轉基因動物與生物反應器課件

第9章

轉基因動物與動物生物反應器1轉基因動物的培育技術2轉基因動物的應用3動物乳腺生物反應器09轉基因動物與生物反應器-HXY轉基因動物基因工程技術胚胎工程技術轉基因動物（transgenicanimal）是指借助基因工程技術將外源基因導入受體動物染色體內，外源基因與動物基因整合后隨細胞的分裂而擴增，在體內表達并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動物。轉基因動物09轉基因動物與生物反應器-HXY轉基因動物的命名原代轉基因動物:founderG0G1G2擬人化命名09轉基因動物與生物反應器-HXY1982年,Palmiter生產超級小鼠

世界上第一只轉基因動物:轉入了生長激素基因的巨鼠（supermouse）

09轉基因動物與生物反應器-HXY第一節(jié)：

轉基因動物的培育1目標基因克隆和體外重組2外源基因的導入3外源DNA整合、轉錄及表達的分子檢測4轉基因動物品系或品種的建立

09轉基因動物與生物反應器-HXY外源目的基因的制備外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞選擇獲得攜有目的基因的細胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉基因動物品系轉基因動物技術路線09轉基因動物與生物反應器-HXY哺乳動物生殖生理哺乳動物受精和妊娠，整個過程都在母畜體內進。09轉基因動物與生物反應器-HXY一轉基因哺乳動物的制備方法顯微注射法逆轉錄病毒載體感染胚胎干細胞介導法精子載體介導法YAC介導的基因轉移09轉基因動物與生物反應器-HXY1顯微注射法雄性原核09轉基因動物與生物反應器-HXY09轉基因動物與生物反應器-HXY受精卵顯微注射胚胎移植后定檢測顯微注射法操作流程09轉基因動物與生物反應器-HXY

a、轉移率較高、整合效率達30%；

b、外源基因長度可達50Kb；

c、方法簡單，導入過程直觀；顯微注射法的優(yōu)點09轉基因動物與生物反應器-HXYa、設備昂貴、操作復雜；b、隨機整合、首尾相連的多拷貝；c、常造成插入位點附近宿主DNA大片段缺失、重組等突變，出現動物嚴重生理缺陷；d、外源基因能否穩(wěn)定整合要到子一代中篩選得到。缺點09轉基因動物與生物反應器-HXY2．逆轉錄病毒載體感染法

原理：當逆轉錄病毒的RNA進入細胞后，逆轉錄成DNA，依靠逆轉錄病毒的整合酶及其末端特異的核苷酸序列，轉錄出的DNA可整合到染色體上，從而將其所攜帶的外源基因插入到染色體上。

09轉基因動物與生物反應器-HXY逆轉錄病毒載體09轉基因動物與生物反應器-HXY09轉基因動物與生物反應器-HXY

逆轉錄病毒感染法特點優(yōu)點：在各種轉基因方法中，逆轉錄病毒感染法的轉基因效率是最高的，且為單拷貝整合。缺點：逆轉錄病毒載體在設計時雖然缺失了病毒的復制功能序列，但是復制大量載體DNA所需的輔助病毒基因組內有可能與目的基因一起整合到同一細胞核中，就可能大量復制病毒，造成嚴重的污染，故不安全。此外，逆轉錄病毒載體容量有限，只能轉移小片段DNA（≦10kb），而且逆轉錄病毒長末端重復的甲基化狀態(tài)常使轉基因的表達缺失。09轉基因動物與生物反應器-HXY3胚胎干細胞法

胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）是從早期胚胎內細胞團（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細胞。它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細胞?？梢栽隗w外進行人工培養(yǎng)，擴增，并能以克隆的形式保存。09轉基因動物與生物反應器-HXY

胚胎干細胞法建立轉基因鼠的實驗程序09轉基因動物與生物反應器-HXY09轉基因動物與生物反應器-HXY與傳統(tǒng)育種方法相比較，ES細胞在生產轉基因動物方面表現其獨特的優(yōu)勢：

（1）打破了物種的界限，突破了親緣關系的限制，加快了動物群體遺傳變異程度；（2）可以進行定向變異和育種，利用同源重組技術對ES細胞進行遺傳操作，通過細胞核移植生產遺傳修飾性動物，有可能創(chuàng)造新的物種；（3）利用ES細胞技術，可在細胞水平對胚胎進行早期選擇，這樣可以提高選擇的準確性，縮短育種時間。近年來的研究表明，利用ES細胞生產轉基因動物在動物生產中發(fā)揮著極為重要的作用。09轉基因動物與生物反應器-HXY4精子載體法直接用精子作為外源DNA載體的轉移方法。主要問題：重復性不好09轉基因動物與生物反應器-HXY精子與外源DNA結合的機理精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以直接進入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉基因動物。后來Rottman對此方法進行了改進，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質體包埋，使脂質體與DNA相互作用形成脂質體——DNA復合物。這種復合體比較容易和精子細胞融合，從而進入細胞內。09轉基因動物與生物反應器-HXY5YAC介導的基因轉移酵母人工染色體（YAC）載體是近年來發(fā)展的新型載體，具有克隆百萬堿基對的大片段外源DNA能力。流程：ES轉染YAC后體外篩選→陽性ES細胞囊胚腔注射，或YAC原核微注射突出的優(yōu)點：保證大片段基因的完整性09轉基因動物與生物反應器-HXY6細胞核移植技術將體細胞移植技術(克隆動物)與轉基因技術結合，使轉基因的群體能迅速被克隆擴大，還能保證目的基因在克隆后代中的穩(wěn)定表達。優(yōu)點：后代100%全是轉基因個體，可以選擇后代性別，轉基因后代遺傳背景和穩(wěn)定性一致，不需選配，節(jié)省時間和費用。缺點：難度大，成功率低、胎兒成活率不高09轉基因動物與生物反應器-HXY第二節(jié)：

轉基因動物的應用（1）動物品種改良；（2）生物制藥(乳腺生物反應器)；（3）建立人類疾病的動物模型；（4）生產可移植用的動物器官；（5）基因治療(動物模型)；（6）基因打靶。09轉基因動物與生物反應器-HXY（1）動物品種改良抗病育種生長性狀09轉基因動物與生物反應器-HXY（2）生物制藥(乳腺生物反應器)

如荷蘭的GenPharm公司用轉基因牛生產乳鐵蛋白，預計每年從牛奶生產出來營養(yǎng)奶粉的銷售額是50億美元。09轉基因動物與生物反應器-HXY（3）建立人類疾病的動物模型

已建立的部分人類疾病的轉基因動物模型_____________________________________________疾病模型基因轉移方法轉導的基因______________________________________________________老年性癡呆征顯微注射β淀粉樣蛋白基因Ⅱ型糖尿病顯微注射胰島淀粉樣多肽基因β地中海貧血癥顯微注射人β珠蛋白基因鐮刀形細胞貧血癥顯微注射人α和β珠蛋白基因唐氏綜合癥顯微注射Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤反轉錄病毒轉染HIVtat基因成骨不全癥顯微注射突變的α1膠原蛋白前體基因自毀容貌癥ES細胞同源重組突變HGPRT基因_____________________________________________09轉基因動物與生物反應器-HXY4）生產可移植用的動物器官我國每年有150萬人需要器官移植，但是僅僅不到1萬人能夠得到供體。豬的臟器移植給人，會發(fā)生超急性排斥反應。轉基因技術生產能降低排斥反應的轉基因豬。Science(2002).295,1089–109209轉基因動物與生物反應器-HXY（5）基因治療

上世紀九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導致嚴重免疫缺損的四歲女孩，由美國國立衛(wèi)生研究院用ADA基因治愈?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜纾鸲эA，為保障人類健康展現了美好的前景。

09轉基因動物與生物反應器-HXY（6）基因打靶基因打靶(Genetargeting)是一種在胚胎干細胞(ES)技術和同源重組技術的基礎之上,定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段?；蛘先N方式：基因隨機插入基因敲除基因替換基因打靶09轉基因動物與生物反應器-HXY基因打靶的研究意義基因功能研究人類疾病動物模型的研制經濟動物遺傳物質的改良09轉基因動物與生物反應器-HXY胚胎干細胞介導的基因打靶技術首先獲得ES細胞系，利用同源重組技術獲得帶有研究者預先設計突變的中靶ES細胞。通過顯微注射將經過遺傳修飾的ES細胞引入受體胚胎內。經過遺傳修飾的ES細胞仍然保持分化的全能性，可以發(fā)育為嵌合體動物的生殖細胞，使得經過修飾的遺傳信息經生殖系遺傳。09轉基因動物與生物反應器-HXY09轉基因動物與生物反應器-HXY基因敲除的基本程序打靶載體的構建打靶載體導入ES細胞：重組置換基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種09轉基因動物與生物反應器-HXY基因打靶流程

09轉基因動物與生物反應器-HXY應用舉例：肌肉生長抑制素基因

Myostatin基因敲除Myostatin基因是一種特異性骨骼肌生長發(fā)育的抑制因子。該基因與動物骨骼肌總量的調節(jié)有關，其序列在進化過程中高度保守，所有哺乳動物和鳥類均有很高的同源性。Myostatin基因在功能上也是非常保守的，其功能的缺失會造成可導致肌肉異常肥大。09轉基因動物與生物反應器-HXY比利時藍牛肌肉增加表型

09轉基因動物與生物反應器-HXY皮埃蒙特牛肌肉增加表型

09轉基因動物與生物反應器-HXYMyostatin基因敲除“超級鼠”

09轉基因動物與生物反應器-HXY美培育轉基因鱒魚：腹肌有6塊,肉多15%

09轉基因動物與生物反應器-HXY09轉基因動物與生物反應器-HXY2007年生理學或醫(yī)學獎諾貝爾獎美國猶他大學Eccles人類遺傳學研究所科學家MarioR.Capecchi、美國北卡羅來納州大學教會山分校醫(yī)學院教授OliverSmithies與英國科學家卡迪夫大學卡迪夫生命科學學院MartinJ.Evans因胚胎干細胞和基因打靶研究獲得此獎項。09轉基因動物與生物反應器-HXY09轉基因動物與生物反應器-HXY第三節(jié)：

動物乳腺生物反應器一般把目的片段在器官或組織中表達的轉基因動物叫動物生物反應器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經過人為馴化為生物反應器,從生產的角度考慮，生物反應器選擇的組織和器官要方便產物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應器,動物血液生物反應器和動物膀胱生物反應器等。其中，轉基因動物乳腺生物反應器的研究最為引人注目。09轉基因動物與生物反應器-HXY1987年美國科學家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生產出一種醫(yī)用蛋白──tPA（組織型纖溶酶原激活物），展示了用動物乳腺生產高附加值產品的可能性。利用動物乳腺生產高價值產品的方式稱為乳腺生物反應器。09轉基因動物與生物反應器-HXY微生物反應器植物反應器動物反應器

(一)優(yōu)點1可以利用發(fā)酵工程技術大規(guī)模生產。2胞外活性物質制備容易。

（二）不足1哺乳動物或人類的基因往往不能表達。有些表達了，卻沒有活性，需要進一步修飾。2真核生物蛋白質翻譯后加工的精確性有限。3需要大型發(fā)酵設備和車間。4細菌發(fā)酵常形成不溶聚合物，使下游加工成本增加。

（一）優(yōu)點1可大規(guī)模種植，上游生產成本較低。作為食物可省去下游加工步驟。2轉基因植物自交后可得到穩(wěn)定遺傳的遺傳性狀。3可利用植物組織和細胞培養(yǎng)技術實現大量制備。

（二）不足1植物種植受季節(jié)、環(huán)境影響。2需專門的活性物質分離設備與技術。3植物細胞培養(yǎng)需要發(fā)酵罐等設備和技術支持，成本較高。

（一）優(yōu)點1易養(yǎng)殖，實現大規(guī)模制備。2通過乳腺和血液制備活性物質簡單易行。3可以通過動物細胞培養(yǎng)實現大量制備。

（二）不足1細胞培養(yǎng)需要昂貴的培養(yǎng)基和設備。2轉基因動物制備成本昂貴。3轉基因動物易產生一些倫理問題。

09轉基因動物與生物反應器-HXY1.動物乳腺生物反應器的制備（1）表達載體的構建目前用于表達載體的啟動子調控元件選用動物乳蛋白基因啟動子元件，主要有四類乳腺定位表達調控元件：第一類是B2乳球蛋白(BLG)，第二類是酪蛋白基因調控序列：第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調控序列；第四類是乳清白蛋白基因調控序列。09轉基因動物與生物反應器-HXY（2）目的基因的選擇選擇目的基因的基本要求是，正常情況下濃度低、翻譯后修飾復雜、其它表達體系難以表達或表達量低、應用前景廣闊的蛋白基因。09轉基因動物與生物反應器-HXY（3）體外重組選擇好目的基因和啟動子調控元件后進行體外重組，構建融合基因。（4）基因轉導將構建好的重組基因用基因轉導方法轉移到受精卵。09轉基因動物與生物反應器-HXY（5）胚胎移植利用胚胎移植技術將制備的轉基因受精卵植入待孕母體子宮內，生產轉基因動物，得到轉基因乳腺表達個體。通過采集轉基因動物的乳汁,來獲得目的基因表達產物。（6）鑒定轉基因動物乳腺生物反應器可以從分子水平和乳腺分泌物兩個方面進行鑒定。

09轉基因動物與生物反應器-HXY2.動物乳腺生物反應器的優(yōu)點產品質量穩(wěn)定產品成本低研制開發(fā)周期短無污染經濟效益顯著09轉基因動物與生物反應器-HXY3.動物乳腺生物反應器的應用高乳汁營養(yǎng)價值生產藥用蛋白患有龐普病的嬰兒體內一種可促進糖原質代謝的酶有缺陷。荷蘭研究人員培育出一種轉基因兔，兔奶中表達這種酶，因此飲用這種奶可以治療這種疾病。

09轉基因動物與生物反應器-HXY4.動物乳腺生物反應器存在的問題（1）外源基因在動物體內的位點整合問題（2）乳蛋白基因表達組織特異性問題（3）目的蛋白的翻譯后修飾問題（4）轉基因表達產物的分離和純化問題（5）轉基因的技術與方法問題（6）倫理道德問題09轉基因動物與生物反應器-HXY動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治療囊腫性纖維化綿羊組織型纖溶酶原活化因子治療血栓綿羊凝血VIII因子、IX因子治療血友病綿羊纖維蛋白原傷口愈合豬組織型纖溶酶原活化因子治療血栓豬凝血VIII因子、IX因子治療血友病山羊人蛋白質C治療血栓山羊抗血栓因子3治療血栓山羊谷氨酸脫羧酶治療I型糖尿病山羊Pro542治療愛滋病牛a-乳清白蛋白抗炎癥牛凝血VIII因子治療血友病牛纖維蛋白原傷口愈合牛膠原蛋白I,II組織修復,治療風濕性關節(jié)炎牛乳鐵蛋白治療腸道感染,感染性關節(jié)炎牛人血清白蛋白維護血液體積雞,牛,山羊單克隆抗體用于疫苗生產09轉基因動物與生物反應器-HXY前景轉基因動物制藥（乳腺生物反應器）是21世紀生物醫(yī)藥產業(yè)的一種新的藥物生產模式。美國紅十字會預測：到2010年，轉基因動物生產的商品將達到350億美元的銷售額，生產的藥物將占整個基因工程藥物的90%以上。09轉基因動物與生物反應器-HXY研