新版高中生物第3章　第2節(jié)　基因工程的基本操作程序

第2節(jié)基因工程的基本操作程序?qū)W習(xí)目標(biāo)1.概述基因工程的基本操作程序。2.說明利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的基本過程。3.理解基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)和各部分的作用及基因表達(dá)載體的構(gòu)建。4.舉例說明獲取目的基因的途徑,目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法、檢測與鑒定目的基因的方法。一、基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。4.目的基因的檢測與鑒定。二、目的基因的篩選與獲取1.目的基因:用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因,如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生物制藥、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。2.篩選合適的目的基因(1)從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。(2)應(yīng)用測序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫、序列比對工具等認(rèn)知更多的基因結(jié)構(gòu)和功能,以便找到合適的目的基因。3.獲取目的基因的途徑(1)人工合成目的基因;(2)構(gòu)建基因文庫獲取目的基因;(3)PCR獲取目的基因。4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)PCR的目的:在體外對目的基因的核酸序列進(jìn)行大量復(fù)制。(2)PCR原理:DNA半保留復(fù)制。(3)PCR條件:一定的緩沖溶液、DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。(4)每次循環(huán)的過程:變性→復(fù)性→延伸。①變性:加熱至90℃以上時,雙鏈DNA解聚為單鏈。②復(fù)性:冷卻至50

℃左右時,兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。③延伸:加熱至72℃左右時,4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。(5)特點(diǎn):上一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為下一輪反應(yīng)的模板,每一次循環(huán)后,目的基因的量可以增加一倍,即成指數(shù)形式擴(kuò)增(約為2n,n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))。(6)鑒定:常用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。①DNA分子具有可解離的基團(tuán),在一定的pH下,這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動,這個過程就是電泳。②在瓊脂糖凝膠電泳時,DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。③凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。預(yù)習(xí)反饋1.判斷正誤。(1)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)。(×)(2)用PCR方法擴(kuò)增目的基因時不必知道基因的全部序列。(

√)(3)PCR體系中一定要添加從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶。(×)2.下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法,錯誤的是(

)A.PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)B.PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制C.利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列D.PCR擴(kuò)增中需要解旋酶解開雙鏈DNA答案D解析PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù),其原理是DNA半保留復(fù)制,A項(xiàng)和B項(xiàng)正確;利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物,C項(xiàng)正確;PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA受熱變性后解聚為單鏈,不需要解旋酶解開雙鏈DNA,D項(xiàng)錯誤。三、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代,同時,使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的組成

3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程一般用同種或能產(chǎn)生相同末端的限制酶分別切割載體和目的基因,再用DNA連接酶把兩者連接,形成一個重組DNA分子(如下圖)。預(yù)習(xí)反饋1.判斷正誤。(1)表達(dá)載體的復(fù)制和目的基因的表達(dá)均啟動于復(fù)制原點(diǎn)。(×)(2)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子上游或終止子的下游才能進(jìn)行表達(dá)。(×)(3)

基因表達(dá)載體中需要含有起始密碼、終止密碼、目的基因、標(biāo)記基因。(×)(4)借助抗生素抗性基因可將含目的基因的受體細(xì)胞篩選出來。(√)2.下列有關(guān)人胰島素基因表達(dá)載體的敘述,正確的是(

)A.表達(dá)載體中的胰島素基因可通過人肝細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得B.表達(dá)載體的復(fù)制開始于啟動子C.胰島素基因必須插入啟動子與終止子之間D.啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用答案C解析由于人肝細(xì)胞中胰島素基因不能表達(dá),所以無法利用肝細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得胰島素基因,A項(xiàng)錯誤;表達(dá)載體的復(fù)制啟動于復(fù)制原點(diǎn),B項(xiàng)錯誤;胰島素基因必須插入啟動子與終止子之間,C項(xiàng)正確;啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,是轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn),而終止密碼子位于mRNA上,在翻譯中起作用,D項(xiàng)錯誤。四、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.導(dǎo)入植物細(xì)胞(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。利用農(nóng)桿菌細(xì)胞中Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移DNA)能夠轉(zhuǎn)移并整合到侵染細(xì)胞的染色體DNA上的特點(diǎn),將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中,通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用,可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。(2)花粉管通道法。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。②在植物受粉后的一段時間內(nèi),剪去柱頭,將DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入囊胚。2.導(dǎo)入動物細(xì)胞(受精卵)顯微注射技術(shù)。3.導(dǎo)入微生物細(xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞,使受體細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。預(yù)習(xí)反饋1.判斷正誤。(1)目的基因?qū)胫参锛?xì)胞一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(√)(2)為培育抗除草劑的作物新品種,導(dǎo)入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體。(×)(3)常用卵細(xì)胞作為培育轉(zhuǎn)基因動物的受體細(xì)胞。(×)2.(多選)下圖為科學(xué)家通過基因工程培育抗蟲棉時,從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲基因“放入”棉花細(xì)胞中與棉花的DNA分子“結(jié)合起來”而發(fā)揮作用的過程示意圖。以下相關(guān)說法正確的是(

)A.圖中Ⅰ是質(zhì)粒,步驟①需要用到限制酶和DNA聚合酶B.圖中Ⅱ是含目的基因的重組質(zhì)粒,步驟②是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入棉花細(xì)胞C.圖中Ⅲ是農(nóng)桿菌,通過步驟③將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞D.剔除培育成功的抗蟲棉體內(nèi)的四環(huán)素抗性基因不會影響抗蟲基因的表達(dá)答案CD解析Ⅰ為質(zhì)粒,步驟①為基因表達(dá)載體的構(gòu)建,需要用到限制酶和DNA連接酶,A項(xiàng)錯誤;圖中步驟②是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞,B項(xiàng)錯誤;圖中步驟③是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,C項(xiàng)正確;基因的表達(dá)具有一定的獨(dú)立性,剔除抗蟲棉體內(nèi)的四環(huán)素抗性基因不影響抗蟲基因的表達(dá),D項(xiàng)正確。五、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測(1)檢測目的基因是否插入受體細(xì)胞的DNA中。(2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。(3)檢測目的基因是否翻譯出相應(yīng)蛋白質(zhì),通常用抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交。2.個體生物學(xué)水平的鑒定(1)通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。(2)通過相應(yīng)病原微生物感染生物來確定相應(yīng)抗病基因是否賦予了受體生物抗病特性以及抗性的程度。預(yù)習(xí)反饋1.判斷正誤。(1)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測。(×)(2)抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)。(√)(3)檢測目的基因是否插入受體細(xì)胞的DNA中,可用抗原—抗體雜交技術(shù)。(×)2.下列判斷抗蟲基因是否成功轉(zhuǎn)入棉花基因組的方法中,不屬于分子檢測的是(

)A.通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡B.檢測棉花基因組DNA與DNA探針能否形成雜交帶C.檢測棉花細(xì)胞中mRNA與DNA探針能否形成雜交帶D.檢測棉花細(xì)胞中的蛋白質(zhì)能否與特定抗體形成雜交帶答案A解析A項(xiàng)屬于個體水平的鑒定,不是分子檢測。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四目的基因的篩選與獲取情境導(dǎo)引巴西等拉美國家深受致倦庫蚊的危害。致倦庫蚊可攜帶多種病毒和寄生蟲,能夠傳播腦炎、絲蟲等傳染病,而這些傳染病常年在拉美國家肆虐。為了抑制疾病的傳播,科學(xué)家培育出了一種轉(zhuǎn)基因雄性致倦庫蚊。科學(xué)家在雄性致倦庫蚊體內(nèi)植入一種特殊基因,當(dāng)具有該基因的雄蚊與野生雌蚊交配時,這種基因可以進(jìn)入雌蚊的基因組,并使雌蚊死亡,從而達(dá)到減少該種蚊子的數(shù)量,抑制疾病傳播的目的。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四請討論回答下列問題。1.該項(xiàng)研究的目的基因是什么?其作用是什么?提示植入雄性致倦庫蚊體內(nèi)的一種特殊基因是該項(xiàng)研究的目的基因。該基因可以進(jìn)入雌蚊的基因組,并使雌蚊死亡,從而減少該種蚊子的數(shù)量,抑制疾病傳播。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.根據(jù)PCR獲取和擴(kuò)增目的基因的反應(yīng)條件,完善表格。

條

件作

用在一定的緩沖液中進(jìn)行提供相對穩(wěn)定的

環(huán)境

合成DNA子鏈的原料DNA母鏈

催化合成DNA子鏈

與DNA母鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合答案pH

4種脫氧核苷酸提供DNA復(fù)制的模板耐高溫的DNA聚合酶引物探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四3.PCR反應(yīng)的過程

答案變性解旋復(fù)性堿基互補(bǔ)配對延伸5'端向3'端延伸

探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四歸納提升1.PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項(xiàng)目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細(xì)胞核內(nèi)PCR擴(kuò)增儀(PCR儀)酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度,在不同溫度下進(jìn)行結(jié)果合成整個DNA分子擴(kuò)增特定的DNA片段或基因聯(lián)系(1)模板:均需要脫氧核苷酸單鏈作為模板(2)原料:均為4種脫氧核苷酸(3)酶:均需DNA聚合酶(4)引物:都需要引物,使DNA聚合酶從引物開始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.PCR反應(yīng)中應(yīng)注意的問題(1)PCR設(shè)計(jì)的引物序列長度一般介于20~30個核苷酸,若引物序列太長會使擴(kuò)增效率降低,而引物太短又容易導(dǎo)致異常DNA的產(chǎn)生。(2)PCR技術(shù)通過高溫加熱使雙鏈DNA解旋,該過程不需要解旋酶的參與。雙鏈DNA在高溫下解鏈的現(xiàn)象稱為DNA的變性,在降溫時,雙鏈可以重新形成,所以DNA的熱變性是可逆的。(3)PCR擴(kuò)增時,復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度的設(shè)定主要與引物的長度和堿基組成中G—C比例呈正相關(guān)。如果復(fù)性溫度太高,引物無法與模版鏈結(jié)合,無法進(jìn)行DNA復(fù)制,PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物。(4)DNA聚合酶從引物的3'端開始拼接單個的脫氧核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四3.目的基因獲取方法的選擇(1)PCR擴(kuò)增。必須有目的基因上一段已知序列,以便設(shè)計(jì)引物。(2)人工合成。目的基因片段小,序列已知。(3)基因文庫中獲取。目的基因序列未知。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四典例剖析(多選)以下為逆轉(zhuǎn)錄過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖。據(jù)圖分析,下列說法正確的是(

)A.催化①過程的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶B.④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合C.催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶D.如果RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%,則一個雙鏈DNA中,A與U之和也占該DNA堿基含量的40%探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四答案ABC解析由題意可知,①②③④⑤分別表示的過程是逆轉(zhuǎn)錄、DNA的復(fù)制、DNA解鏈、引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈、DNA子鏈的合成,B項(xiàng)正確;①過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化完成,A項(xiàng)正確;催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶,C項(xiàng)正確;在DNA分子中有T無U,D項(xiàng)錯誤。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四活學(xué)活練1.下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述,錯誤的是(

)A.PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),利用其可獲取大量目的基因B.PCR的原理是DNA半保留復(fù)制,可以在儀器中自動完成C.PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時要知道目的基因的部分序列D.PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時必須用解旋酶解開雙鏈DNA答案D解析PCR

即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),利用其可獲取大量目的基因,A項(xiàng)正確;PCR

的原理是

DNA

半保留復(fù)制,可以在儀器(PCR儀)中自動完成,B項(xiàng)正確;PCR

技術(shù)擴(kuò)增目的基因時要知道目的基因的部分序列,以便設(shè)計(jì)引物,C項(xiàng)正確;PCR

技術(shù)擴(kuò)增目的基因時用高溫解開雙鏈

DNA,D項(xiàng)錯誤。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.PCR技術(shù)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,利用該方法可以使目的基因迅速擴(kuò)增,其簡要過程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述,錯誤的是(

)A.PCR和體內(nèi)DNA復(fù)制都需要模板、能量B.由PCR的反應(yīng)過程可知,與氫鍵相比,磷酸二酯鍵對高溫的穩(wěn)定性更強(qiáng)C.PCR和體內(nèi)DNA復(fù)制都要消耗4種脫氧核苷酸和2種引物D.PCR反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四答案C解析PCR技術(shù)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),以極少量DNA為模板,復(fù)制出大量DNA,與體內(nèi)DNA復(fù)制一樣,都需要模板和能量,A項(xiàng)正確;由PCR的反應(yīng)過程可知,高溫使雙鏈DNA解鏈,破壞的是堿基間的氫鍵,而沒有破壞磷酸二酯鍵,則磷酸二酯鍵對高溫的穩(wěn)定性更強(qiáng),B項(xiàng)正確;PCR和體內(nèi)DNA復(fù)制都要消耗4種脫氧核苷酸,PCR是先解旋后復(fù)制特定DNA序列,需2種引物,而細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是邊解旋邊復(fù)制,則需多種引物,C項(xiàng)錯誤;PCR反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板,繼續(xù)合成子代DNA片段,D項(xiàng)正確。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四基因表達(dá)載體的構(gòu)建情境導(dǎo)引游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),一般會直接被分解,就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì),游離DNA也無法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制,導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有該游離DNA。若游離的DNA整合至細(xì)胞的染色體DNA上,或以一種形式在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立穩(wěn)定存在,能自我復(fù)制,則該游離DNA上的基因會隨細(xì)胞分裂傳遞給子細(xì)胞或子代。請討論回答下列問題。1.通過PCR技術(shù)獲取足夠量的目的基因后,能夠直接導(dǎo)入受體細(xì)胞嗎?為什么?提示不能。若將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞,目的基因可能被受體細(xì)胞分解或無法隨細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制,不能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.基因表達(dá)載體的基本組成有哪幾部分?提示目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等。3.標(biāo)記基因的作用是什么?常用什么基因來作標(biāo)記基因?提示標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因,從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用抗性基因作為標(biāo)記基因。4.培育轉(zhuǎn)基因生物的核心工作是什么?構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是什么?提示培育轉(zhuǎn)基因生物的核心工作是基因表達(dá)載體的構(gòu)建。構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的:(1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代;(2)使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四歸納提升1.構(gòu)建基因表達(dá)載體時限制酶的選擇技巧探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇PstⅠ;②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶,如圖甲不能選擇SmaⅠ;③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,如圖甲也可選擇用Pst

Ⅰ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn))根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致,以確保產(chǎn)生相同的黏性末端;②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等,所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu),如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標(biāo)記基因;③如果所選酶的切割位點(diǎn)不止一個,則切割重組后可能丟失某些片段,若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū),則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能進(jìn)行復(fù)制探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.啟動子、終止子與起始密碼子、終止密碼子的區(qū)別

項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基位置基因上游基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄翻譯的起始點(diǎn)終止翻譯探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四易錯提醒

基因表達(dá)載體易錯點(diǎn)剖析(1)基因工程中的基因表達(dá)載體不等同于載體。基因表達(dá)載體與載體相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的。目的基因應(yīng)插入啟動子和終止子之間的部位,若目的基因插入啟動子部位,目的基因?qū)o法表達(dá)。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四典例剖析如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物,進(jìn)而生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說法錯誤的是(

)探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四A.圖示過程是基因工程的核心步驟B.表達(dá)載體構(gòu)建時需要用到限制酶SmaⅠC.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來D.除圖示組成外,表達(dá)載體中還應(yīng)該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)答案B解析圖示過程為基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程,是基因工程中的核心步驟,A項(xiàng)正確;構(gòu)建表達(dá)載體過程中需要將目的基因完整切割下來,此時要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ,B項(xiàng)錯誤;抗卡那霉素基因是標(biāo)記基因,目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細(xì)胞,C項(xiàng)正確;基因表達(dá)載體應(yīng)包括啟動子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因等結(jié)構(gòu),D項(xiàng)正確。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四活學(xué)活練1.下列有關(guān)抗蟲基因表達(dá)載體的敘述,正確的是(

)A.切割含抗蟲基因的DNA片段和載體必須用同一種限制酶B.抗蟲基因表達(dá)載體中要有啟動子和終止密碼子C.抗蟲基因表達(dá)載體必須具備標(biāo)記基因,其作用是篩選含有目的基因的受體細(xì)胞D.抗蟲基因的表達(dá)啟動于復(fù)制原點(diǎn)探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四答案C解析切割含抗蟲基因的DNA片段和載體可以用不同的限制酶,只要切割出的切口末端相同即可,A項(xiàng)錯誤;抗蟲基因表達(dá)載體必須具備啟動子和終止子,終止密碼子位于mRNA上,B項(xiàng)錯誤;基因表達(dá)載體必須具備標(biāo)記基因,其作用是用于檢測目的基因是否導(dǎo)入到受體細(xì)胞中,從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來,C項(xiàng)正確;抗蟲基因的表達(dá)開始于啟動子,D項(xiàng)錯誤。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.圖甲、乙中的箭頭表示限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn),ampr表示氨芐青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列敘述正確的是(

)A.圖甲中的質(zhì)粒用BamHⅠ切割后,含有4個游離的磷酸基團(tuán)B.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,可用Pst

Ⅰ和BamHⅠ切割質(zhì)粒和外源DNAC.用Pst

Ⅰ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNA,可以保證重組DNA序列的唯一性D.導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四答案C解析圖甲中的質(zhì)粒用BamHⅠ切割后,獲得一個DNA片段,其只含有2個游離的磷酸基團(tuán),A項(xiàng)錯誤;在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,不能使用BamHⅠ切割外源DNA,因?yàn)橛肂amHⅠ會破壞目的基因的結(jié)構(gòu),但可以用PstⅠ和Hind

Ⅲ切割質(zhì)粒和外源DNA,B項(xiàng)錯誤;用PstⅠ和Hind

Ⅲ切割質(zhì)粒,切開的質(zhì)粒由于兩切口處黏性末端不同,不會自身連接,用這兩種限制酶切割外源DNA,可得到目的基因的完整序列,且切口處黏性末端只能與切開的質(zhì)粒的互補(bǔ)的黏性末端連接,保證了重組DNA序列的唯一性,C項(xiàng)正確;由于用PstⅠ切割質(zhì)粒后,其中的氨芐青霉素抗性基因已被破壞,所以導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長,D項(xiàng)錯誤。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞情境導(dǎo)引下圖表示培育轉(zhuǎn)基因抗病毒番茄的過程示意圖。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四請回答下列問題。1.簡述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過程。提示將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA中,通過農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞的侵染作用,Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移至被侵染的植物細(xì)胞,并將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞最常用的是哪種方法?簡便經(jīng)濟(jì)的方法是哪種?我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的方法是哪種?提示農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法最常用。除此之外還有花粉管通道法,這是一種更為簡便經(jīng)濟(jì)的方法,也是我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的方法。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四3.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞通常采用的方法是什么?選取的受體細(xì)胞是什么細(xì)胞?提示顯微注射法。受精卵。4.簡述將目的基因?qū)氪竽c桿菌的基本過程。提示用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞?；虮磉_(dá)載體溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收基因表達(dá)載體。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四歸納提升1.受體細(xì)胞的選擇(1)對于植物來說,受體細(xì)胞可以是受精卵或體細(xì)胞,因?yàn)橹参锛?xì)胞具有全能性。(2)對于動物來說,受體細(xì)胞一般是受精卵,因?yàn)槭芫训娜苄愿?而高度分化的動物體細(xì)胞的全能性受到抑制。(3)大腸桿菌和酵母菌在基因工程中都可以作為受體細(xì)胞,但又有所不同。大腸桿菌為原核細(xì)胞,而酵母菌為真核細(xì)胞(具有多種細(xì)胞器),所以在生產(chǎn)需要加工和分泌的蛋白質(zhì)時,酵母菌比大腸桿菌有優(yōu)勢。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.目的基因在受體細(xì)胞中的位置不同會引起遺傳上的差別

探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四(1)圖中a細(xì)胞減數(shù)分裂時,細(xì)胞質(zhì)是不均分的,子細(xì)胞不一定含有目的基因。(2)圖中b在進(jìn)行細(xì)胞減數(shù)分裂時,細(xì)胞核中的DNA經(jīng)復(fù)制后平均分配到兩個子細(xì)胞中,保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性,細(xì)胞中目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。易錯提醒

在將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前,都必須進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建,也就是說導(dǎo)入受體細(xì)胞的必須是重組DNA分子,而不是直接導(dǎo)入目的基因。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四典例剖析(多選)下圖表示培育轉(zhuǎn)基因抗病毒農(nóng)作物的過程示意圖。下列敘述正確的是(

)A.過程a需要限制酶和DNA連接酶的參與B.過程b需要用CaCl2處理,以提高農(nóng)作物細(xì)胞細(xì)胞壁的通透性C.抗病毒基因一旦整合到農(nóng)作物細(xì)胞的染色體上,就能正常表達(dá)D.轉(zhuǎn)基因抗病毒農(nóng)作物是否培育成功可通過接種特定病毒進(jìn)行鑒定探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四答案AD解析題圖中過程a為構(gòu)建基因表達(dá)載體,需要用到限制酶和DNA連接酶,A項(xiàng)正確;CaCl2處理只是提高農(nóng)桿菌細(xì)胞(原核細(xì)胞)細(xì)胞壁的通透性,B項(xiàng)錯誤;抗植物病毒基因整合到農(nóng)作物細(xì)胞的染色體上,不一定能表達(dá),C項(xiàng)錯誤;轉(zhuǎn)基因抗病毒農(nóng)作物是否培育成功可通過接種特定病毒,觀察農(nóng)作物是否被感染來進(jìn)行鑒定,D項(xiàng)正確。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四活學(xué)活練受體細(xì)胞不同,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法也不相同,下列受體細(xì)胞與導(dǎo)入方法匹配錯誤的是(

)選項(xiàng)受體細(xì)胞導(dǎo)入方法A棉花細(xì)胞花粉管通道法B大腸桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法C羊受精卵顯微注射法D水稻細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四答案B解析花粉管通道法是一種十分簡便、經(jīng)濟(jì)的方法,我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育過程用到此種方法,A項(xiàng)正確;將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2+處理法,這種方法能使大腸桿菌細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),B項(xiàng)錯誤;顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法,C項(xiàng)正確;可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胨炯?xì)胞,D項(xiàng)正確。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四目的基因的檢測與鑒定下圖為抗蟲棉的接種實(shí)驗(yàn),結(jié)合圖示(左圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉使蟲體發(fā)育不正常)探究以下問題。1.分子水平的鑒定包括哪些內(nèi)容?提示目的基因的檢測與鑒定在分子水平包括:目的基因是否插入受體DNA,目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA和目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)三個層次。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.觀察下圖,完善目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA的鑒定方法和原理。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四(1)由圖可知,

的基本原理是具有一定同源性的兩條DNA單鏈,在一定條件下(適宜的溫度等)按照

原則形成雙鏈。雜交過程是高度特異性的,雜交的雙方是

和用放射性同位素標(biāo)記的

(又稱基因探針)。若轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA中有能與探針

的特異DNA片段,用于示蹤的放射性同位素標(biāo)記將指示其所在的位置,表明目的基因已插入到轉(zhuǎn)基因生物

中。

(2)同理,利用DNA和mRNA之間分子雜交技術(shù),檢測目的基因是否

。

答案(1)DNA分子雜交法堿基互補(bǔ)配對待測的DNA已知DNA片段互補(bǔ)染色體的DNA

(2)轉(zhuǎn)錄出mRNA探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四3.如何檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)?提示提取轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì),以相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交,若出現(xiàn)雜交帶說明目的基因表達(dá)出相應(yīng)蛋白質(zhì)。也可進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定。4.對于轉(zhuǎn)基因抗蟲或抗病植株,在個體生物學(xué)水平的鑒定包括哪些內(nèi)容?提示一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后,是否賦予了植物抗蟲或抗病特性,在個體生物學(xué)水平上需要做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn),以確定是否具有抗性以及抗性的程度。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四歸納提升1.目的基因的檢測與鑒定探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四2.不同分子檢測原理的異同(1)檢測目的基因是否插入受體DNA中、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時,用的探針都是放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。檢測原理都是堿基互補(bǔ)配對原則,只是被檢測的物質(zhì)不同,一個是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA,一個是轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞內(nèi)的mRNA。(2)進(jìn)行翻譯水平的檢測,通常以目的基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))作抗原,制備相應(yīng)抗體,檢測轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì),利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。(3)不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測,都是在體外進(jìn)行的。探究點(diǎn)一探究點(diǎn)二探究點(diǎn)三探究點(diǎn)四易錯提醒

基因工程操作過程中堿基互補(bǔ)配對現(xiàn)象基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”沒有堿基互補(bǔ)配對現(xiàn)象;第一步篩選與獲取目的基因,用人工合成、PCR獲取或基因文庫獲取,三種常用方法都涉及堿基