實驗動物技術課件

第十二章轉基因動物培育技術一.概況二.轉基因動物的原理和方法三.轉基因動物的應用第十二章轉基因動物培育技術一.概況二.轉基因動物的原理和方法三.轉基因動物的應用第十二章實驗動物技術9.實驗動物技術第一節(jié)實驗動物胚胎工程的基本內容一、超數排卵(Superovulation)1．幾種常用于超數排卵的激素

2．超數排卵(Superovulation)在實驗動物中的應用二、胚胎培養(yǎng)(EmbryoCUlture)三、胚胎保存(Embryopreservation)四、胚胎移植(Embryotransfer)

9.實驗動物技術五、胚胎分割(Embryosplit)六、體外受精(InVitrofertilization)七、顯微受精(Microfenilization)又稱輔助受精(Assistedfertilization)八、細胞核移植(Nucleartransplantation)九、卵的激活與孤雌發(fā)育(Ocyteactivationandparthenogeneticdevelopment)十、胚胎干細胞(Embryonicstemcell)簡稱ES細胞9.實驗動物技術第二節(jié)實驗動物冷凍胚胎庫的建立

一、器材和試劑1．器材(1)液氮罐(2)生物冷凍儀(3)解剖顯微鏡、冰箱、CO2培養(yǎng)箱、滲透壓測定儀(4)手術器械、注射器、針頭、玻璃表面皿、玻璃細管、胚胎管(0．25m1)或安瓿等(5)針頭過濾器，0．22um和0．45um孔徑的濾膜

9.實驗動物技術2．試劑藥品3．溶液配制4．操作程序(1)超數排卵(2)采集胚胎(3)挑選胚胎(4)胚胎凍存(5)資料(6)入庫的各品種品系胚胎，必須分2份以上，放存在不同罐內和不同地方(7)當需要使用胚胎和檢測胚胎時，取出機動胚胎管，按凍存方法條件，采用相應的解凍方法解凍、復蘇(8)每個品種品系凍存胚胎數量9.實驗動物技術第三節(jié)試管動物的培育

一、試管小鼠的培育(一)器材和試劑藥品1．器材設備2．試劑藥品(二)溶液配制(三)方法步驟1．小鼠精子采集與獲能2．小鼠卵子獲取3．體外受精

9.實驗動物技術4．受精卵培養(yǎng)5．胚胎移植二、試管兔的培育(一)幾種溶液的配制1．培養(yǎng)液成份2．PBS液3．TCM—199液配制4．DM(DefinedMedium)(二)精液采集和獲能1．采集精液2．精子獲能(三)供體母兔超排

9.實驗動物技術(四)受體母兔同步發(fā)情(五)供體母兔注射HCG(六)體外受精(七)受精卵培養(yǎng)(八)胚胎移植三、試管獼猴的培育

(一)溶液配制(二)超排(三)采卵(四)采精與精子獲能1．電刺激采精器2．用直腸探子法的采精技術9.實驗動物技術第十二章轉基因動物培育技術一.概況二.轉基因動物的原理和方法三.轉基因動物的應用第十二章轉基因動物培育技術一.概況二.轉基因動物的原理和方法三.轉基因動物的應用第四節(jié)

轉基因動物培育技術一.概況

二.轉基因動物的原理和方法三.轉基因動物的應用

9.實驗動物技術一.概況一、概況9.實驗動物技術

一、轉基因動物定義

是利用基因工程和胚胎工程技術，改變動物遺傳性狀的新方法，是將外源基因導入動物的受精卵，再將受精卵植入到代孕動物的輸卵管或子宮中培育的動物。9.實驗動物技術定義采用基因轉移技術使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉基因——被導入的目的基因轉基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物9.實驗動物技術目錄9.實驗動物技術

激素轉基因鼠(碩鼠)，右邊為同胞鼠對照。9.實驗動物技術核轉移技術

即動物整體克隆技術，將動物體細胞核全部導入另一個體的去胞核的受精卵內，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。9.實驗動物技術基因剔除技術也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內某種基因的技術。9.實驗動物技術轉基因動物（transgenicanimals）是指染色體基因組中整合有外源基因并能遺傳給后代的一類動物。整合到動物染色體基因組的外源基因被稱為轉基因(transgene)。轉基因技術則是指制備轉基因動物所需的一套技術，它涉及外源基因的組建、載體、受體、基因導入技術、供轉基因胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物等許多方面。9.實驗動物技術二、克隆動物克隆動物技術主要包括三個步驟1.制備成熟的卵細胞2.細胞核移植，將供體細胞的細胞核與去核的卵細胞融合成一個雜合細胞3.將“核質融合”的卵細胞移植到借腹懷孕動物的子宮發(fā)育直到出生9.實驗動物技術2.研究現狀

轉基因動物自1980--1981年產生后，迅速發(fā)展?，F已廣泛應用于醫(yī)藥、農業(yè)及生物學領域。在醫(yī)學領域己用于遺傳病、腫瘤、心血管疾病、免疫性疾病的研究，包括建立疾病的病理模型，探討其病因、發(fā)病機理和基因治療方法，研究基因表達調控以及進行藥物干預和新藥的開發(fā)實驗等。建立疾病的轉基因動物模型是轉基因動物技術應用于醫(yī)學方面的一個重要研究內容。9.實驗動物技術在農業(yè)方面，轉基因農業(yè)動物研究有了很大進展，尤其在通過胚胎細胞或體細胞將基因導人牛、豬、羊和山羊，產生可遺傳的轉基因牲畜方面發(fā)展很快。說明轉基因牲畜不僅可作為生物反應器，為人類生產基因工程產品和用于牲畜品種改良，提供更好的服務，同時也促進了胚胎學和發(fā)育遺傳學的飛速發(fā)展，并開拓了醫(yī)學研究的新領9.實驗動物技術

人類培育出的第一只轉基因猴“安迪”。于2000年10月2日在美國出生。

美國密蘇里大學最近通過克隆技術培育出四只含有熒光水母基因的小豬。左為熒光小

豬，右為正常小豬9.實驗動物技術

2003年11月21日，美國得克薩斯的一家公司宣布，經過轉基因技術他們已經研制出能發(fā)熒光的小型熱帶魚———“熒光魚轉基因的小雞

9.實驗動物技術

2004年6月30日由中國軍事醫(yī)學科學院主持，山東農業(yè)大學、萊陽農學院等單位共同參與首批28只帶有t-PA組織型纖溶酶原激活劑的轉基因羊，在山東省東營市天翼公司陸續(xù)降生。t-PA是目前治療急性心肌梗塞最好的溶血栓藥物，9.實驗動物技術二、轉基因動物培育的原理和方法（一）基本原理：

1、借助分子生物學和胚胎工程的技術，將外源目的基因在體外擴增和加工，再導入動物的早期胚胎細胞中，使其整合到染色體上，當胚胎被移植到代孕動物的輸卵管或子宮中后，發(fā)育成攜帶有外源基因的轉基因動物。9.實驗動物技術2.關鍵技術:

（1）外源目的基因的制備

（2）外源目的基因的有效導入

（3）胚胎培養(yǎng)與移植

（4）外源目的基因表達的檢測9.實驗動物技術

（1）重組DNA技術（RecombinantDNATechnology）

是在體外按人們的意愿將不同的DNA

分子重組的技術。

（二）外源目的基因的制備1、基因工程基本概念9.實驗動物技術

是指利用重組DNA技術將目的基因和載體重組，再導入受體細胞內進行擴增和表達的過程。（2）基因工程(geneticengineering)9.實驗動物技術

是指通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體。基因工程相當于目的基因的無性繁殖過程，也稱其為基因克隆(genecloning)。

（3）克?。╟lone）9.實驗動物技術2、基因工程操作中常用的工具9.實驗動物技術（1）工具酶限制性內切酶T４DNA連接酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ逆轉錄酶T4多核苷酸激酶鹼性磷酸酶末端脫氧核苷酸轉移酶9.實驗動物技術

限制性內切酶(restrictionendonuclease)

定義:是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ9.實驗動物技術作用：與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。

命名：第一個字母代表細菌的屬名，用大寫；第二、三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現的先后次序。9.實驗動物技術

Ⅱ型限制酶識別序列特點—回文結構······GAATTC············CTTAAG······切口：黏性切口和平端切口9.實驗動物技術

EcoRⅠHpaⅡ

—GAATTC—

—GTTAAC—

—CTTAAG—

—CAATTG—

—G

—CTTAA

黏端切口平端切口

+AATTC—G——GTT—CAA+AAC—TTG—9.實驗動物技術（2）載體定義：是攜帶目的DNA片段進入受體細胞進行擴增和表達的工具。常用載體：細菌質粒噬菌體黏粒病毒

腺病毒、腺病毒相關病毒、痘病毒逆轉錄病毒，猴空泡病毒9.實驗動物技術

質粒（plasmid）特點

能在宿主細胞內獨立復制，帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。9.實驗動物技術pUC19質粒的物理圖譜9.實驗動物技術頭部尾尾部纖維

蛋白衣殼

λ噬菌體（bacteriophage,phage）9.實驗動物技術3、基因工程的操作過程9.實驗動物技術9.實驗動物技術9.實驗動物技術9.實驗動物技術·

化學合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列·基因組DNA··基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA

cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)（1）目的基因的獲得9.實驗動物技術

1．同源黏性末端連接

方式：同一限制酶切割位點連接配伍末端連接2、平端連接

適用于：限制性內切酶產生的平端切割黏性末端或切平形成的平端3、定向連接

適用于：兩種不同的黏性末端一個黏端，一個平端

（2）目的基因與載體的連接9.實驗動物技術目的基因與載體的各種連接方式9.實驗動物技術受體菌的條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)導入方式：轉化(transformation)

轉染(transfection)

轉導(transduction)（3）重組體導入受體細胞9.實驗動物技術直接選擇法：

抗藥性標記選擇插入失活法標志補救

α互補

分子雜交法

原位雜交

Southern印跡

非直接選擇法：

免疫學方法

如免疫化學方法酶免檢測法（4）基因工程菌的篩選9.實驗動物技術

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●●●●●平皿上的單菌落復印硝酸纖維膜溶菌DNA變性固定雜交菌落原位雜交

繼續(xù)培養(yǎng)9.實驗動物技術原核表達體系

大腸桿菌

標準：

選擇標志強啟動子

SD序列多接頭克隆位點不足：

不宜表達真核基因組DNA

不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體很難表達大量可溶性蛋白（5）外源基因的表達9.實驗動物技術真核表達體系

優(yōu)點：

■重組質粒轉染的細胞具有遺傳的穩(wěn)定性和可重復性

■哺乳動物細胞能對外源基因轉錄的hnRNA剪切加工成成熟的mRNA

■對表達的蛋白質能進行轉錄后的加工如糖基化

■可將表達產物分泌到培養(yǎng)基中方便下游的提純缺點：操作技術難費時不經濟9.實驗動物技術四、基因轉移和基因剔除技術在醫(yī)學中的應用建立動物模型①單基因決定疾病模型

基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型9.實驗動物技術（三）胚胎培養(yǎng)與移植方法基因顯微注射法逆轉錄病毒感染法胚胎干細胞介導法精子載體導入法9.實驗動物技術基因顯微注射法9.實驗動物技術（1.）目的基因的制備和純化來源：人工合成，逆轉錄，PCR等擴增：通過載體方式或者PCR進行。常選用質粒做載體純化：限制性內切酶9.實驗動物技術（2）小鼠的準備小鼠的有關要求：9.實驗動物技術

（3）超排卵與取卵孕馬血清促性腺激素（PMSG）,42-48h人絨毛膜促性腺激素（HCG）,10-13h（4）基因顯微注射（5）受精卵移植：單細胞至桑椹胚階段移植到輸卵管；囊胚期則移植到子宮。（6）目的基因的檢測。(7)建系。9.實驗動物技術9.實驗動物技術9.實驗動物技術9.實驗動物技術顯微注射儀9.實驗動物技術納米顯微注射儀9.實驗動物技術轉基因儀9.實驗動物技術DNA顯微注射的轉基因過程的總效率:

9.實驗動物技術逆轉錄病毒感染法9.實驗動物技術（1.）病毒載體的構建提取病毒環(huán)狀DNA克隆到載體中切除病毒編碼區(qū)目的基因導入轉染細胞9.實驗動物技術（2）包裝細胞（3）感染早期胚胎：取出8細胞胚胎去除透明帶與包裝細胞共培養(yǎng)

轉入假孕母鼠的子宮內產出小鼠9.實驗動物技術9.實驗動物技術9.實驗動物技術通過病毒載體導入ES細胞建立轉基因小鼠的技術路線

9.實驗動物技術9.實驗動物技術胚胎干細胞介導法9.實驗動物技術9.實驗動物技術（1）分離培養(yǎng)ES細胞（2）ES細胞基因操作（3）獲取囊胚期胚胎（4）將ES細胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔內（5）將胚胎移植到假孕母鼠子宮內9.實驗動物技術精子載體導入法利用精子作為載體，將外源基因導入精子（共育法，電穿孔，脂質體等），借助受精作用把外源基因導入受精卵，整合到受精卵的基因組中。該法簡單、方便、免去對原核的損傷，可用于多種動物特別是大動物，非常實用，但這一技術還處于完善階段。主要步驟如下：（1）外源目的基因導入精子（2）精子與卵子結合（3）將受精卵移植到假孕母鼠子宮內9.實驗動物技術電穿孔法和脂質轉染法

一.電穿孔法的原理很簡單,在直流電場作用的瞬間,細胞膜表面產生疏水或親水的微小通道。即電穿孔技術是利用脈沖電場改變細胞膜的狀態(tài)和通透性，達到將DNA導入細胞的目的。電穿孔的時間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。二.脂質轉染法：用人工合成的陽離子類脂與外源DNA結合，借助類脂容易穿越脂膜的特性將DNA導入。9.實驗動物技術三轉基因動物的應用（1）研究基因結構和功能及其表達和調控9.實驗動物技術(2)建立人類疾病動物模型

例如:乙型肝炎表面抗原轉基因動物模型。將人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因導入小鼠，可獲得HBsAg轉基因導入小鼠，而且該轉基因小鼠的肝中可以產生HBsAg。這種轉基因小鼠既可以模擬患者的帶毒狀態(tài)，又不導致發(fā)病。這種轉基因小鼠模型可用來研究免疫應答耐受與肝細胞損傷的關系，探討發(fā)病機制、持續(xù)帶毒狀態(tài)及其清除、藥物篩選試驗、HBVDNA在宿主內的復制、表達及調控與乙型肝炎發(fā)病的關系等有關HBV病理學和治療學方面的難題。9.實驗動物技術（3）研究人類疾病基因治療可以通過基因槍注射治療基因進入皮膚或皮下腫瘤細胞治療腫瘤.

轉入胰島基因可以治療糖尿病9.實驗動物技術（4）研制生物反映器，生產天然活性藥物蛋白

2004年6月30日由中國軍事醫(yī)學科學院主持，山東農業(yè)大學、萊陽農學院等單位共同參與首批28只帶有t-PA組織型纖溶酶原激活劑的轉基因羊，t-PA是目前治療急性心肌梗塞最好的溶血栓藥物，9.實驗動物技術（5）擴大移植供體來源。2000年3月，英國著名國際生物技術公司PPf宣布，他們已用豬的成年體細胞通過兩步核移植技術，創(chuàng)造出一窩共5只小豬，并對它們的基因組DNA進行微衛(wèi)星分析，發(fā)現其中三只小豬屬于同一細胞系，另外兩只小豬屬于另一細胞系。該公司準備使用這些小豬作為患者的供體9.實驗動物技術（6）改良動物品種羊奶能代替打針吃藥9.實驗動物技術2003年12月美國俄亥俄州夸克生物科技公司報告創(chuàng)造出了一種不含膽固醇的小鼠9.實驗動物技術應用

創(chuàng)造醫(yī)學研究需要的動物模型改良動物品質培育動物新品種9.實驗動物技術課堂練習:1.什么叫轉基因動物?2.根據目的基因導入的方法與對象不同,培育轉基因的主要方法有顯微基因注射法逆轉錄病毒感染法胚胎干細胞介導精子載體導入9.實驗動物技術3.基因顯微注射法的基本步驟4.轉基因動物的應用？9.實驗動物技術基因敲除的原理和方法9.實驗動物技術：

2．1．利用基因同源重組進行基因敲除

基因敲除是80年代后半期應用DNA同源重組原理發(fā)展起來的。80年代初，胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次