DB21T 3120-2019 水產(chǎn)動(dòng)物物種分子鑒定COI、16S rRNA分子標(biāo)記法

DB21Technicalspecificationforspeciesmoleculariden遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I1水產(chǎn)動(dòng)物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標(biāo)記法本方法規(guī)定了水產(chǎn)動(dòng)物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標(biāo)記法的相關(guān)術(shù)語試劑、儀器和設(shè)備，樣品采集、保存和前處理，DNA提取和檢測(cè)，序列擴(kuò)增和測(cè)序，以及物種鑒定的本方法適用于水產(chǎn)動(dòng)物物種分子鑒定COI、16SrRNAGB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)指利用分子生物學(xué)手段,對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物樣本（尤其適用于形態(tài)學(xué)特征相近、模糊或丟失的樣本）的分聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreactio24標(biāo)記方式比對(duì)，確定物種分類信息。本方法同時(shí)對(duì)COI和16SrRNA兩種分子標(biāo)記條形碼進(jìn)行分析，并在GenBank（/genbank）和BOLDSystem（）兩個(gè)數(shù)實(shí)驗(yàn)僅使用分析純?cè)噭?，水?yīng)符合GB/T6682一級(jí)水要求?！?5%乙醇；——TE緩沖液（pH7.6100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0——Taq酶（5U/μL——10×PCR緩沖液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2）；——溴化乙錠（10mg/mL）；）；5.2儀器和設(shè)備）；3樣本采集和后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、腸道、積3mol/LNaAc和2.5倍體積無水乙醇，混勻，置于-27.1.412000rpm離心15min，棄上清。以分別于260nm和280nm波長下測(cè)定DNA的紫外吸收值。DNA濃度(μg/mL)=[A260/(0.020×L)]×稀釋4），），9物種鑒定9.1序列比對(duì)鑒定將COI基因序列在GenBank和BOLDSystem中進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，將16SrRNA基因序列在GenBank——若出現(xiàn)2個(gè)及以上比對(duì)結(jié)果，則選取相似度高且結(jié)果一致的鑒定物種作為鑒——對(duì)于鑒定成功的樣本，記錄于《水產(chǎn)動(dòng)物物種分子鑒定記錄表》9.2未檢出樣本未檢出樣本記錄于《未檢出水產(chǎn)動(dòng)物分類記錄表5PCR擴(kuò)增引物F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-F:5'-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3'R:5'-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-F:5'-ACAAATCAYAARGAYATYGG-R:5'-ACCAATCATAAAGATATTGF:5'-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-R:5'-GTAAATATATGRTGGGCTCF:5'-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-R:5'-GCTCGTGTRTCTACRTCCAF:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCF:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-F:5'-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3'R:5'-TGGTGGGCTCATACAATAAAGF:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC綱和頭足F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTCTCGF:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTATCGF:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTTTCG6鑒定人；地點(diǎn)123456789采樣人記錄人7鑒定人；地點(diǎn)123456789采樣人