微生物檢驗(yàn)技術(shù)-真菌檢驗(yàn)技術(shù)

真菌的分離培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的惟一方法。培養(yǎng)真菌的溫度為28℃，但深部真菌為37℃。菌落是鑒別真菌的方法。注意以下幾點(diǎn)：①菌落性質(zhì)：酵母菌還是霉菌；②菌落大小:病原性真菌菌落小，而條件致病性真菌菌落大；③菌落顏色:病原性真菌顏色淡，污染真菌顏色深；④致病性真菌菌落下沉，有時(shí)使培養(yǎng)基開裂；污染性真菌菌落不下沉,很少引起開裂。通過(guò)培養(yǎng)可確定菌種，輔助直接檢查的不足；通常用沙保氏培養(yǎng)基（SDA）（22～28℃）；深部真菌可用血瓊脂或腦心葡萄糖血瓊脂37℃培養(yǎng)；溫度

:22℃～28℃(深部真菌:28℃/37℃)需氧、濕度高;PH:4.0～6.0(弱酸性)生長(zhǎng)速度

:慢(1～4周見典型菌落)菌落特征

:酵母/酵母樣菌

:光滑柔軟、濕潤(rùn);絲狀菌:疏松(絨毛狀、棉絮狀、粉末狀);顏色(正/背面)常用培養(yǎng)方法試管法---初代培養(yǎng)、菌種保存大培養(yǎng)---純種的培養(yǎng)、研究小培養(yǎng)---菌種鑒定

(玻片法鋼圈法方塊法)真菌的生化反應(yīng)主要用于深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。1.糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)37℃孵育，觀察糖發(fā)酵情況。

2.同化碳源試驗(yàn)糖同化試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)是否利用某種糖或醇類物質(zhì)作為唯一的碳源。

3.同化氮源試驗(yàn)

同化碳源試驗(yàn)相同，但需用無(wú)氮源的培養(yǎng)基，不要加糖類，而加入硝酸鉀。

其他實(shí)驗(yàn)芽管形成試驗(yàn)

取少許待檢的白色念珠菌接種于0.5ml人或兔血清中，混勻，直37℃水浴2-3h后，取出一接種環(huán)菌液，涂片、鏡檢。有芽管產(chǎn)生者為白色念珠菌，其他念珠菌不產(chǎn)生芽管。厚壁孢子形成試驗(yàn)

本試驗(yàn)亦是鑒定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯－80瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)本菌，鏡檢觀察到厚膜孢子及假菌絲。白假絲酵母菌的厚膜孢子

芽生孢子Candidaalbicans--chlamydosporeformationoncornmealagar假絲酵母菌厚膜孢子動(dòng)物實(shí)驗(yàn)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)快速實(shí)驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用真菌體外藥物敏感試驗(yàn)一、常量稀釋法二、微量稀釋法三、絲狀真菌的體外藥敏方法四、改良的真菌體外藥物敏感試驗(yàn)方法真菌的有性孢子（根霉菌的接合孢子）假絲酵母菌菌落

青霉菌石膏樣癬菌真菌的常規(guī)檢驗(yàn)法實(shí)驗(yàn)室檢查：標(biāo)本采集分離培養(yǎng)直接鏡檢生化反應(yīng)染色鏡檢免疫學(xué)試驗(yàn)以直接鏡檢和分離培養(yǎng)最重要。一、臨床標(biāo)本的采集

1．皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)：毛發(fā)、指(趾)甲、皮屑等。

2．各種分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、糞便、尿液等。

3．血液和體液：體液包括胸水、腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等。

4．膿汁及滲出物。

1.采集的標(biāo)本要適宜

不同真菌感染應(yīng)采取不同的臨床標(biāo)本。

2.在用藥前采集標(biāo)本

一般真菌標(biāo)本須在用藥前采集，對(duì)已用藥者則需停藥一段時(shí)間后再采集標(biāo)本。二、采集標(biāo)本注意事項(xiàng)

3.采集的標(biāo)本量要足血液和腦脊液標(biāo)本5ml，胸腔液20ml，皮屑標(biāo)本兩塊，活體組織兩份(一份送病理科檢查，一份作鏡檢和培養(yǎng))。4.嚴(yán)格無(wú)菌操作并進(jìn)行消毒處理，尤其是采集血液和腦脊液標(biāo)本，要避免污染雜菌。5.采集標(biāo)本立即送檢深部真菌標(biāo)本最長(zhǎng)不得超過(guò)2h。（一)直接鏡檢直接鏡檢對(duì)真菌病的診斷較細(xì)菌更為重要。許多真菌標(biāo)本不需染色即可直接鏡檢，如癬病標(biāo)本多用KOH濕片檢查法，即取病發(fā)或病損部位皮屑、甲屑置于載玻片上，加1滴10％-20％KOH液，然后加蓋玻片并微微加熱，使標(biāo)本組織溶解透明，在顯微鏡下可觀察到真菌的孢子和菌絲。

三、標(biāo)本直接檢查

常用的封固液：①KOH溶液：本液適于檢查致密的難以透明的材料（如毛發(fā)、指甲、鱗屑等）。②墨汁：主要用于檢查有莢膜的真菌（如新型隱球菌等）。③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力較強(qiáng)，只限于不透明的標(biāo)本。④生理鹽水：為觀察真菌的出芽現(xiàn)象可用生理鹽水代替氫氧化鉀溶液。（二）染色標(biāo)本檢查：1、革蘭氏染色：各種真菌均為革蘭氏陽(yáng)性，為深藍(lán)色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子絲菌、諾卡菌及組織胞漿菌等。2、乳酸酚棉藍(lán)染色3、糖原染色：菌體均染成紅色。用于標(biāo)本直接涂片及組織病理切片染色。4、嗜銀染色（GMS）：染成黑色。

5、墨汁染色：主要用于新型隱球菌莢膜的染色。隱球菌莢膜和細(xì)胞壁呈紅色，細(xì)胞核呈黑色。6、熒光染色：主要使用吖啶橙和氫氧化鉀來(lái)染直接涂片、培養(yǎng)涂片及組織切片。

新型隱球菌直接鏡檢的意義直接鏡檢陽(yáng)性表示：①有診斷意義，如淺部真菌病等；②看到的就是真菌的形態(tài)，可確定某些致病性