DB21T 2341-2014 馬鈴薯種薯(種苗)病毒多重RT-PCR檢測技術規(guī)程　

ICS65.020.01DB21DB21/T2341—2014馬鈴薯種薯（種苗）病毒多重RT-PCR檢測技術規(guī)程遼寧省質量技術監(jiān)督局發(fā)布1DB21/T2341—2014本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由沈陽市農業(yè)科學院提出。本標準由沈陽市質量技術監(jiān)督局歸口。本標準起草單位：沈陽市農業(yè)科學院、遼寧省農業(yè)科學院、鐵嶺市農產品質量安全檢驗檢測中心。本標準主要起草人：楊雙、潘菊、左麗君、岳玲、王輝、李金鳳、馬東梅、劉延斌、孫嘉興、李雪。2DB21/T2341—2014本標準規(guī)定了馬鈴薯種薯（種苗）的總RNA提取、多重RT-PCR擴增、電泳檢測及結果判定的方法和操作規(guī)程。本標準適用于馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB18133-2012馬鈴薯種薯GB/T29377-2012馬鈴薯脫毒種薯級別與檢驗規(guī)程3術語和定義下列術語及定義適用于本標準。3.1馬鈴薯Y病毒（potatovirusY，PVY）馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY,簡稱PVY)，在馬鈴薯上引起嚴重花葉或壞死斑和壞死條斑。PVY是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的主要成員，病毒粒體線形，長730nm，該病毒寄主范圍較廣，可侵染茄科多種植物。病毒基因組為9.7Kb的單鏈正義RNA，基因組5′端共價結合基因組連接蛋白（VPg），3′端含有PloyA尾巴，該基因組為一個長的開放讀碼框（ORF），可翻譯成一個多聚蛋白，隨后切割產生8~10個產物。3.2馬鈴薯A病毒（potatovirusA，PVA）馬鈴薯A病毒(PotatovirusA,簡稱PVA)，在馬鈴薯上引起輕花葉或不顯癥。PVA是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員，病毒粒體線形，長730nm，其寄主范圍較窄，僅侵染茄科少數(shù)植物。病毒基因組為近1Kb的單鏈正義RNA，基因組5′端共價結合基因組連接蛋白（VPg），3′端含有PloyA尾巴，該基因組包含一個開放讀碼框（ORF），可翻譯成一個多聚蛋白，隨后切割產生11個產物。3.3DEPC水（DEPC-TreatedWater）3DB21/T2341—2014DEPC是焦碳酸二乙酯,分子式為C6H10O5，分子量為162.14，通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性，常用于生物實驗中RNA的提取等。DEPC水指經過是指用DEPC處理過并經高溫高壓消毒的純水。3.4反轉錄-聚合酶鏈式反應RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）一種在體外利用反轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板進行PCR反應，實現(xiàn)擴增RNA上特異片段的技術。3.5cDNA互補DNA，指與單鏈RNA互補的DNA，此為單鏈cDNA分子，或以此單鏈DNA為模板合成另一條與其互補的單鏈DNA,兩條互補的單鏈DNA分子組成一個雙鏈cDNA分子。4原理本標準涉及的馬鈴薯Y病毒（PVY）和馬鈴薯A病毒（PVA）屬于單鏈正義RNA病毒，在宿主內以RNA形式存在，通過提取待測植物組織總RNA,利用2對引物的多重RT-PCR方法擴增2種病毒的特異序列，通過瓊脂糖電泳檢測目標條帶的有無，確定是否感染相應病毒。5儀器設備及試劑5.1儀器設備PCR儀；水平電泳槽；電泳儀；萬分之一電子天平；微量加樣器；恒溫水浴鍋；磁力攪拌器；高速冷凍離心機；紫外-可見成像系統(tǒng)；高壓滅菌鍋；pH計等。5.2試劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；硼酸；鹽酸（HCl，36%）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）；氯化鈉（NaCl）；氯化鋰溶液（LiCl，10mol/L，RNase-free）；氫氧化鈉（NaOH）；?-巰基乙醇；無水乙醇；M-MLVReverseTranscriptase（200units/μL）；Oligo（dT）15（10μmol/L）；（dN）9（10μmol/μL）；dNTPs（10mmol/L）；RNaseinhibitor（40units/μL）；二硫蘇糖醇（100mM）；2×TaqPCRMix(withDye)；引物；DEPC水；瓊脂糖；GoldView染料等。5.3溶液配制相關溶液配制方法見附錄A。6方法步驟6.1抽樣按照GB/T29377-2012的規(guī)定進行抽樣。4DB21/T2341—20146.2總RNA提取6.2.1組織裂解將少量樣品（植物葉片、塊莖芽眼或者脫毒種苗莖葉）在液氮中迅速研碎，取約0.05g加入盛有500μLCTAB提取RNA緩沖液的2mL離心管中，振蕩混勻后于65℃水浴10min。6.2.2去蛋白質加入等體積氯仿/異戊醇（24：1）抽提，4℃10,000rpm離心5min后，將上清液轉移至1.5mL離心管。6.2.3沉淀RNA加入總體積1/4的10mol/LLiCl，-20℃放置2h后，4℃10,000rpm離心10min，棄上清。6.2.4去多糖、鹽等雜質用DEPC水溶解沉淀，加入總體積1/10的3mol/LNaAC（pH5.2）混勻，再加入2倍體積無水乙醇，-20℃放置20min，4℃10,000rpm離心10min，棄上清。70%乙醇洗滌沉淀2次，放置超凈工作臺上吹干，加入50μLDEPC水溶解。6.3多重RT-PCR擴增6.3.1cDNA合成4μL，RNaseinhibitor（40units/μL）0.5μL；二硫蘇糖醇（100mM）2μL；M-MLVReverseTranscriptase（200units/μL）1μL。37℃2h，94℃5min，立刻置于-20℃保存。6.3.2PCR擴增6.3.2.1反應體系LcDNA，混勻。引物序列見附錄B。6.3.2.2反應程序94℃預變性5min；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；72℃延伸5min；4℃保存。6.4電泳檢測6.4.1凝膠制作稱取0.48g瓊脂糖倒入150ml三角瓶中，加入30ml1×TBE緩沖液，在微波爐中加熱溶解后，再加入3μlGoldview生物染料，倒入調平并安放適當梳齒的制膠板上，冷凝后小心拔出梳齒。6.4.2電泳5DB21/T2341—2014每個加樣孔加入5μLPCR產物。100V恒壓電泳至指示帶到達膠板的2/3處。6.4.3觀察電泳結束后，取出凝膠置于紫外成像系統(tǒng)，拍照。6.5結果判定觀察PCR產物的有無和片段大小，與陽性對照、陰性對照比較。如果檢測樣品與陽性對照相同具有目標條帶，判定樣品感染相應病毒；如果檢測樣品與陰性對照相同無目標條帶，判定樣品沒有感染相應病毒。6DB21/T2341—2014（規(guī)范性附錄）溶液配制A.1CTAB提取RNA緩沖液包含2%CTAB(W/V)，25mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl（pH8.0），2.0mol/LNaCl，滅菌后加入2%（V/V）?-巰基乙醇。A.2引物稀釋按照引物合成單的說明先配制100μmol/L的儲存液，取適量儲存液稀釋10倍，配制濃度為10mmol/L的使用液。A.310倍電泳緩沖液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，定容至1000