高二 人教版-生物學選擇性必修3 第3章《基因工程的基本操作程序（第3課時）》課件

高二—人教版—生物學選擇性必修3—第3章基因工程的基本操作程序（第3課時）PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)的縮寫，是一種高效的核酸體外擴增技術(shù)。PCR技術(shù)在生物學實驗中具有非常廣泛的用途，不僅應(yīng)用在基因工程的基本操作程序中，還應(yīng)用在遺傳病的診斷、刑偵破案、新型冠狀病毒核酸檢測等多個領(lǐng)域。

探究?實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定目的要求：1、了解PCR和電泳鑒定的基本原理。2、嘗試進行PCR的基本操作，以及用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物鑒定。一、DNA片段的擴增——PCR（一）實驗原理2.PCR還利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。1.

PCR擴增DNA片段的原理：DNA半保留復制。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)?；仡櫍篜CR反應(yīng)過程變性（超過90℃，解旋）↓復性（50℃左右，引物與模板結(jié)合）↓延伸（72℃左右，合成新的DNA鏈）（二）材料用具1.PCR儀：自動控溫的儀器，實現(xiàn)DNA的擴增。一、DNA片段的擴增——PCR2.微量離心管：進行PCR反應(yīng)的場所。總?cè)萘繛?.2mL（左）和0.5mL(右）的微量離心管PCR儀器（二）材料用具3.微量移液器：用于量取轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體。一、DNA片段的擴增——PCR4.一次性吸液槍頭：微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭。不同型號的微量移液器吸取溶液的體積（量程）不同。如：0.5-10μL，20—200μL，100—1000μL，1000—5000μL等。一次性槍頭設(shè)定吸取體積時，嚴禁將體積刻度調(diào)到超出微量移液器量程范圍，用完后調(diào)到最大刻度。（二）材料用具一、DNA片段的擴增——PCR5.微量移液器的使用容量設(shè)定吸液槍頭安裝吸液放液卸去吸液槍頭利用調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)定。旋轉(zhuǎn)安裝法，用力不能過猛。按壓推動桿至第一停點，然后將吸液槍頭垂直進入液面，再平穩(wěn)松開。槍頭緊貼容器壁，按壓推動桿至第一停點，稍作停頓后再按壓至第二停點，以確保吸液槍頭內(nèi)沒有液體殘留。按壓卸載槍頭按鈕。一、DNA片段的擴增——PCR視頻微量移液器的使用（二）材料用具5.微量移液器的使用（二）材料用具一、DNA片段的擴增——PCR6.

PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系的配方模擬體內(nèi)DNA半保留復制PCR反應(yīng)體系：1.DNA模板；2.原料：4種脫氧核苷酸；3.引物：2種；4.DNA聚合酶；5.合適的反應(yīng)條件：pH、Mg2+等。模板DNA5～10μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實際為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μL1—5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μLH2O（無菌水）28～33μL總體積50μL注：模板DNA的用量為用量為1pg-1μg。（二）材料用具一、DNA片段的擴增——PCR6.

PCR反應(yīng)體系：知識鏈接：dNTP是指四種脫氧核苷酸三磷酸（dATP、dTTP、dGTP和dCTP）。脫氧核苷酸在DNA聚合酶催化新鏈合成的過程中，每摻入一個脫氧核苷酸，伴隨著兩個高能磷酸鍵的斷裂，由此釋放出的能量可以滿足脫氧核苷酸聚合反應(yīng)的需求。dNTP分子結(jié)構(gòu)示意圖下列關(guān)于PCR的說法，錯誤的是（

單選

）A.PCR是體外復制DNA的技術(shù)B.PCR過程中只需要一個模板DNA、兩種引物分子、大量脫氧核苷酸原料C.TaqDNA聚合酶要具有耐高溫的特點D.PCR利用了DNA的熱變性原理答案：B（三）方法步驟視頻PCR操作一、DNA片段的擴增——PCR用微量移液器把PCR配方中各組分加入到微量離心管中。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。設(shè)置好PCR儀循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中。循環(huán)程序變性復性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min移液離心擴增（三）方法步驟預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。一、DNA片段的擴增——PCR原理：材料用具：基本操作步驟：PCR小結(jié)瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物鑒定DNA半保留復制、DNA熱變性。PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性槍頭、PCR反應(yīng)體系配方。移液→離心→擴增。（一）實驗原理二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳1.電泳是指在電場作用下，帶電分子向著與它所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。

2.DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。相同長度的DNA雙鏈具有等量的凈電荷，因此，同樣大小的DNA在電場中會以相同的速率向一極移動。（一）實驗原理二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳PCR產(chǎn)物——DNA的鑒定一般用瓊脂糖凝膠電泳。

在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。4.凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是（

單選）

A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程

B．待測樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會影響DNA的遷移速率

C．進行電泳時，帶電粒子會向著與其所帶電荷相同的電極移動

D．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定答案：C1.電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）（二）材料用具二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳梳子制膠槽制膠板制膠工具（二）材料用具二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳2.電泳緩沖液：主要作用是維持合適的pH，以及使溶液具有一定的導電性以利于DNA的遷移。目前常用的有1×TAE和0.5×TBE緩沖液。內(nèi)含指示劑，PCR產(chǎn)物與其混合后再進行加樣。凝膠載樣緩沖液：瓊脂糖核酸染料（三）方法步驟二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳視頻瓊脂糖凝膠電泳操作用電泳緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為0.8%—1.2%的瓊脂糖溶液，加熱至瓊脂糖熔化，稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子。凝膠溶液完全凝固后拔出梳子，形成加樣孔。取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中。將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。（三）方法步驟二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳原理：材料用具：基本操作步驟：PCR小結(jié)原理：材料用具：基本操作步驟：瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物鑒定DNA半保留復制、DNA熱變性。PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性槍頭、PCR反應(yīng)體系配方。移液→離心→擴增。電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖、核酸染料。配制瓊脂糖溶液→制備凝膠→加樣→電泳→觀察。電泳原理、影響凝膠中DNA分子遷移速率因素、染色檢測。1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在—20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不要隨意加大試劑用量。注意事項:小結(jié)謝謝觀看！高二—人教版—生物學選擇性必修3—第3章基因工程的基本操作程序（第3課時）答疑同一塊凝膠中，DNA分子量大小與遷移速率的關(guān)系是怎樣的？同一塊凝膠中，DNA分子越大，遷移速率越慢，反之越快。結(jié)束電泳時，DNA分子越大，遷移距離越短，離點樣孔越近。判斷是否成功擴增出DNA片段的依據(jù)是什么？（1）觀察DNA條帶的分布。如對比標準參照物（Maker），可知擴增出的DNA片段大小。（2）觀察DNA條帶的粗細程度。如果電泳鑒定結(jié)果沒有條帶，或不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。如果擴增結(jié)果沒有條帶，即擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分；各反應(yīng)成分的用量不當；PCR程序設(shè)置不當?shù)取Ｈ绻麛U增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；復性溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。PCR實驗中如何設(shè)置對照？對照1（陰性對照）：PCR反應(yīng)體系中不加入模板DNA，而是以無菌水補足總體積，其他成分不變。以排除反應(yīng)體系等對實驗結(jié)果的干擾。對照2（陽性對照）：PCR反應(yīng)體系中不加入模板DNA，而是加入已知的包含目的基因的片段，其他成分不變，以檢測PCR的效率。用PCR方法檢測