《蛋白質(zhì)技術(shù)》課件

蛋白質(zhì)技術(shù)課程大綱蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是理解其功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的分類根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類。蛋白質(zhì)的功能探究蛋白質(zhì)在生物體中的重要作用。蛋白質(zhì)的分離與純化學(xué)習(xí)利用各種技術(shù)分離和純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分為四個(gè)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)：指蛋白質(zhì)的氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)：指蛋白質(zhì)多肽鏈中的局部空間結(jié)構(gòu)，主要包括α螺旋和β折疊三級(jí)結(jié)構(gòu)：指整個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)，包括α螺旋、β折疊和其他結(jié)構(gòu)元素的排列方式四級(jí)結(jié)構(gòu)：指由多個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分類按結(jié)構(gòu)分類球狀蛋白：呈球形，如酶和抗體。纖維蛋白：呈長(zhǎng)纖維狀，如膠原蛋白和角蛋白。按功能分類酶：催化生物化學(xué)反應(yīng)。結(jié)構(gòu)蛋白：提供結(jié)構(gòu)支撐，如膠原蛋白。運(yùn)輸?shù)鞍祝恨D(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，如血紅蛋白。激素：調(diào)節(jié)生理功能，如胰島素。蛋白質(zhì)的功能催化酶是蛋白質(zhì)，它們可以加速生物化學(xué)反應(yīng)，例如消化和細(xì)胞呼吸。結(jié)構(gòu)一些蛋白質(zhì)提供結(jié)構(gòu)支撐，例如肌肉纖維和骨骼中的膠原蛋白。運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)可以運(yùn)輸物質(zhì)，例如氧氣（血紅蛋白）和脂類（脂蛋白）。防御抗體是蛋白質(zhì)，它們可以識(shí)別并中和病原體，例如細(xì)菌和病毒。蛋白質(zhì)的分離方法沉淀法利用蛋白質(zhì)的溶解度差異，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H值、鹽濃度或添加有機(jī)溶劑等方法使蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)。超速離心法利用蛋白質(zhì)的密度差異，通過(guò)高速離心將不同密度的蛋白質(zhì)分離。透析法利用蛋白質(zhì)和鹽分子大小的差異，通過(guò)半透膜將蛋白質(zhì)與鹽分分離。鹽析法利用蛋白質(zhì)的溶解度差異，通過(guò)添加高濃度的鹽類使蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)的純化技術(shù)分離利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)差異，將其從其他生物分子中分離出來(lái)。純化進(jìn)一步去除雜質(zhì)蛋白，獲得高純度的目標(biāo)蛋白。鑒定確認(rèn)純化后的蛋白質(zhì)是否為目標(biāo)蛋白。色譜技術(shù)分離原理基于樣品中不同組分的物理化學(xué)性質(zhì)，如極性、大小、親和力等，利用固定相和流動(dòng)相之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分離。類型多樣包括尺寸排阻色譜、離子交換色譜、親和色譜、反相色譜等，可根據(jù)不同的需求選擇合適的色譜技術(shù)。應(yīng)用廣泛廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子的分離、純化和分析。電泳技術(shù)1蛋白質(zhì)分離根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、電荷和形狀進(jìn)行分離。2分析工具用于鑒定蛋白質(zhì)、分析蛋白質(zhì)純度和分子量。3應(yīng)用廣泛廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域。免疫親和層析原理利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將特異性抗體固定在固相載體上，制備成免疫親和層析柱。當(dāng)含有目標(biāo)蛋白的樣品通過(guò)層析柱時(shí)，目標(biāo)蛋白與固定化抗體特異性結(jié)合，而其他蛋白則被洗脫，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的純化。優(yōu)點(diǎn)具有高特異性和高純度，可用于分離復(fù)雜混合物中的目標(biāo)蛋白，特別適合用于分離痕量蛋白或低豐度蛋白。應(yīng)用廣泛應(yīng)用于生物制藥、科研和臨床診斷領(lǐng)域，例如抗體藥物的純化、蛋白質(zhì)組學(xué)研究、疾病診斷等。親和層析基于特異性結(jié)合利用蛋白質(zhì)與配體之間的特異性相互作用進(jìn)行分離和純化。固定化配體配體固定在固體基質(zhì)上，如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠。洗脫目標(biāo)蛋白使用競(jìng)爭(zhēng)性配體或改變緩沖液條件來(lái)洗脫目標(biāo)蛋白。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法紫外分光光度法基于蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的芳香環(huán)對(duì)紫外光的吸收，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)中氮的含量來(lái)推算蛋白質(zhì)含量，方法準(zhǔn)確但操作繁瑣。雙縮脲法利用雙縮脲試劑與蛋白質(zhì)中的肽鍵反應(yīng)，生成紫紅色化合物，通過(guò)比色法定量?？捡R斯亮藍(lán)法利用考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)比色法定量，方法快速簡(jiǎn)便。紫外分光光度法紫外吸收蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有最大吸收，這是由于酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基的芳香環(huán)的吸收。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用已知濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定未知樣品的吸光度，可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白質(zhì)的濃度。比爾-朗伯定律吸光度與蛋白質(zhì)濃度和光程長(zhǎng)度成正比，通過(guò)測(cè)定吸光度和光程長(zhǎng)度，即可計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度。牛津蘭法利用牛津蘭試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成有色物質(zhì)。在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，即可定量蛋白質(zhì)濃度。靈敏度高，適用于微量蛋白質(zhì)測(cè)定?？雕R斯亮藍(lán)法原理康馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成有色復(fù)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點(diǎn)靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，快速，適用于多種蛋白質(zhì)樣品。缺點(diǎn)受樣品中其他物質(zhì)的影響，需注意校正。蛋白質(zhì)的修飾1磷酸化磷酸基團(tuán)的添加，影響蛋白質(zhì)活性。2糖基化糖鏈的連接，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和功能。3乙酰化乙?；奶砑樱绊懙鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性和定位。蛋白質(zhì)的去乙?；M蛋白去乙?；复呋M蛋白的去乙?；?，影響基因表達(dá)調(diào)控。非組蛋白去乙?；缸饔糜诜墙M蛋白，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)等過(guò)程。蛋白質(zhì)的磷酸化磷酸化作用磷酸基團(tuán)被添加到蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基上，通常是絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸。酶催化磷酸化過(guò)程由稱為激酶的酶催化。可逆反應(yīng)磷酸化是一種可逆過(guò)程，由稱為磷酸酶的酶去磷酸化。蛋白質(zhì)的糖基化糖基化類型N-連接糖基化：糖鏈連接到天冬酰胺殘基的酰胺氮原子。O-連接糖基化：糖鏈連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基氧原子。糖基化的作用提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。增加蛋白質(zhì)的水溶性。影響蛋白質(zhì)的活性。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測(cè)定技術(shù)1X射線晶體學(xué)解析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)2核磁共振技術(shù)研究蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)3質(zhì)譜技術(shù)確定蛋白質(zhì)的分子量X射線晶體學(xué)X射線衍射利用X射線照射晶體，觀察其衍射圖樣晶體結(jié)構(gòu)分析衍射圖樣，推斷晶體內(nèi)部原子排列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)根據(jù)原子排列，重建蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)核磁共振技術(shù)原理利用原子核的自旋特性，在強(qiáng)磁場(chǎng)中進(jìn)行磁共振，通過(guò)分析信號(hào)獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。優(yōu)點(diǎn)可以研究蛋白質(zhì)在溶液中的結(jié)構(gòu)，提供動(dòng)態(tài)信息，適用于研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化和相互作用。局限性對(duì)蛋白質(zhì)大小有限制，適用于較小的蛋白質(zhì)，且需要較高的蛋白質(zhì)濃度。質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)鑒定通過(guò)分析蛋白質(zhì)的質(zhì)量和片段信息，可以確定蛋白質(zhì)的序列和修飾狀態(tài)。蛋白質(zhì)定量通過(guò)比較不同樣本中蛋白質(zhì)的豐度，可以了解蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。蛋白質(zhì)相互作用通過(guò)分析蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和結(jié)構(gòu)，可以揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化1基因克隆將目的基因克隆到合適的表達(dá)載體中。2表達(dá)宿主選擇合適的表達(dá)宿主，例如細(xì)菌、酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。3蛋白質(zhì)表達(dá)在表達(dá)宿主中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。4蛋白質(zhì)純化通過(guò)各種方法，例如層析法、電泳法，從宿主細(xì)胞中分離和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。原核表達(dá)系統(tǒng)1簡(jiǎn)單易行原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，成本低，效率高。2表達(dá)量高原核細(xì)胞能夠快速生長(zhǎng)繁殖，并高效表達(dá)外源基因。3應(yīng)用廣泛適用于表達(dá)各種蛋白質(zhì)，包括酶、抗體和激素等。真核表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更接近于人類細(xì)胞環(huán)境,能夠進(jìn)行更復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾.植物細(xì)胞植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)生物制藥和其他生物活性物質(zhì).酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)易于操作和培養(yǎng),且能夠高效地生產(chǎn)蛋白質(zhì).融合蛋白技術(shù)提高產(chǎn)量融合蛋白更容易被純化和分離，提高產(chǎn)量和效率。增強(qiáng)活性融合標(biāo)簽可增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性和活性，提高生物活性。促進(jìn)結(jié)晶融合標(biāo)簽可提高目標(biāo)蛋白的溶解度，促進(jìn)結(jié)晶，便于結(jié)構(gòu)分析。蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)通過(guò)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列來(lái)改變其結(jié)構(gòu)和功能。蛋白質(zhì)改造對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾或優(yōu)化，以提高其穩(wěn)定性、活性或特異性。蛋白質(zhì)模擬設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)，以模擬自然界中存在的蛋白質(zhì)的功能。蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制純度確保蛋白質(zhì)樣本中不含其他雜質(zhì)?？梢允褂秒娪炯夹g(shù)、色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)等方法進(jìn)行檢測(cè)?；钚则?yàn)證蛋白質(zhì)是否具有預(yù)期的生物活性?？梢酝ㄟ^(guò)酶活性測(cè)定、細(xì)胞