出來的細(xì)胞是一個(gè)而不是多個(gè)，即必須肯定所建成的克隆來源于單個(gè)細(xì)胞。(4）用于克隆的細(xì)胞：理論上所有的細(xì)胞都可以克隆，但原代培養(yǎng)細(xì)胞和有限系克隆起來有困難。只有對培養(yǎng)環(huán)境有較大適應(yīng)范圍和具有較強(qiáng)獨(dú)立生存能力的細(xì)胞，才容易做細(xì)胞克隆.無限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞等比較容易克隆.(5）提高細(xì)胞克隆形成率的措施①選擇適宜的培養(yǎng)基;②添加血清；③以滋養(yǎng)細(xì)胞支持生長；④激素(胰島素等)刺激;⑤使用CO2培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)pH和選擇細(xì)胞生長支持物。(6)應(yīng)用:最主要用途之一就是從中分離出缺乏特殊基因的突變細(xì)胞系.二、動(dòng)物的細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用1．細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交(1)細(xì)胞融合細(xì)胞融合①概念：兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞結(jié)合成一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象。②過程:動(dòng)物細(xì)胞的融合與植物原生質(zhì)體的融合的原理基本相同。誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法類似,常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的仙臺(tái)病毒、電刺激等。但植物原生質(zhì)體的融合不用滅活的仙臺(tái)病毒。（2）細(xì)胞雜交細(xì)胞融合的原理是細(xì)胞膜的流動(dòng)性。①概念：基因型不同的細(xì)胞間的融合。②特征：雜交細(xì)胞中的染色體容易丟失。(3）二者關(guān)系：細(xì)胞融合包含體細(xì)胞雜交，細(xì)胞融合可以在基因型相同或不同的細(xì)胞間進(jìn)行,而基因型不同的細(xì)胞間的融合就是細(xì)胞雜交.融合(雜交）形成的雜種細(xì)胞包含兩個(gè)親本的遺傳物質(zhì)，其染色體數(shù)、基因組成情況、染色體組都是兩個(gè)細(xì)胞之和。（4）意義:克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。2．雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體制備利用細(xì)胞雜交技術(shù)，將抗體生成細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞）與瘤細(xì)胞雜交,形成一雜種細(xì)胞（雜交瘤技術(shù)）的過程。(1）抗體:B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。主要成分：球蛋白，具有特異性,從血清中分離出的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差。(2）雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn):既能大量無限繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體。(3)制備基本過程①用外界抗原刺激動(dòng)物，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，得到B淋巴細(xì)胞。②用聚乙二醇、滅活的仙臺(tái)病毒作介導(dǎo),使免疫的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。(獲得三種融合細(xì)胞：B—B細(xì)胞、B—瘤細(xì)胞、瘤—瘤細(xì)胞）③然后篩選獲得雜交瘤細(xì)胞。在選定的培養(yǎng)基上，未融合的細(xì)胞和融合的同種核的細(xì)胞會(huì)死亡，只有融合的細(xì)胞才能生長，并產(chǎn)生特異性抗體。雜交瘤技術(shù)制備抗體的最大優(yōu)點(diǎn)是：可以從特定抗原成分比例極少的抗原混合物中獲得單抗。(4)單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn):專一性強(qiáng)，靈敏度高，并可大量制備。三、動(dòng)物的克隆繁殖1．動(dòng)物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度（1）受精卵具有全能性動(dòng)物完整的個(gè)體就是由受精卵發(fā)育來的，所以受精卵具有全能性；受精卵的卵裂期，細(xì)胞沒有分化，也具有全能性。骨髓干細(xì)胞分化示意圖（2）分化細(xì)胞的全能性受限制胚胎細(xì)胞發(fā)育到一定階段，細(xì)胞不具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能，只具有分化出多種組織細(xì)胞的潛能，這樣的細(xì)胞叫多能干細(xì)胞,如多能造血干細(xì)胞，可分化為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等。有的只能分化為一種細(xì)胞，如單能造血干細(xì)胞。有的已經(jīng)分化了的細(xì)胞不再分化為其他細(xì)胞，甚至終生不再分裂，如高度分化的神經(jīng)細(xì)胞。（3)不同生物的全能性及逆分化低等動(dòng)物細(xì)胞的全能性一般比較容易體現(xiàn)，如水螅。分化的細(xì)胞也可逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞,如癌細(xì)胞.（4)干細(xì)胞按能力可以分為以下四類：①全能干細(xì)胞：由卵和精細(xì)胞的融合產(chǎn)生受精卵.而受精卵在形成胚胎過程中四細(xì)胞期之前任一細(xì)胞皆是全能干細(xì)胞.具有發(fā)展成獨(dú)立個(gè)體的能力。也就是說能發(fā)展成一個(gè)個(gè)體的細(xì)胞就稱為全能干細(xì)胞.②萬能干細(xì)胞：是全能干細(xì)胞的后裔,無法發(fā)育成一個(gè)個(gè)體，但具有可以發(fā)育成多種組織的能力的細(xì)胞。③多能干細(xì)胞：只能分化成特定組織或器官等特定族群的細(xì)胞(例如血細(xì)胞，包括紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞和血小板）。④專一性干細(xì)胞：只能產(chǎn)生一種細(xì)胞類型;但是，具有自更新屬性,將其與非干細(xì)胞區(qū)分開.2．動(dòng)物難以克隆的根本原因理論上講，特化的動(dòng)物細(xì)胞基因組是完整的，具有全能性。核移植的原理是細(xì)胞核的全能性。實(shí)際上，細(xì)胞在分化過程中，基因表達(dá)的調(diào)控使得細(xì)胞中合成了專一的蛋白質(zhì)，即細(xì)胞基因組中的基因不同時(shí)進(jìn)行活動(dòng)，或發(fā)生差異性表達(dá)，因此，不能像受精卵一樣發(fā)揮細(xì)胞的全能性.即動(dòng)物難以克隆的根本原因是基因的選擇性表達(dá)。動(dòng)物細(xì)胞的全能性會(huì)隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)?。目前還不能用類似于植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動(dòng)物個(gè)體，用動(dòng)物細(xì)胞克隆的動(dòng)物，實(shí)際上是通過核移植來實(shí)現(xiàn)的。3．細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物的克隆繁殖（1)核移植：利用一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（供體核）來取代另一個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核，形成一個(gè)重建的“合子”的過程。用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物.（2）過程(以蛙形成為例)：用囊胚細(xì)胞(或皮膚細(xì)胞）核移植到去核的卵母細(xì)胞中,重組細(xì)胞發(fā)育成了蝌蚪，有的甚至變態(tài)發(fā)育為成蛙.受體細(xì)胞一般選用卵母細(xì)胞，是因?yàn)槠潴w積大,易操作;細(xì)胞內(nèi)含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的某種物質(zhì)和營養(yǎng)條件。(3）首例體細(xì)胞克隆動(dòng)物（克隆羊）多莉的性狀與供核母羊(白面綿羊)相似但不完全相同.通過體細(xì)胞克隆動(dòng)物的成功，證明了：①高度分化細(xì)胞經(jīng)過一定技術(shù)處理，也可回復(fù)到類似受精卵時(shí)期的功能；②在胚胎和個(gè)體發(fā)育中,細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核（包括異源的細(xì)胞核）發(fā)育的作用。(4）克隆的生物學(xué)機(jī)理①重組卵細(xì)胞最初分裂時(shí)雖然復(fù)制了DNA，但基因的轉(zhuǎn)錄并未開始;②供體核DNA開始丟失來源于乳腺細(xì)胞的調(diào)節(jié)蛋白,阻止