DB51T 1299-2011 山羊胚胎移植技術(shù)操作規(guī)程　　

ICS備案號：30902-2011DB51/T1299—2011山羊胚胎移植技術(shù)操作規(guī)程四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB51/T1299—2011 12術(shù)語和定義 13技術(shù)操作規(guī)程 1附錄A(資料性附錄)胚胎移植技術(shù)所需器械、物品、儀器 6附錄B(資料性附錄)推薦藥物劑量及生產(chǎn)廠家、溶液配方及配制 8本標(biāo)準(zhǔn)由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：西南民族大學(xué)四川省畜禽繁育改良總站。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：李鍵王永字向東徐亞歐傅昌秀。1本規(guī)程規(guī)定了四川丘區(qū)主要山羊品種胚胎移植技術(shù)的術(shù)語和定義及技術(shù)操作規(guī)程。本規(guī)程適用于四川主要山羊品種的胚胎生產(chǎn)及舍飼型受體羊的胚胎移植。其他品種山羊可參照執(zhí)下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1準(zhǔn)備工作要有15m2左右的工作室、15m2左右的無菌手術(shù)間和6m2~8m2的無菌操作間，保證水和電源，工作室和無菌間應(yīng)配備加溫設(shè)備，使室溫保持在22℃~25℃。供體和受體羊應(yīng)相對集中，便于觀察、實施超數(shù)排卵和同期發(fā)情。見附錄A。3.2.1.2遺傳性能穩(wěn)定、譜系清楚。3.2.1.5處理前應(yīng)觀察到2個以上正常發(fā)情周期，或斷奶1月~2月，并觀察到至少1次自然發(fā)情。23.2.2.1保持飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、干燥、溫度適宜。3.2.2.2制定合理的日糧配方，短期優(yōu)飼，尤其應(yīng)加強蛋白質(zhì)營養(yǎng)，并注意青綠飼料、礦物質(zhì)和維生素的供應(yīng)。保持良好的營養(yǎng)狀況，體況中上等。3.2.2.3滿足清潔飲水需要。3.2.2.4舍飼羊應(yīng)保證適當(dāng)?shù)倪\動。3.2.2.5保持飼養(yǎng)環(huán)境相對穩(wěn)定，避免應(yīng)激反應(yīng)。3.3配種公羊要求3.4.1.1體質(zhì)健康、無生殖器官疾病，有健全的傳染病、寄生蟲病防治措施。3.4.1.2經(jīng)產(chǎn)母羊應(yīng)為本繁殖周期正常產(chǎn)羔，斷奶1個月以上，同期發(fā)情處理前觀察到1個以上正常發(fā)情周期，體重40kg以上；青年母羊，年齡應(yīng)達(dá)到1周歲以上，體重40kg以上，發(fā)情周期正常。3.4.1.3按照供、受體比例1:12的原則，準(zhǔn)備侯選受體，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)和觀察，最終按照1:10的比例選定同期發(fā)情受體羊。3.4.2受體羊飼養(yǎng)管理3.4.2.1受體母羊選定后，畜群的飼養(yǎng)管理應(yīng)和供體畜群同樣對待(見3.2.2.1～3.2.2.5)。3.4.2.2單獨組群飼養(yǎng)，胚胎移植前后避免應(yīng)激。3.5超數(shù)排卵及胚胎回收3.5.1供體超數(shù)排卵3.5.1.1季節(jié)選擇春秋兩季，即在4月～5月和9月～11月。3.5.1.2超數(shù)排卵激素藥物FSH(垂體促卵泡素)PG(氯前列烯醇)羊?qū)嵱眯腿仓Z酮陰道栓推薦以上藥物生產(chǎn)廠見附錄B。3.5.1.3超數(shù)排卵激素劑量推薦使用劑量見附錄B。3.5.1.4超數(shù)排卵方法數(shù)排卵。具體方法：生理鹽水溶解FSH,,每天早(7:00～8:00)和晚(19:00～20:00)注射兩次，連續(xù)4d,按遞減法注射。其中在第2d晚，第3d早同時注射氯前列烯醇(0.1mg/只),并在第3d早撤除陰道栓。3.5.1.5供體羊發(fā)情鑒定及配種3在供體母羊撤除陰道栓后，每隔8h用試情公羊觀察發(fā)情情況，發(fā)情后每隔8h~12h配種至發(fā)情結(jié)束 (自然交配或人工授精)。發(fā)情配種當(dāng)天計為0d,在第5d用腹腔鏡檢查卵巢反應(yīng)，適宜手術(shù)回收胚胎者在第6d用手術(shù)法回收子宮胚胎。母羊外陰部必須經(jīng)過清洗消毒，輸精器必須保持無菌，選擇合適的輸精部位，每次輸精有效精子數(shù)不少于75×106個。3.5.2.2手術(shù)前將手術(shù)羊空腹24h,用2%普魯卡因在薦椎與第一尾椎結(jié)合處實行尾椎硬膜外腔麻醉(或用其他有效方法),將羊保定在手術(shù)床上，術(shù)部剃毛、消毒。3.5.2.3手術(shù)部位在乳房外側(cè)的鼠蹊部，切口8cm,按常規(guī)操作切開，牽引出子宮及卵巢，觀察卵巢狀況并記錄黃體數(shù)和卵泡數(shù)。經(jīng)子宮角利用專用胚胎回收針回收胚胎。胚胎回收液配方和配制說明見附錄B。的操作液體凈化胚胎2次～3次，在60倍下對胚胎進(jìn)行形態(tài)質(zhì)量分級。胚胎保存液配方見附錄B。適宜胚胎移植的胚齡為5.5d～6.5d,正常發(fā)育階段為桑葚胚和囊胚。依據(jù)胚胎形態(tài)和發(fā)育階段與日齡是否相符，將胚胎分為A、B、C、D四級，其中前三級為可移胚，D級胚為不可移胚胎。A級：優(yōu)質(zhì)胚胎，胚胎發(fā)育階段與胚齡一致。細(xì)胞分裂為大小、顏色、結(jié)構(gòu)一致的均勻球形體，細(xì)胞界限明顯，透明帶圓而平滑；B級：胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致。有少數(shù)幾個細(xì)胞分裂球被擠出細(xì)胞團(tuán)，其余大部分分裂球為大小、顏色、結(jié)構(gòu)一致的均勻球形體，細(xì)胞界限明顯，透明帶圓而平滑；C級：有部分細(xì)胞分裂球(<50%)被擠出細(xì)胞團(tuán)，但細(xì)胞沒有破損，部分細(xì)胞界限不清，結(jié)構(gòu)較松散；胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致。D級：透明帶變型，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)變暗，卵裂球界限不清或細(xì)胞萎縮，卵裂球周隙增大，或晚發(fā)育胚或未受精卵。3.6胚胎冷凍保存3.6.1冷凍前，在室溫下(20℃~22℃)用胚胎保存液清洗胚胎3次~5次，將胚胎移入冷凍保護(hù)液內(nèi)，脫水平衡5min~10min后將胚胎裝入冷凍細(xì)管，每管裝入胚胎2枚~3枚，將細(xì)管熱封并胚胎保存液和冷凍保護(hù)液配方見附錄B。3.6.2將細(xì)管放入在20℃的冷凍儀支架上并放入冷凍室里啟動冷凍程序。3.6.3冷凍程序420℃降至-6.5℃,其降溫速度1℃/分鐘，-6.5℃人工誘發(fā)結(jié)晶，結(jié)晶方法是在25cm鑷另一手用預(yù)冷的棉簽緊貼細(xì)管含胚段中部，可見白色結(jié)晶向上下擴(kuò)散，待整段結(jié)晶后將細(xì)管迅速放回冷凍室，在-6.5℃平衡10min;從-6.5℃降至-36℃,降溫速度0.3℃/min;降溫至-36℃時，將胚胎細(xì)管直接投入液氮保存。3.6.4胚胎解凍將液氮中保存的胚胎細(xì)管取出，在室溫下空氣中停留15s后投入32℃水浴快速解凍。60s后，將胚胎驅(qū)入解凍液，平衡8min～10min,一步脫除保護(hù)劑，然后移入含20%新生犢牛血清的PBS液中。胚胎冷凍液配方見附錄B。3.6.5將解凍的胚胎置體視顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)質(zhì)量鑒定，方法見3.5.2.5。3.7重復(fù)超排選擇首次超排效果較好的供體母羊進(jìn)行重復(fù)超排。兩次超排間隔應(yīng)有1個~2個情期。第一次超排效果不好的母羊和個別手術(shù)失誤的不宜再超排。3.8受體同期發(fā)情處理及胚胎移植3.8.1受體同期發(fā)情處理3.8.1.1同期發(fā)情處理藥品羊?qū)嵱眯腿仓Z酮陰道栓FSH(垂體促卵泡素)PG(氯前列烯醇)3.8.1.2同期發(fā)情處理藥品劑量使用劑量見附錄B。3.8.1.3同期發(fā)情處理方法程序2:放置炔諾酮陰道栓(第0d),第10d肌注低劑量FSH,12h后撤栓，同時二次肌注FSH,并程序3:肌注PG(第0d),第6d放置炔諾酮陰道栓，16d肌注低劑量FSH,12h后撤栓，同時二次肌注FSH,并注射PG。使用劑量見附錄B。從撤栓后12h開始，每隔12h用試情公羊試情，觀察發(fā)情情況，母羊接近公羊、搖尾、接受公羊爬跨或母羊互相爬跨者判定為發(fā)情，撤栓后96h內(nèi)發(fā)情者為同期發(fā)情處理有效。記錄發(fā)情此類推，直到連續(xù)發(fā)情結(jié)束。3.8.3胚胎移植適宜受體羊的判定方法5DB51/T1299—2011將與供體發(fā)情同步差在±1d的受體羊作備查受體。方法1:在發(fā)情結(jié)束后5d用腹腔鏡觀察發(fā)情羊卵巢上排卵及黃體發(fā)育情況，記錄黃體側(cè)別及黃體數(shù)和質(zhì)量，并記錄未排卵卵泡大小及數(shù)量，卵巢上卵泡正常發(fā)育、排卵并形成正常功能黃體，同時卵巢上無卵泡或只有較小卵泡的受體羊作為可用受體，于5d～6d進(jìn)行手術(shù)胚胎移植。方法2:在手術(shù)時探察并記錄卵巢上排卵及黃體發(fā)育情況，排卵并發(fā)育為功能黃體的受體可進(jìn)行胚胎移植。3.8.4胚胎移植3.8.4.1受體胚胎移植手術(shù)前應(yīng)停食12h至24h,術(shù)部于手術(shù)前1d剃毛。3.8.4.2術(shù)前麻醉、保定、手術(shù)部位及手術(shù)移植的基本過程與手術(shù)回收相同。3.8.4.3在子宮角前端1/3處避開血管把裝有胚胎的移植針針頭插入子宮腔，輕輕晃動針頭，確認(rèn)針頭在子宮腔時注入胚胎。注意避免注入過多空氣。移植結(jié)束后，將子宮送回腹腔，常規(guī)縫合。3.8.4.4胚胎移植手術(shù)時，應(yīng)盡量減輕手術(shù)損傷。操作要輕巧，動作要穩(wěn)妥可靠，避免過度牽拉生殖3.9供、受體羊術(shù)后管理及妊娠受體的護(hù)理3.9.1供、受體羊手術(shù)后注意術(shù)后護(hù)理，尤其是傷口護(hù)理。手術(shù)后8d~10d根據(jù)傷口愈合情況拆線，進(jìn)行外科處理。3.9.2繼續(xù)加強供體羊飼養(yǎng)管理，注意觀察發(fā)情、及時配種。3.9.3加強移植胚胎受體羊的飼養(yǎng)管理，注意觀察發(fā)情，如果返情應(yīng)及時配種。3.9.4適當(dāng)增加日糧營養(yǎng)，以滿足妊娠需要，避免應(yīng)激反應(yīng)，防止流產(chǎn)。3.9.5妊娠后期要補充足量的維生素、礦物元素，適當(dāng)限制攝入量，既要保證胎兒的正常發(fā)育，又要避免難產(chǎn)。3.9.6根據(jù)當(dāng)?shù)丶膊“l(fā)生情況，有目的地注射一些疫苗，防止胎兒傳染病的發(fā)生。3.9.7做好分娩時的難產(chǎn)預(yù)防和羔羊護(hù)理工作。6(資料性附錄)品名規(guī)格數(shù)量品名規(guī)格數(shù)量A.1器械、物品染發(fā)精盒1/40羊?qū)懱柟P(寫放大號)只2耳號鉗把1試管刷個5耳號牌付1付/羊硫酸紙米若干毛巾條若干飯盒個5工作服件5針盒個5膠鞋雙5線手套雙5雨鞋雙5敷料鑷子(25cm)毛剪把1線繩把2保定繩根若干肥皂塊若干剃毛刀架付2剃毛刀片合若干剪刀把1廣口瓶個5羊用開腔器(大，小)把各1腸鉗(去栓備用)把1一次性注射器(2,5,10mL)支若干針頭(9號)合若干陰道栓置入器牛皮紙張若干脫脂紗布(止血)卷3針頭濾器個5膠布卷1紗布條脫脂棉卷20.22u濾膜盒1手術(shù)口罩只8只/次0.22u濾膜盒1醫(yī)用手套雙2雙/供體手術(shù)衣件8手套包巾塊5滑石粉Kg1手術(shù)燈(家用萬向燈代替)臺2手刷個2手術(shù)器械盤個3紗布杯子(燒杯或其他)個2創(chuàng)巾(白純綿布自制1.5x1m)塊若干器械包巾(白布自制)塊6巾鉗(14cm)把若干鑷子(有齒、無齒)把若干手術(shù)刀柄(4#)把6手術(shù)刀片(21-24#)包5止血鉗(16cm)把若干手術(shù)剪刀把6縫合線(白色7、10號)卷6縫合針(△O3/8,11/40或包各1繞線芯個6手臂消毒桶羊2腸鉗把5手術(shù)帽只6只/次室內(nèi)溫度計個2持針器把6血管夾(5.7彎)個4注射器(玻璃)注射器封閉膠頭個注射器(10mL,30mL)個若干胚胎回收出液針頭枚4異物針把2胚胎沖洗進(jìn)液針頭枚吸管膠頭個7集卵杯(90mm蒸發(fā)皿代替)個胚胎吸管、移植管枚若干帶蓋檢卵(胚)杯個帶蓋器械盤個2針頭(6,12號)盒各2乳膠管，玻璃珠，硅膠管酒精燈個2擦鏡紙本1移植針枚A.2藥物感染傷口處理藥品(備用)生理鹽水瓶若干碘化酒精(自配)瓶若干防粘連藥劑新潔爾滅瓶若干醫(yī)用酒精若干碘酊瓶若干傷口處理藥粉Kg腎上腺素或蘇醒靈支單、雙蒸餾水鼓風(fēng)干燥箱臺1腹腔鏡保定架1蒸餾器桶各1腹腔鏡套1紫外線殺菌燈(30W)套4電爐(2000W,800W)臺各1體視顯微鏡臺1高壓蒸汽滅菌器臺1電加熱器或空調(diào)臺1手術(shù)臺個4水浴鍋(三用水箱)臺1冰箱臺1A.4記錄表格侯選供受體情況表份1/20羊供體超排胚胎回收記錄份1/1羊胚胎冷凍及其他操作記錄份1/羊受體同期發(fā)情記錄份1/20羊胚胎移植產(chǎn)羔記錄份1/20羊供體羊術(shù)后情況記錄份1/20羊受體術(shù)后情況記錄份若干工作進(jìn)度匯總表份28(資料性附錄)推薦藥物劑量及生產(chǎn)廠家、溶液配方及配制B.1推薦藥物劑量及生產(chǎn)廠家藥物劑量生產(chǎn)廠家供體受體FSH(垂體促卵泡素)8～10mg/只中國科學(xué)院動物研究所，10mg/瓶8～10ml/只加拿大生產(chǎn)(澳大利亞進(jìn)口),10ml//瓶(使用時配成水劑)300～350小鼠單位33～50小鼠單位寧波激素制品有限公司，100小鼠單位/支PG(氯前列烯醇)0.2ml/只上海計劃生育研究所，0.2mg/2ml/支孕激素陰道栓60mg/只60mg/只西北農(nóng)林科技大學(xué)胚胎工程實驗室試制，每枚含18-甲基炔諾酮60mgLRH-A3(促排卵素3號)20μg/只寧波激素制品有限公司，20μg/2ml/支B.2杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)配方成分指標(biāo)(克/升)配制說明N