灰樹花菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

灰樹花菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了灰樹花菌種生產(chǎn)的術(shù)語和定義、生產(chǎn)條件、生產(chǎn)技術(shù)、質(zhì)量控制、記錄及貯存。本文件適用于灰樹花各級固體菌種和液體菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150.2壓力容器第2部分：材料GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準GB/T12728食用菌術(shù)語GB15618土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1284食用菌菌種中雜菌及害蟲的檢驗NY/T1742食用菌菌種通用技術(shù)要求3術(shù)語和定義GB/T12728-2006界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1灰樹花Grifolafrondosa(Fr.)S.F.Gray隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophrales）、多孔菌科（Polyporaceae）、樹花屬（Grigola），又名貝葉多孔菌、葉狀奇果菌、千佛菌、栗子蘑、蓮花菌、云蕈、舞茸等。3.2固體菌種culture生長在固體培養(yǎng)料上的菌種。[來源：GB/T12728-2006,2.5.31]3.3母種stockculture具有結(jié)實性的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，也稱一級種，試管種。[來源：GB/T12728-2006,2.5.7，有修改]3.4原種motherspawn由母種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物，也稱二級種。[來源：GB/T12728-2006,2.5.8]3.5栽培種spawn由原種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物，栽培種只能用于栽培，不可再次擴大繁殖菌種，也稱三級種。[來源：GB/T12728-2006,2.5.9]3.6液體菌種liquidspawn培養(yǎng)基為液體狀態(tài)的菌種。[來源：GB/T12728-2006,2.5.30]3.7搖瓶液體菌種Liquidspawninshakepot由母種移植到以三角瓶為容器的液體培養(yǎng)基中繁殖的菌絲體純培養(yǎng)物。3.8食用菌液體菌種培養(yǎng)器cultivationapparatusforediblefungusliquidspawn也稱液體菌種培養(yǎng)罐，是指進行食用菌液體菌種培養(yǎng)的專用設(shè)備。要求不銹鋼材質(zhì)，符合GB150.2鋼制壓力容器標(biāo)準。3.9通氣量ventilationvolume在液體菌種培養(yǎng)過程中發(fā)酵罐體積與每分鐘通入發(fā)酵罐中無菌空氣體積的比例。注：用V/V（發(fā)酵罐體積/通入空氣體積）表示。3.10罐壓jar-pressure在液體菌種發(fā)酵制備過程中發(fā)酵罐內(nèi)保持的空氣壓力（表壓）。注：單位為Mpa。4生產(chǎn)條件4.1技術(shù)人員應(yīng)具有與所生產(chǎn)的菌種級別相適應(yīng)的《食用菌菌種生產(chǎn)經(jīng)營許可證》、《食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)人員證》和《食用菌菌種檢驗員證》的人員。4.2生產(chǎn)場地場地選擇應(yīng)符合NY/T528；環(huán)境空氣質(zhì)量應(yīng)符合GB3095；水質(zhì)應(yīng)符合GB5749；土壤應(yīng)符合GB15618。4.3生產(chǎn)廠房4.3.1固體菌種廠房應(yīng)符合NY/T528中4.3的規(guī)定。4.3.2液體菌種廠房4.3.2.1廠房內(nèi)應(yīng)設(shè)有原材料庫、配料室、滅菌室、無菌接種室、恒溫培養(yǎng)室、發(fā)酵罐培養(yǎng)室、檢驗室等，按照液體菌種生產(chǎn)工藝流程合理布局，無菌區(qū)與有菌區(qū)有效隔離。4.3.2.2廠房地面、墻壁和天花板應(yīng)能防水、防腐蝕、防滲漏、防滑，易清洗，易消毒，地面應(yīng)有1.0％～1.5％的排水坡度和良好的排水系統(tǒng)。門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)。4.3.2.3液體發(fā)酵間和接種間按照GB50073的要求執(zhí)行。4.4設(shè)備設(shè)施4.4.1固體菌種應(yīng)符合NY/T528中4.4的規(guī)定。4.4.2液體菌種4.4.2.1高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫回旋式振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、液體菌種培養(yǎng)器、液體菌種接種器、空氣壓縮機、空氣過濾器、冰箱、顯微鏡、磅秤、天平、酸度計及其它相關(guān)器具。4.4.2.2滅菌室、無菌接種室、恒溫培養(yǎng)室、液體菌種培養(yǎng)室、檢驗室均應(yīng)具備調(diào)溫設(shè)施，排風(fēng)設(shè)備。4.5培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合NY/T528中4.7.2的要求。4.6菌種選擇使用種性清楚，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、商品性能良好的品種。菌種生產(chǎn)應(yīng)符合NY/T528中4.5的要求。5生產(chǎn)技術(shù)5.1固體菌種生產(chǎn)5.1.1生產(chǎn)工藝流程培養(yǎng)基配制→分裝→滅菌→冷卻→接種→培養(yǎng)（檢查）→成品。5.1.2母種生產(chǎn)5.1.2.1容器應(yīng)符合NY/T528中4.7.1.2的規(guī)定。5.1.2.2培養(yǎng)基制備按照附錄A規(guī)定配制。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)立即分裝，分裝量為試管長度的1/4～1/5，試管口應(yīng)保持干凈，隨后封口。滅菌壓力0.105MPa～0.15MPa，溫度121℃～126℃，時間30min。滅菌結(jié)束后取出試管擺成斜面。5.1.2.3滅菌效果檢查按3%隨機抽取母種培養(yǎng)基置于28℃恒溫培養(yǎng)48h，檢查有無細菌或霉菌感染。5.1.2.4接種按照NY/T528中4.7.7的規(guī)定執(zhí)行。5.1.2.5培養(yǎng)溫度25℃±1℃，遮光培養(yǎng)10d～15d，當(dāng)菌絲長滿試管斜面，即可用于生產(chǎn)原種。5.1.3原種、栽培種生產(chǎn)5.1.3.1容器應(yīng)符合NY/T528中4.7.1.3和4.7.1.4的規(guī)定。5.1.3.2培養(yǎng)基制備按照附錄B規(guī)定配制。配制好的培養(yǎng)料立即裝瓶（袋），裝至2/3處，將瓶（袋）口和瓶（袋）外壁擦干凈封口。滅菌壓力0.105MPa～0.15MPa，溫度121℃～126℃，時間120min～180min。滅菌結(jié)束后取出冷卻至25℃以下待用。5.1.3.3接種按照NY/T528中4.7.7的規(guī)定執(zhí)行。每支母種接種4瓶（袋）～6瓶（袋）原種，每袋原種接種25瓶（袋）～35瓶（袋）栽培種。5.1.3.4培養(yǎng)溫度25℃±1℃，空氣相對濕度55％～65％，遮光、通風(fēng)，原種培養(yǎng)30d～40d，栽培種培養(yǎng)35d～45d，當(dāng)菌絲長滿瓶（袋），即可用于栽培種或栽培生產(chǎn)。5.1.4檢查母種接種36h后進行首次檢查，檢出未萌發(fā)或受污染者；培養(yǎng)4d～5d、8d～9d時分別進行第二次和第三次檢查，檢出污染或生長不良的菌種。原種及栽培種在菌絲封口前，隔日例行檢查；之后每隔一周檢查一次，直至長滿瓶（袋）。5.2液體菌種生產(chǎn)5.2.1生產(chǎn)工藝流程母種→搖瓶液體菌種→液體菌種培養(yǎng)器檢查、清洗與空消→培養(yǎng)基配制→上罐→滅菌→冷卻→接種→液體菌種發(fā)酵→菌種檢測5.2.2母種生產(chǎn)按照5.1.2的方法執(zhí)行。5.2.3搖瓶液體菌種生產(chǎn)5.2.3.1容器500mL～1000mL的三角瓶。5.2.3.2培養(yǎng)基制備按照附錄C規(guī)定配制培養(yǎng)基。裝液量為三角瓶容量的50％～60％，八層紗布和聚丙烯薄膜封口。滅菌壓力0.105MPa～0.15MPa，溫度121℃～126℃，時間30min。5.2.3.3接種將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至25℃以下，無菌條件下每瓶接入0.5cm2左右大小的母種5塊～8塊。5.2.3.4培養(yǎng)恒溫25℃±1℃遮光靜置培養(yǎng)24h，以振蕩頻率150r/min～180r/min，繼續(xù)培養(yǎng)4d～6d。5.2.3.5移種標(biāo)準發(fā)酵液清澈透明、無異味；菌絲球密集、均勻懸浮于液體中不分層，菌絲體濕重不少于50mg/mL，平皿檢驗無雜菌。5.2.4發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)5.2.4.1投料前準備檢查液體菌種培養(yǎng)器上全部閥門、壓力表，要求完好，工作正常；用流水沖洗液體菌種培養(yǎng)器罐體內(nèi)、外，達到無死角、內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物。使用前進行空消，壓力0.105MPa～0.15MPa，溫度121℃～126℃，時間40min。5.2.4.2培養(yǎng)基配制按照附錄D規(guī)定配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基起始pH為6.5～6.8。5.2.4.3上罐打開罐蓋，將配制好的液體培養(yǎng)基加入罐內(nèi)，裝液量為罐體容積的60％。通入空氣攪拌1min～2min，混合均勻，密封蓋口。5.2.4.4滅菌液體菌種培養(yǎng)器內(nèi)蒸汽壓力達到0.105Mpa～0.15Mpa，溫度達到121℃～126℃，保持50min～60min。5.2.4.5冷卻滅菌結(jié)束將冷水通入培養(yǎng)器夾層或內(nèi)置冷卻系統(tǒng)中循環(huán)，降溫過程中向發(fā)酵罐內(nèi)通入無菌空氣同時打開排氣閥，培養(yǎng)基降溫至22℃～25℃停止通入冷凝水，罐內(nèi)壓力維持在0.05Mpa。5.2.4.6接種在無菌條件下，將搖瓶液體菌種接入發(fā)酵罐，接種量為發(fā)酵液裝液量的10％。5.2.4.7培養(yǎng)通氣量：1︰0.5V/V～1︰1.0V/V（料液體積/空氣體積）。罐壓：0.03MPa～0.05MPa。培養(yǎng)溫度：25℃±2℃。培養(yǎng)時間：72h～96h。5.2.5檢查搖瓶液體菌種接種后每天觀察，若有菌絲掛壁、培養(yǎng)液渾濁則表明有雜菌污染，不可使用；液體菌種接種1d后進行隔天檢測，按照無菌操作取樣，將樣液接于PDA培養(yǎng)基的斜面或培養(yǎng)皿上，于28℃恒溫培養(yǎng)2d～5d，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況和有無雜菌污染。6質(zhì)量控制6.1固體菌種6.1.1質(zhì)量要求各級菌種感官及微生物學(xué)要求應(yīng)符合NY/T1742中規(guī)定。6.1.2菌種檢驗各級菌種雜菌及害蟲檢驗按照NY/T1284的規(guī)定執(zhí)行。6.1.3留樣各級菌種都應(yīng)留樣備查，母種每個批號3支～5支，原種、栽培種5瓶（袋）～7瓶（袋），于4℃～6℃條件下貯存，貯存至使用者在正常生產(chǎn)條件下該批菌種出第一茬菇。6.2液體菌種6.2.1感官要求6.2.1.1色澤：球狀菌絲體呈白色，菌液呈淡黃色。6.2.1.2菌液形態(tài)：菌液稍粘稠，有大量球狀、絮狀菌絲體懸浮、分布均勻、不上浮、不下沉、不迅速分層，菌球間液體不渾濁。6.2.1.3菌液氣味：有灰樹花液體菌種培養(yǎng)時特有的氣味，無異味。6.2.2理化指標(biāo)6.2.2.1終止pH：4.0～5.5。6.2.2.2菌絲濕重（g/100mL）：≥8。6.2.2.3顯微鏡下菌絲形態(tài)：灰樹花菌種液體培養(yǎng)特有的球狀和絮狀菌絲體大量分布，菌絲粗壯，菌絲內(nèi)原生質(zhì)分布均勻，染色劑著色深。6.2.2.4無菌檢查：無霉菌、細菌、酵母菌等雜菌菌落生長。6.2.3菌種檢驗檢驗項目、指標(biāo)、方法見附錄E，達到檢驗指標(biāo)即可放罐。6.2.4留樣搖瓶菌種使用時取樣30mL～40mL，發(fā)酵罐實消后的空白培養(yǎng)基取樣30mL～40mL，放罐前48h從發(fā)酵罐中取樣30mL～40mL，發(fā)酵終止后取樣80mL～100mL，均用無菌三角瓶留存，于2℃～4℃保存7d，備查。7記錄及貯存7.1記錄生產(chǎn)各環(huán)節(jié)應(yīng)由操作人員現(xiàn)場詳細記錄，記錄內(nèi)容簽字后歸檔保存至本批菌種栽培出菇結(jié)束。7.2貯存固體菌種一般在4℃～6℃下遮光貯存不超過15d，液體菌種在4℃～10℃下貯存不超過3d。

附錄A（規(guī)范性）常用母種培養(yǎng)基配方A.1PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）馬鈴薯200g（浸出汁），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。A.2CPDA培養(yǎng)基（綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）馬鈴薯200g（浸出汁），葡萄糖20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，蛋白胨5g，瓊脂20g，VB110mg，水1000mL。A.3馬鈴薯麩皮培養(yǎng)基馬鈴薯200g（浸出汁），麩皮100g（浸出汁），葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2.5g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，水1000mL。A.4木屑綜合培養(yǎng)基木屑75g（浸出汁），葡萄糖20g，磷酸二氫鉀1.5g，硫酸鎂0.75g，蛋白胨2g，瓊脂20g，水1000mL。

附錄B（規(guī)范性）常用原種和栽培種培養(yǎng)基配方B.1配方1栗木屑80％，麩皮18%，石膏1％，蔗糖1％，含水量60％～63％。B.2配方2棉籽殼80％，麩皮18％，石膏1％，蔗糖1％，含水量60％～63％。B.3配方3闊葉樹木屑75％，麩皮18％，玉米粉5％，石膏1％，蔗糖1％，含水量60％～63％。B.4配方4雜木屑78％，麩皮20％，石膏1％，紅糖1％，含水量60％～63％。B.5配方5雜木屑40％，棉籽殼40％，麩皮10％，玉米粉8％，石膏1％，蔗糖1％，含水量60％～63％。

附錄C（規(guī)范性）常用搖瓶液體菌種培養(yǎng)基配方C.1配方1馬鈴薯（浸出汁）200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氫鉀1.0g，水1000mL。C.2配方2麩皮（浸出汁）35g，葡萄糖28g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，VB15mg，水1000mL。

附錄D（規(guī)范性）常用液體發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方D.1配方1玉米粉50g，麩皮20g，磷酸二氫