生物素材：教材梳理專題課題分解纖維素的微生物的分離

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精庖丁巧解牛知識?巧學(xué)一、纖維素與纖維素酶纖維素是地球上最常見的多糖，其組成元素是C、H、O,纖維素的基本組成單位是葡萄糖,這一點(diǎn)和淀粉是相同的，但是由于和淀粉的結(jié)構(gòu)不同,它們的物理化學(xué)性質(zhì)也大不一樣。淀粉進(jìn)入人體后能在淀粉酶和麥芽糖酶的作用下徹底分解成葡萄糖，用于各項(xiàng)生命活動(dòng)；而纖維素在人體內(nèi)不能被消化吸收，但是它可以促進(jìn)人體腸胃的蠕動(dòng)，增加排便次數(shù),因此對人體健康是極為有利的。纖維素酶是一種復(fù)合酶，由三部分組成：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，只有在這三種酶的協(xié)同作用下，纖維素才能徹底分解成葡萄糖。動(dòng)物細(xì)胞中都沒有纖維素，也沒有纖維素酶，因此纖維素不能被動(dòng)物直接利用。知識拓展纖維素酶可以作為畜禽的飼料添加劑,其作用機(jī)理在于它可以打破植物的細(xì)胞壁，使胞內(nèi)的原生質(zhì)暴露出來，由內(nèi)源酶進(jìn)一步降解。這樣除了細(xì)胞壁能分解供能外，胞內(nèi)物質(zhì)的消化利用率也得到了提高，從而有效地提高了飼料的利用率.誤區(qū)警示草食動(dòng)物并不能直接利用植物體內(nèi)的纖維素，它們能以植物為主要食物的原因是其胃中生活著一些微生物，這些微生物能分泌纖維素酶，將纖維素分解成葡萄糖，被動(dòng)物利用，同時(shí)它們也能從動(dòng)物體內(nèi)獲得各種養(yǎng)料，因此它們和動(dòng)物是共生關(guān)系。二、纖維素分解菌的篩選一般情況下，我們都是先用選擇培養(yǎng)基對土壤中的纖維素分解菌進(jìn)行粗篩，然后用剛果紅染色法進(jìn)行細(xì)篩，剛果紅是一種酸性染料，呈棗紅色粉末狀,能溶于水和酒精，它能把膠質(zhì)和纖維素染成紅色，當(dāng)纖維素被酶分解后，剛果紅—纖維素復(fù)合物就無法形成，從而在固體培養(yǎng)基上形成一個(gè)以菌落為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來鑒別有無纖維素分解菌的存在。疑點(diǎn)突破纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，和固體培養(yǎng)基相比,它有利于營養(yǎng)物質(zhì)的充分利用,并可以增加纖維素分解菌的濃度。只有能夠產(chǎn)生纖維素酶的微生物才能分解纖維素作為碳源和能源，其他微生物由于不能利用纖維素,會(huì)因缺乏碳源和能源而死亡，因此該培養(yǎng)基具有選擇作用。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):分離分解纖維素的微生物1.土壤取樣在富含纖維素的潮濕的土壤中,用無菌小鐵鏟鏟去表層土，迅速鏟取土壤并裝入無菌信封，密封。2.選擇培養(yǎng)將土樣加入裝有30mL選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中,將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下振蕩培養(yǎng)1～2天（如果沒有搖床，可以采用定時(shí)人為搖晃錐形瓶的辦法）,直至培養(yǎng)液變混濁。吸取一定量的培養(yǎng)液（如5mL)，轉(zhuǎn)移至另一瓶新鮮的選擇培養(yǎng)基中，以同樣的方法培養(yǎng)到培養(yǎng)液變混濁。吸取適量的培養(yǎng)液,稀釋涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上。對照組用同樣量的富集后的培養(yǎng)液，稀釋涂布到不含纖維素的培養(yǎng)基上。3。梯度稀釋用lmL無菌吸管從富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中吸取lmL，注入盛有9mL無菌水的試管中，吹吸三次,使之充分混勻;然后再用一支1mL無菌吸管從此試管中吸取1mL注入另一盛有9mL無菌水的試管中，以此類推，制成101、102、103、104、105、106倍的各種稀釋液。4.涂布培養(yǎng)在含鑒別培養(yǎng)基的三個(gè)平板上分別用記號筆標(biāo)記:104、105、106倍的三種稀釋液,另取三個(gè)不含纖維素的培養(yǎng)基平板，分別用記號筆標(biāo)記：104、105、106倍的三種稀釋液;然后用三支lmL無菌吸管分別從104、105、106倍的三管稀釋液中吸取0.1mL對號放入已標(biāo)記了稀釋度的平板上,用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。將培養(yǎng)基平板倒置于30～37℃的溫室中培養(yǎng)1～2天，每隔24h觀察菌落情況。5.篩選菌株(1)剛果紅染色法常用的剛果紅（CongoRed，簡稱CR）染色法有兩種，一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。方法一：在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋質(zhì)量濃度為1mg／mL的CR溶液，10～15min后，倒去CR溶液，加入物質(zhì)的量濃度為1mol／L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此時(shí)，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)透明圈。方法二：配制質(zhì)量濃度為10mg／mL的CR溶液，滅菌后，按照每200mL培養(yǎng)基加入1mL的比例加入CR溶液，混勻后倒平板。等培養(yǎng)基上長出菌落后，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)明顯的透明圈。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)剛果紅染色法,菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)明顯的透明圈，而對照組，不含纖維素的培養(yǎng)基經(jīng)剛果紅染色法，菌落周圍不出現(xiàn)明顯的透明圈。辨析比較兩種剛果紅染色法的比較。剛果紅在篩選纖維素分解菌上的應(yīng)用已經(jīng)有超過20年的歷史，在本課題中我們給出了兩種方法。方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點(diǎn)是操作煩瑣，加入剛果紅溶液會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，不存在菌落混雜問題,缺點(diǎn)是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中纖維素占主要地位,因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分.方法二的另一缺點(diǎn)是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時(shí)間培養(yǎng)過程中會(huì)降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。（2)挑菌從產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落上挑取部分細(xì)菌并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在30～37℃培養(yǎng)，可獲得較純的菌種。知識拓展纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測定。葡萄糖分子中有還原性醛基，能與斐林試劑發(fā)生顏色反應(yīng),顏色的深淺和葡萄糖的濃度有關(guān),可以利用這個(gè)原理來定量測定葡萄糖的濃度.問題?探究問題1閱讀下面材料，談?wù)劺w維素對人體的作用。在過去很長的一段時(shí)間里，很多人都將食物中的膳食纖維視為食物中的渣滓，并將它們隨口吐出。但近年來，隨著食品化學(xué)、微生物等學(xué)科的迅猛發(fā)展，科學(xué)家終于發(fā)現(xiàn)膳食纖維不僅對人體大為有益，而且還是一種天然抗病防病與強(qiáng)身的有益物質(zhì).所謂膳食纖維,指的就是來自植物性食物中的纖維素與半纖維素，它們在人體消化道中不會(huì)被酶所分解。但腸道中的細(xì)菌可利用這些纖維素進(jìn)行發(fā)酵，從而大大增加糞便的體積.膳食纖維可分為兩類，即水溶性纖維（如果膠、蘋果纖維和燕麥纖維等）和水不溶性纖維(如大豆纖維、半纖維素和大麥纖維等)。水溶性纖維遇水會(huì)膨脹或變成透明凝膠狀物質(zhì)，在腸道內(nèi)更容易被腸道菌發(fā)酵和利用。膳食纖維的主要來源是蔬菜、雜糧和水果.因此，食物過分精細(xì)者或經(jīng)常以高脂肪、高蛋白食品為主要食物者常因膳食纖維攝入不足而誘發(fā)相關(guān)疾病，如果在主食中搭配部分雜糧，并經(jīng)常吃新鮮蔬菜和水果，即可保證有足夠量的膳食纖維攝入。經(jīng)常吃富含膳食纖維食品的人,可大大降低結(jié)腸癌和直腸癌的發(fā)病率。更重要的是，高纖維素食物還有助于預(yù)防發(fā)生高血壓、高血脂、冠心病、糖尿病和乳腺癌。對于中老年人來說，肉和脂肪性食品應(yīng)盡量少吃，但富含膳食纖維的食品，如芹菜、番茄、卷心菜與黃瓜等卻多吃為佳。水果也是十分重要的膳食纖維來源，尤其是香蕉、蘋果、橘子和葡萄。營養(yǎng)學(xué)家的研究發(fā)現(xiàn)，中老年人吃水果以多樣化為宜，這樣可保證體內(nèi)有充分的膳食纖維攝入。吃水果的另一好處是，水果普遍含有鉀元素與葉黃素、白藜蘆醇和花青素等營養(yǎng)成分，它們有降血壓，防止動(dòng)脈硬化,保護(hù)視網(wǎng)膜黃斑，防止老年性視力退化以及預(yù)防癌癥等作用;多吃水果還有防止便秘的作用。思路:在營養(yǎng)嚴(yán)重缺乏的情況下，纖維素對人的有利作用不很突出,但是當(dāng)飲食趨于精細(xì)化、高“營養(yǎng)”化后，可結(jié)合上述材料和生活經(jīng)驗(yàn)，探討纖維素對維持人體健康的重要的作用。探究：在物質(zhì)文明高度發(fā)達(dá)的現(xiàn)在，人們的生活水平普遍較高，這對于維持人體的健康無疑是大有裨益的，但是物極必反,“文明病、富貴病”的逐年增加為人們的健康提出了新的挑戰(zhàn)。雖然纖維素不能被人體直接利用，但它有以下作用:（1）增加飽腹感，減少熱量攝入，有利于減肥。(2）增加排便次數(shù)，避免糞便在腸道堆積，能大大減少直腸癌的發(fā)病率。（3)能吸收水分，軟化糞便，減少便秘的幾率.（4)能及時(shí)吸收腸道的有毒物質(zhì),隨糞便排出體外.（5）能增強(qiáng)某些食物的口感.問題2根據(jù)纖維素酶的作用，想一想纖維素酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都有哪些作用。思路:纖維素酶能將纖維素水解為葡萄糖，因此凡是有關(guān)纖維素降解的工農(nóng)業(yè)過程都可能用到纖維素酶.地球上每年光合作用約產(chǎn)生1。5×1011噸植物材料,其中50％為纖維素.這些植物多聚糖為數(shù)量巨大的真菌和細(xì)菌提供能源,也為人類提供了巨大的能量來源。但這些材料需轉(zhuǎn)換成葡萄糖、乙醇、甲烷等低分子物質(zhì)后才能被利用.用纖維素酶水解的方法與化學(xué)方法相比有許多好處，尤其體現(xiàn)在避免環(huán)境污染上。纖維素酶,還可用于淀粉處理、動(dòng)物飼料生產(chǎn)、果菜汁提取等食品工業(yè)、飼料工業(yè)、造紙工業(yè)及紡織工業(yè)等。探究:纖維素酶能把纖維素水解成葡萄糖，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重要的利用價(jià)值。(1）在農(nóng)牧業(yè)上的應(yīng)用：它可以用作飼料添加劑，提高動(dòng)物飼料的利用率。（2）在紡織業(yè)上的應(yīng)用：在解析纖維含量和種類、褪漿處理、生物磨光、石磨等方面。(3）在造紙業(yè)上的應(yīng)用：廣泛用于舊紙的脫墨處理.（4）在其他方面的應(yīng)用:生產(chǎn)葡萄糖、生產(chǎn)食品添加劑、生產(chǎn)木聚糖。典題?熱題例1下列生物能分解纖維素的是（）①人②兔③牛④蘑菇⑤纖維桿菌A.①②③④⑤ B.②③⑤ C.④⑤ D。⑤解析：動(dòng)物和人的細(xì)胞都不能合成纖維素酶，因此都不能直接利用纖維素,兔、牛等草食動(dòng)物之所以能長期吃草是因?yàn)槠淠c道內(nèi)有分解纖維素的微生物，蘑菇、纖維桿菌都能分泌纖維素酶從而利用纖維素。答案:C拓展延伸細(xì)菌和真菌對纖維素的分解情況不太相同，細(xì)菌的纖維素酶一般結(jié)合在細(xì)胞膜上，因此只有它吸附在纖維素上時(shí)才能分解纖維素;真菌的纖維素酶是胞外酶,不需要菌體和纖維素直接接觸就能將其分解.例2從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時(shí)，所用的培養(yǎng)基是（）A。加富培養(yǎng)基B。完全培養(yǎng)基C.基礎(chǔ)培養(yǎng)基D。鑒別培養(yǎng)基解析：從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，接種土壤稀釋液后，微生物生長時(shí)若產(chǎn)生蛋白酶，則會(huì)水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈，從而鑒別出該類菌的存在.答案：D辨析比較選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基是不同的，選擇培養(yǎng)基要求在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長,促進(jìn)需要的微生物生長，從而選育出某種微生物；鑒別培養(yǎng)基要求在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)，鑒別某種微生物是否存在（一般是根據(jù)某種顏色反應(yīng))，這里不需要抑制其他微生物的生長。例3分離土壤中纖維素分解菌用到的方法是（）①稀釋倒平板法②涂布平板法③單細(xì)胞挑取法④選擇培養(yǎng)基分離A。①② B②③④ C。②③ D.①③④解析：分離土壤中纖維素分解菌時(shí)，先進(jìn)行選擇培養(yǎng)，增大纖維素分解菌的濃度，即富集培養(yǎng)，梯度稀釋后涂布平板、培養(yǎng)，最后單細(xì)胞挑取以獲得純培養(yǎng)。答案：B誤區(qū)警示稀釋倒平板法和涂布倒平板法是不同的。前者是先進(jìn)行梯度稀釋，然后分別取不同稀釋液少許,與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合、搖勻后，傾入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落.后者是先將熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板,冷卻凝固后