植物工廠化育苗教學(xué)課件 5離體快繁的操作步驟和程序

離體快繁的操作步驟和程序——植物工廠化育苗離體快繁成苗到室外植物的操作程序（1）無菌培養(yǎng)體系的建立----啟動培養(yǎng)-初代培養(yǎng)（2）不定芽的增殖培養(yǎng)---繼代接種及繼代培養(yǎng)（3）不定根的誘導(dǎo)-生根培養(yǎng)（4）試管苗馴化移栽初代培養(yǎng)無菌培養(yǎng)體系的建立----啟動培養(yǎng)（1）無菌培養(yǎng)體系的建立—

啟動培養(yǎng)—初代培養(yǎng)階段從外植體選擇、清洗、滅菌、接種和莖芽誘導(dǎo)，到獲得莖芽穩(wěn)定生長和增殖，莖芽繁殖數(shù)量可控制的整個時期外植體：

植物組織培養(yǎng)的起始材料。從自然界環(huán)境狀態(tài)中，植物體上切取下來的器官，組織等。首次用于組培過程的植物材料，是組培工作的第一步。

對于外植體接種到培養(yǎng)基中之后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)室進行最初階段的組培培養(yǎng)—

初代培養(yǎng)過程。

目標(biāo)：獲得穩(wěn)定的無菌無性培養(yǎng)材料，誘導(dǎo)芽發(fā)生，提供合適試管苗環(huán)境使培養(yǎng)物生長達到穩(wěn)定。

無菌苗：無菌條件下，用于試管內(nèi)繼代增殖的植物材料稱完無菌母株或繁殖母株。得到無菌苗工作任務(wù)：外植體的滅菌在一定濃度的滅菌劑藥品中浸泡滅菌，藥劑滅菌的好壞關(guān)系成功率。注意：植物材料（老幼程度）、滅菌劑類型、濃度、滅菌時間四者統(tǒng)一考慮。不同藥品分別做兩次滅菌。每次時間比正常一次藥品滅菌浸泡時間短。（2）不定芽增殖培養(yǎng)–繼代培養(yǎng)

中間繁殖體：

通過初代培養(yǎng)所獲得的不定芽、莖段、胚狀體或原球莖等無菌材料叫中間繁殖體系繼代培養(yǎng)：繼代接種：對于中間繁殖體進行切割分離并接種轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基叫繼代接種繼代培養(yǎng)：初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁培養(yǎng)過程（增殖培養(yǎng)）繼代目的：擴繁中間繁殖體系的數(shù)量，最后能達到邊繁邊生根的目的。

促進培養(yǎng)物分化培養(yǎng)，反復(fù)繼代增殖，達到需要的數(shù)量。

芽增殖速度快，慢，多少的的關(guān)鍵是培養(yǎng)基（適宜外源激素種類和濃度配比及其重要）

細胞分裂素影響繁殖系數(shù)和不定芽的質(zhì)量。

①切割莖段：

針對有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物進行切割（至少保證一個節(jié)間帶一個芽，節(jié)間短可以2，3節(jié)切割為一段）

能保持母種特性，簡便易行繼代苗如何切割進行繼代接種？②分離芽叢：

適于由愈傷組織生出的芽叢

先切成芽叢小塊，接到分化培養(yǎng)基中，待稍大時再繼續(xù)培養(yǎng)。③分離原球莖等

切割成小塊

，轉(zhuǎn)移到新鮮增殖培養(yǎng)基。

蘭花最初每個莖尖或側(cè)芽大約2個月左右產(chǎn)生3-5個原球莖，然后每個再切成4-6塊，每一塊在1個月內(nèi)可產(chǎn)生3-5個原球莖。

1960年Morel發(fā)現(xiàn)把蘭花莖進行離體培養(yǎng)時，它們不是長成帶葉的苗，而是形成一個扁形球狀物，其基部生有假根，在形態(tài)上與種子萌發(fā)時由胚形成的原球莖相似，這種扁形球狀物后來也稱為原球莖。如何提高繼代苗繁殖速度：培養(yǎng)基：培養(yǎng)基種類、無機有機成分、糖濃度、瓊脂、生長調(diào)節(jié)劑種類濃度。（生長素比例大，不定芽生長健壯；細胞分裂素高，繁殖系數(shù)高芽分化率高，但組培苗弱，綜合權(quán)衡）-莖節(jié)過弱的情況可以進行壯苗即降低細胞分裂素，加強生長素濃度。培養(yǎng)條件：溫度、光照、濕度、培養(yǎng)器皿、通氣狀況、PH值都與增殖有關(guān)。盡量滿足培養(yǎng)物的需要，使其以最快速度生長。高溫光照合適濕度。培養(yǎng)物保存：暫時不需要育苗或珍貴資源需要保存采用較低的溫度低溫1-9°c

短期保存------可以使繁殖速度降下來，不用經(jīng)常進行接種更換培養(yǎng)基。

注意問題

芽增殖過程中，注意外源激素在組培苗體內(nèi)的積累---空白培養(yǎng)基培養(yǎng)。長期繼代增殖，外源激素大量積累會造成各種畸形芽莖，或玻璃化苗。影響不定芽質(zhì)量。繼代培養(yǎng)中需要酌情降低外援激素水平。各階段接種所基于的植物材料初代接種基于---外植體材料（外界采集經(jīng)過預(yù)處理劑滅菌）繼代培養(yǎng)材料基于—已經(jīng)啟動脫分化，并啟動分化模式，從外植體上形成芽及莖段的植株---中間繁殖體（培養(yǎng)室）生根培養(yǎng)材料基于--已經(jīng)擴繁達到生產(chǎn)要求數(shù)量后的繼代無根芽苗進行生根培養(yǎng)初代組培苗：一個莖段帶有一個腋芽大概1厘米高左右已進行啟動狀態(tài)的外植體，會出現(xiàn)再分化形成了新芽。或者切口脫分化形成愈傷組織繼代苗：芽多側(cè)枝多，一定高度的大量無根芽苗叢苗狀態(tài)生根階段生根組培苗，明顯的根，一般以單顆苗形式進行組培并誘導(dǎo)生根區(qū)分各階段組培狀態(tài)為什么繼代組培苗無根？從繼代培養(yǎng)的目–增殖芽—芽，莖段—再增殖芽培養(yǎng)基中激素調(diào)節(jié)的方向，激素的作用

繼代苗能否持續(xù)繼代下去無限制的運行下去，繼代培養(yǎng)次數(shù)過多易發(fā)生變異。應(yīng)該使部分培養(yǎng)物分流到壯苗生根階段。若不能及時將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，就會使久不轉(zhuǎn)移的試管苗發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多，影響移栽成活率，而造成人、財、物的極大浪費。

繼代培養(yǎng)組培苗瘦弱徒長問題現(xiàn)象：繼代培養(yǎng)組培苗在不斷增殖的過程中出現(xiàn)芽苗瘦弱、徒長、節(jié)間過長等現(xiàn)象，這種苗即便生根培養(yǎng)，移栽成活，抵抗力也比較弱。原因：1.細胞分裂素濃度過高。產(chǎn)生過多，密集的不定芽，不及時切割繼續(xù)繼代-------瘦弱苗。2.培養(yǎng)溫度過高。高溫利于組培苗的生長，多數(shù)品種適宜的溫度是25℃左右，在過高的溫度條件下，苗木的伸長速度快。有節(jié)間的品種如香石竹、滿天星、菊花等，組培苗-----瘦弱。無節(jié)間種類如非洲菊、勿忘我、情人草主要是葉片變薄、變長。3.光照時長不足組培苗會變黃、變?nèi)?、變細并加速生長，使苗在短時間內(nèi)變得更瘦弱。解決辦法1、根據(jù)品種特點減少細胞分裂素用量，加速繼代轉(zhuǎn)瓶的速度，適當(dāng)降低接種密度。2、利用空調(diào)降低培養(yǎng)室溫度。3、提高光照強度和延長光照時間，充分利用較強的自然光做光源，調(diào)整擺放位置和密度。4、調(diào)整培養(yǎng)基硬度，改用透氣膜做封口，進行培養(yǎng)基及環(huán)境因子的綜合調(diào)控，力求獲得最優(yōu)質(zhì)健壯的組培瓶苗。

了解植物組織培養(yǎng)苗生根的目的和意義。了解影響生根的因素。掌握培養(yǎng)壯苗的方法。掌握植物組織培養(yǎng)苗的生根培養(yǎng)的基本方法步驟。生根培養(yǎng)基配制的原則和注意事項生根培養(yǎng)試管苗的生根培養(yǎng)：使無根芽苗生根從而形成完整植株的過程。

只達到生根就可以了嗎？生根培養(yǎng)目的是組培苗生根，

而生根目的在于組培苗具有完整植物器官后，能夠從組培瓶的生長環(huán)境順利轉(zhuǎn)栽到自然環(huán)境狀態(tài)。適應(yīng)環(huán)境（足夠抵抗力抵抗自然界雜菌；適應(yīng)各種逆境，如溫度的變化，濕度變化（組培瓶內(nèi)的環(huán)境是恒常的）生根培養(yǎng)的目的（1）為了中間繁殖體生出濃密而粗壯的不定根。（2）提高試管苗對外界環(huán)境的適應(yīng)力，使試管苗能成功地移栽到試管外，獲得更多高質(zhì)量的商品苗。影響因素1.植物材料不同植物種類、不同的基因型、同一植株的不同部位和不同年齡對根的形成和分化具有重要作用。規(guī)律：木本植物較草本植物難，成年樹較幼年樹難，喬木較灌木難。扦插生根容易的植物，試管苗生根也容易；相反，扦插生根困難的植物，試管苗生根也難。例如：核桃樹、柿樹等扦插生根較困難，則試管苗也難以生根。有些試管苗由于在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時間過長，莖木質(zhì)化程度高，形成老苗，這類苗也很難生根。而生長旺盛幼嫩的試管苗則容易誘導(dǎo)生根。一般誘導(dǎo)生根所需要的溫度比分化增殖的溫度低。

低溫，質(zhì)量好而且根的數(shù)量也比較適宜。低于15℃影響根的分化和生長。

在生根培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，可以為生根創(chuàng)造一個暗的環(huán)境，而且還能吸附一些有毒物質(zhì)，使根不易褐變，有利于根的生長。對于大多數(shù)植物來說，光照并不抑制根原基的形成和根的正常生長，因此誘導(dǎo)生根普遍在光照下進行。如果不容易生根的植物嘗試暗培養(yǎng)。培養(yǎng)基中豐富營養(yǎng)使試管苗產(chǎn)生依賴性而不容易生根

。減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的含量可以刺激生根。異養(yǎng)狀態(tài)------自養(yǎng)狀態(tài)

MS、B5等培養(yǎng)基，都可用于誘導(dǎo)生根，但是其含鹽濃度要適當(dāng)降低，都富含N、P、K鹽，均抑制根的生長。應(yīng)將它們分別降低到1/2、1/3和1/4如：無籽西瓜在1/2MS時生根較好；硬毛獼猴桃在1/3MS時生根較好；月季的莖段在1/4MS時生根較好；水仙的小鱗莖則在1/2MS時才能生根。鈣、微量元素中的硼和鐵，維生素維生素B6、維生素Bl均有利于生根；肌醇對生根作用不大，有時甚至起抑制作用。繼代培養(yǎng)MS+BA2+IBA0.2生根培養(yǎng)1/2ms+IBA1

糖的濃度對試管苗生根影響低濃度糖有利于試管苗的生活方式由異養(yǎng)向自養(yǎng)轉(zhuǎn)變，提高生根苗的移栽成活率。生根培養(yǎng)基中糖的含量要比繼代培養(yǎng)基中減少一半或更多。繼代培養(yǎng)試管嫩莖（芽苗）一般隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，其生根能力有所提高。如：蘋果試管嫩莖繼代培養(yǎng)的次數(shù)越多則生根率越高，富士蘋果在前6代之內(nèi)生根率低于30％，生根苗的平均根數(shù)不足2條，繼代次數(shù)的增加，到第10代時生根率達80％，12代以后則生根率達到95％以上；杜鵑莖尖培養(yǎng)中，隨培養(yǎng)次數(shù)的增加，小插條生根數(shù)量明顯增加，第四代最高，最后達100％的生根。生長素類藥品促進生根NAA>IBA>IAA，2，D用愈傷組織誘導(dǎo)

IBA作用強烈，作用時間長，誘導(dǎo)的根多而長，適用于木本植物IAA誘導(dǎo)出的根比較細長，適用于草本植物

難生根的IBA與IAA交替使用兩種生長素，效果可能會好些。NAA誘導(dǎo)出的根比較短粗。IBA、NAA0.1、1.0mg/L有利于生根，兩者可混合使用，高濃度生長素促使根向短粗方向發(fā)展，但超過一定限度，則加速形成愈傷組織，影響根的形成與生長。

細胞分裂素細胞分裂素對生長素有拮抗作用，從而對根的生長具有抑制作用，生根培養(yǎng)基中一般不加細胞分裂素。壯苗長期多次的繼代培養(yǎng)，高濃度的細胞分裂素使芽分化速度加快芽小而密，生長極其緩慢。

芽在轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基前，首先要轉(zhuǎn)到細胞分裂素偏低或沒有細胞分裂素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1、3代，待芽苗長得粗壯時，再轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，這樣提高了苗的質(zhì)量。生根培養(yǎng)基配制原則（1）降低繼代培養(yǎng)基中無機鹽的濃度。一般MS大量母液減半或1／4；（無機鹽，尤其硝態(tài)鹽，銨態(tài)鹽抑制根分化）（2）去掉原培養(yǎng)基中細胞分裂素成份；（3）降低蔗糖濃度（如減半）（減少碳源，減少養(yǎng)分加強自養(yǎng)，培養(yǎng)根發(fā)生）（4）適當(dāng)濃度的生長素；（4）適當(dāng)增加瓊脂濃度；（5）對有些植物可適當(dāng)加些吸附劑（如活性炭），有促進生根的作用。

生根培養(yǎng)的方法新梢達到3cm以上時切除基部愈傷組織，分株成單棵的形式：1、將新梢基部浸入50mg/L或100mg/LIBA溶液中處理4-8h，誘導(dǎo)根原基的形成，再轉(zhuǎn)移至無植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上促進幼根的生長。2、在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6d，待有根原基形成后，再進一步培養(yǎng)3、直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。

上述三種方法均能誘導(dǎo)出新根，但前兩種方法對新根的生長發(fā)育更為有利，而第三種方法對幼根的生長有抑制作用，其原因是當(dāng)根原基形成后，較高濃度生長素的繼續(xù)存在不利于幼根的生長發(fā)育。轉(zhuǎn)接方法

芽叢縱向切成單株，高度在1cm長以上的芽苗可進行生根培養(yǎng)（不足1cm的芽苗及愈傷組織用于繼代培養(yǎng)）。單顆植株、繼代方式切割

。

將分離得到的單株植物的基部愈傷組織切掉（如果留下，根將在愈傷組織里增殖），然后按形態(tài)上下極插入生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。生根苗可以較密集的插在培養(yǎng)基中，每瓶可插10株以上。少數(shù)難生根植物（1）濾紙橋培養(yǎng)（液體）：

采用粗試管加液體培養(yǎng)基，并在試管中放置濾紙做的筒狀物（濾紙橋），托住切成單條的嫩枝，濾紙橋略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)嫩枝的水、營養(yǎng)成分和生長素等，解決生根時氧氣不足的問題，從而誘導(dǎo)出新根，可使生根過程加速，如山茶花、香石竹等花卉試管苗的生根培養(yǎng)。（2）分次培養(yǎng)：

對于少數(shù)因為多次繼代殘留過多的細胞分裂素而難以生根的植物，可先在不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中過渡培養(yǎng)一次，再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進行生根的進一步培養(yǎng)。

對于一些生長細弱的植物，采用不加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基進行一次壯苗培養(yǎng)，可適當(dāng)加入少許矮壯素，以促使幼苗粗壯，便于誘導(dǎo)生根和以后的種植。

由胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先即己分化的根，可以不經(jīng)過誘導(dǎo)生根階段。但由于經(jīng)過胚狀體發(fā)育的苗數(shù)比較多，且個體較小，所以常需要低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。試管外生根所謂試管外生根，就是將植物組織培養(yǎng)中莖芽的生根誘導(dǎo)階段同培養(yǎng)階段結(jié)合在一起，直接將莖芽扦插到試管外的有菌環(huán)境中，省去了用來提供營養(yǎng)物質(zhì)并起支持作用的培養(yǎng)基，簡化了植物組織培養(yǎng)程序，降低了成本，提高了繁殖系數(shù)。適合范圍1、容易生根的試管苗，如菊花、楊樹，櫻桃、康乃馨、月季、無籽西瓜等，可以不經(jīng)過瓶內(nèi)生根而直接從試管中取出進行瓶外生根。2、試管內(nèi)生根質(zhì)量差，根和莖之間的維管束連接不好，或者沒有須根和根毛，直接影響移栽成活率。3、很多植物可以把試管繁殖的嫩枝當(dāng)做微型插條，直接插入基質(zhì)中生根成活，如將楊樹、樺木和其他闊葉樹試管繁殖的嫩梢，直接栽入泥炭和蛭石基質(zhì)中，可很快生根，且成活率較高。試管外生根的優(yōu)點瓶外生根苗避免了根系附著的瓊脂造成的污染腐爛。根系發(fā)育正常健壯，根與莖芽的輸導(dǎo)系統(tǒng)相通，吸收功能較強，并且試管苗瓶外生根在生根過程中即己逐步適應(yīng)了環(huán)境，經(jīng)受了自然環(huán)境的鍛煉，不適應(yīng)環(huán)境的弱苗在生根過程中己經(jīng)被淘汰，移栽苗都是抗逆性強的壯苗，容易成活。瓶外生根方法（1）誘導(dǎo)出根源基后再扦插

將繼代叢生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可插的密些，培養(yǎng)十天左右可見嫩莖基部明顯產(chǎn)生根源基時取出，移栽到事先準(zhǔn)備好的穴盤里進行培養(yǎng)。瓶外生根方法（2）生長素處理法

將無根的試管苗取出后，用生長素溶液浸泡一小時或蘸生根粉后進行扦插。用生長素濃度一般比誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基大10倍左右。