海馬齒NHX家族成員鑒定和逆境脅迫后表達(dá)分析

海馬齒NHX家族成員鑒定和逆境脅迫后表達(dá)分析目錄TOC\o"1-3"\h\u22463第一章引言 頁(yè)摘要：海馬齒（SesuviumportulacastrumL.）是番杏屬的草本植物主要生長(zhǎng)在靠近海岸的地區(qū)，其功能豐富如可以鞏固靠海岸的沙灘避免形成沙塵污染，在海水中可以正常完成其生活史也可以作為魚類的避陽(yáng)場(chǎng)所，具有很強(qiáng)抗逆性主要耐鹽。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+/H+exchange，NHX）是耐鹽植物的關(guān)鍵基因其表達(dá)有助于植物進(jìn)行在耐鹽脅迫下正常生長(zhǎng)，為探究NHX在海馬齒面對(duì)重金屬鎘脅迫下的作用，對(duì)海馬齒NHX基因家族進(jìn)行其成員鑒定和其功能的初探。方法采用生物學(xué)基礎(chǔ)信息分析的方法從海馬齒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中調(diào)取NHX基因家族序列，并對(duì)調(diào)取的信息數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析、多序列比對(duì)分析、跨膜結(jié)構(gòu)域分析和保守基序分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究重金屬鎘脅迫下NHX成員的相對(duì)表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：從海馬齒的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中鑒定出42個(gè)NHX基因。其中氨基酸為：244~1232aa、分子量大小為26.7~132.58kD、等電點(diǎn)為4.67~9.56、不穩(wěn)定指數(shù)為22.64~52.18、其中海馬齒SpNHX16、SpNHX18、SpNHX24、SpNHX26、SpNHX28、SpNHX29、SpNHX30、SpNHX31、SpNHX32蛋白為親水性蛋白。其余SpHNX蛋白為疏水性蛋白。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果為，重金屬鎘脅迫下四個(gè)SpNHX基因在根和葉的表達(dá)量各有不同，隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，除了海馬齒NHX30在根部的表達(dá)量在總體表現(xiàn)上有微小上調(diào)趨勢(shì)外，其余海馬齒NHX30在葉片、NHX7在根部和葉、NHX31在根部和葉、NHX32在根部和葉基因的表達(dá)量總體都表達(dá)出下調(diào)趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論為，NHX基因家族對(duì)于鎘脅迫并不敏感，而且大多數(shù)成員在鎘脅迫中沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的表達(dá)升高。為海馬齒NHX家族基因的克隆及功能預(yù)測(cè)提供了一定的理論參考。關(guān)鍵詞：海馬齒；鎘脅迫；NHX基因家族；基因鑒定；生物信息學(xué)分析第一章引言1.1研究背景據(jù)2014年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》報(bào)道，在我國(guó)土壤情況已經(jīng)嚴(yán)重影響到生物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，其中的一些地區(qū)的土壤中重金屬鎘的含量已經(jīng)嚴(yán)重高于規(guī)定的含量達(dá)到7%讓大多數(shù)的生物面臨無(wú)法生存的困境。REF_Ref31958\r\h[1]被污染的土壤中主要是農(nóng)業(yè)用地、草地和林地等經(jīng)濟(jì)類用地對(duì)經(jīng)濟(jì)形勢(shì)造成嚴(yán)重的威脅處理土地當(dāng)中的鎘污染迫在眉睫。重金屬含量超標(biāo)對(duì)人體危害極大，會(huì)導(dǎo)致腎功能損壞和軟骨癥等。鎘在自然界當(dāng)中存在的方式為鋅共生物或是鉛共生物，被污染的土地會(huì)無(wú)法難以進(jìn)行耕種，種植出的植物一旦食用就可能出現(xiàn)上述癥狀，從而影響生物的多樣性會(huì)導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的完整性遭到破壞。鎘是工業(yè)生產(chǎn)中的主要原料之一，隨著我國(guó)工業(yè)快速發(fā)展土地、水體中的鎘含量已經(jīng)出現(xiàn)超出正常數(shù)值的情況，環(huán)境已經(jīng)面臨嚴(yán)重的重金屬污染。耕地因鎘污染導(dǎo)致產(chǎn)量急劇減少，水體中的鎘污染會(huì)導(dǎo)致水生生物無(wú)法正常地生長(zhǎng)發(fā)育，鎘污染已經(jīng)對(duì)現(xiàn)代生活和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成嚴(yán)重的不良影響。如何解決重金屬鎘污染的問(wèn)題已經(jīng)成為世界各地科學(xué)家研究討論的問(wèn)題之一。已經(jīng)有科學(xué)家提出了一些處理鎘污染的方法主要包括物理方法，化學(xué)方法和生物改良法，面對(duì)鎘污染土壤的物理修復(fù)方法主要有排土、客土、深耕翻土等傳統(tǒng)物理方法以及電修復(fù)技術(shù)、洗土法等，客土法就是將污染土壤鏟除，換入未污染的土壤，去表土法就是將污染的表土移去等，傳統(tǒng)的物理修復(fù)方法治理鎘污染效果非常明顯。REF_Ref32086\r\h[2]但這一種處理方法對(duì)資源和人工的要求極高，不僅如此將不同地區(qū)的土壤相互混合會(huì)導(dǎo)致原有的土壤生態(tài)環(huán)境發(fā)生變化，會(huì)使土壤生態(tài)環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞。物理修復(fù)無(wú)法從根源上解決土壤鎘污染問(wèn)題?；瘜W(xué)法是指通過(guò)在土壤中施用化學(xué)制劑、改良劑，增加土壤黏粒和有機(jī)質(zhì)，改變土壤氧化還原電位和pH值等理化性質(zhì)，使土壤鎘發(fā)生氧化還原等作用，降低鎘的生物有效性，以減輕對(duì)其他生物的危害。REF_Ref32556\r\h[3，REF_Ref32563\r\h4]使用化學(xué)試劑對(duì)土壤進(jìn)行改良可能會(huì)引起一些對(duì)土壤不良的副作用。相比較之下，生物改良法是一種長(zhǎng)期有效的并且還不會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境的良好方法。但是土壤當(dāng)中鎘含量過(guò)高導(dǎo)致大多數(shù)植物都無(wú)法正常生長(zhǎng)，更無(wú)法說(shuō)明其能優(yōu)化土壤降低其的含重金屬量。因此說(shuō)明研究在鎘脅迫下正常完成生活史的植物的生化機(jī)理和基因調(diào)控具有重要價(jià)值和意義。1.2海馬齒研究進(jìn)展1.2.1海馬齒簡(jiǎn)介海馬齒為番杏科海馬齒屬的草本植物，是鹽生植物。主要分布在全年高溫，季節(jié)變化小，溫差很小的地區(qū)。我國(guó)海南島的沿海地區(qū)，有廣泛的生長(zhǎng)。REF_Ref196\r\h[5]海馬齒可以長(zhǎng)時(shí)間在海水和淡水條件下正常生長(zhǎng)，而非鹽生植物在海水中無(wú)法正常生長(zhǎng)。海馬齒的特性表現(xiàn)為：海馬齒可以在高鹽度的土地和水中完成其生活史；可以收集被污染的環(huán)境中的污染物；可以抵抗高溫、適應(yīng)不良的土壤和水體。REF_Ref235\r\h[6]海馬齒可以在較極端的環(huán)境完成其生活史，因此本實(shí)驗(yàn)將海馬齒作為鎘脅迫的研究對(duì)象。1.2.2研究現(xiàn)狀生物生存的環(huán)境當(dāng)中并不是完全相同的，有的地區(qū)的生存環(huán)境當(dāng)中還存在不利于植物生長(zhǎng)發(fā)育的因素，植物為了能生存在各種各樣的脅迫環(huán)境中便在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中形成了依靠植物組織和體內(nèi)各種分子、生物活性物質(zhì)、生物化學(xué)反應(yīng)來(lái)抵抗、順應(yīng)不利環(huán)境。REF_Ref784\r\h[17]雖然現(xiàn)如今對(duì)于闡述逆境對(duì)植物造成的危害和植物抗逆機(jī)理的文獻(xiàn)和報(bào)道并不完整，但在遺傳、細(xì)胞、生理生化等方面對(duì)抗逆機(jī)理的研究已經(jīng)有了顯著的進(jìn)展，如將已知的逆境相關(guān)基因?qū)胱魑镏幸虼颂岣吡俗魑锏目鼓嫘杂欣谧魑锏纳L(zhǎng)發(fā)育，有利于環(huán)境的保護(hù)和農(nóng)作物的產(chǎn)量提升，進(jìn)而來(lái)說(shuō)研究和探索新的抗逆蛋白依舊是植物抗逆性研究的重點(diǎn)之一。REF_Ref830\r\h[18]鎘的脅迫會(huì)導(dǎo)致植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制并且會(huì)隨著鎘濃度的增加抑制的強(qiáng)度也跟著增強(qiáng)，最終會(huì)導(dǎo)致植物的死亡。REF_Ref862\r\h[7]NHX是細(xì)胞中Na+（K+）/H+的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有保守的Na+/H+交換結(jié)構(gòu)域，屬于單價(jià)陽(yáng)離子/質(zhì)子反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（MonovalentCation:ProtonAntiporter1，CPA1）超家族，主要利用H+-ATP酶和H+-PPase形成的兩個(gè)質(zhì)子泵，產(chǎn)生H+電化學(xué)梯度，將Na+從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡或是細(xì)胞外，從而穩(wěn)定Na+的穩(wěn)定性，減輕Na+在細(xì)胞內(nèi)的積累所產(chǎn)生的毒性作用。REF_Ref911\r\h[8-REF_Ref951\r\h12]位于植物液泡中的NHX在離子穩(wěn)態(tài)和耐鹽性中起重要作用。REF_Ref1202\r\h[13-REF_Ref1209\r\h15]NHX具有維持細(xì)胞膨壓、Na+（K+）濃度、膜囊泡運(yùn)輸和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)的功能，是與植物耐鹽相關(guān)的關(guān)鍵因子之一。REF_Ref1398\r\h[16]總而言之，目前對(duì)于海馬齒NHX家族的功能還未完全挖掘，本實(shí)驗(yàn)采用重金屬鎘脅迫進(jìn)行對(duì)海馬齒功能的探究。這研究對(duì)于海馬齒的耐重金屬鎘的機(jī)理和海馬齒的功能探究有著重大意義。1.3本研究的目的和意義隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)化的發(fā)展也得到快速地提升。但是產(chǎn)生的工業(yè)廢棄物數(shù)量眾多，部分工廠為了自身的經(jīng)濟(jì)效益選擇將廢棄物直接排入周圍的環(huán)境當(dāng)中導(dǎo)致環(huán)境生態(tài)遭到嚴(yán)重的破壞。植物受到生存環(huán)境的脅迫影響，因此如何提高植物應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力變得十分重要這與生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定有著密不可分的關(guān)系。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將脅迫蛋白的相關(guān)基因轉(zhuǎn)入植物就為解決這類問(wèn)題提供了一條可行的道路。重金屬污染是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)中面臨的嚴(yán)重問(wèn)題，因此深入研究植物對(duì)鎘等重金屬的耐受性的生理和分子機(jī)制在實(shí)踐和理論方面都有著重要的價(jià)值和意義。不同的植物在面對(duì)鎘脅迫時(shí)所相應(yīng)的機(jī)制各不相同，而對(duì)于同一植物，用相同脅迫條件處理不同的時(shí)間導(dǎo)致脅迫蛋白的表達(dá)量也有所差異。第二章海馬齒NHX基因家族鑒定2.1實(shí)驗(yàn)方法2.1.1海馬齒基因轉(zhuǎn)錄組中鑒定NHX家族通過(guò)閱讀已有的NHX基因家族的相關(guān)報(bào)道得知，擬南芥（ArabidopsisthalialaHeynh）有8個(gè)AtNHX基因成員然后在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的搜索引擎（/）找尋這8個(gè)基因的蛋白序列、桃（PrunuspersicaBatsch）有7個(gè)PpNHX基因成員同上述的方法從桃的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（/gdr/）中搜索上述成員的蛋白序列，在NCBI中下載海馬齒全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。下載使用本地blast-2.4.+（/blast/executables/blast+/LATEST）對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，以進(jìn)行海馬齒NHX家族的鑒定工作。利用expasy（/protparam/）對(duì)搜尋出的基因進(jìn)行理化性質(zhì)的分析。使用TMHMMServerv2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。2.1.2海馬齒NHX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析使用MEGA11對(duì)從blast搜索的海馬齒（Sesuviumportulacastrum，Sp）的NHX蛋白序列、從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋的擬南芥（Arabidopsisthaliana，At）NHX蛋白序列和從桃的桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋的桃（Prunuspersica，Pp）NHX蛋白序列利用ClustalX2.1使用完全比對(duì)的方法進(jìn)行多序列比對(duì)，采用最大似然法（MaximumLikelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)為1000。使用PS軟件對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化。2.1.3海馬齒NHX蛋白的保守基序分析使用MEME（/meme/tools/meme）分析找尋的海馬齒NHX蛋白的保守基序，在軟件內(nèi)將輸出值設(shè)置為10，其他的數(shù)據(jù)采用默認(rèn)值。然后填寫好可以接受數(shù)據(jù)的郵箱，等待系統(tǒng)運(yùn)行完畢就會(huì)在郵箱中收到結(jié)果，最后將得到的海馬齒NHX的保守基序進(jìn)行美化。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.2.1海馬齒NHX基因家族鑒定將搜尋到的桃NHX基因的蛋白序列和擬南芥NHX基因的蛋白序列整合后，利用blast-2.4.+在海馬齒轉(zhuǎn)錄組的全長(zhǎng)序列中找到42個(gè)海馬齒NHX基因（表1）。本實(shí)驗(yàn)將其命名為SpNHX1~SpNHX42，經(jīng)過(guò)理化性質(zhì)得本次找尋的NHX基因的氨基酸的長(zhǎng)度在244~1232aa；蛋白質(zhì)的分子量在26.7（SpNHX12）～132.58（SpNHX24）KD；其中最大的等電點(diǎn)是SpNHX32的9.56，最小的等電點(diǎn)是SpNHX12的4.67；SpNHX的不穩(wěn)定指數(shù)在22.64~52.16，其中SpNHX6、SpNHX7、SpNHX8、SpNHX9、SpNHX10、SpNHX11、SpNHX13、SpNHX14、SpNHX15、SpNHX16、SpNHX18、SpNHX22、SpNHX24、SpNHX25、SpNHX26、SpNHX28、SpNHX29、SpNHX30、SpNHX31、SpNHX32、SpNHX33、的不穩(wěn)定指數(shù)過(guò)大，其余的海馬齒SpNHX蛋白的穩(wěn)定指數(shù)在合理范圍內(nèi)。海馬齒SpNHX16、SpNHX18、SpNHX24、SpNHX26、SpNHX28、SpNHX29、SpNHX30、SpNHX31、SpNHX32蛋白為親水性蛋白。表1海馬齒NHX蛋白的理化性質(zhì)基因IDGeneID基因名稱Genename氨基酸數(shù)Numberofaminoacids分子量Molecularweight(KD)等電點(diǎn)pI親水性Grandaverageofhydropathicity不穩(wěn)定指數(shù)Instabilityindextranscript_HQ_SP_transcript179451/f1p0/2561NHX15547735.77transcript_HQ_SP_transcript116830/f1p0/2584NHX25547735.77transcript_HQ_SP_transcript59525/f1p0/2697NHX35547735.77transcript_HQ_SP_transcript227348/f1p0/2571NHX45547935.07transcript_HQ_SP_transcript27679/f1p0/2576NHX55547935.07transcript_HQ_SP_transcript13019/f8p0/2017NHX654660.446.420.50640.68transcript_HQ_SP_transcript224745/f1p0/1971NHX754660.446.420.50640.68transcript_HQ_SP_transcript28696/f1p0/2168NHX852858.355.460.44550.65transcript_HQ_SP_transcript171893/f1p0/1991NHX950455.575.720.44248.99transcript_HQ_SP_transcript140398/f1p0/2071NHX1037341.275.460.29246.58transcript_HQ_SP_transcript143758/f1p0/2040NHX1130533.626.190.38744.67transcript_HQ_SP_transcript187653/f1p0/1692NHX1224326.704.670.93735.26transcript_HQ_SP_transcript676/f2p0/4108NHX131155127.896.040.06841.01transcript_HQ_SP_transcript212466/f1p0/4068NHX1411555342.21transcript_HQ_SP_transcript1175/f2p0/3783NHX151139126.386.020.06540.29transcript_HQ_SP_transcript93973/f1p0/3282NHX1682191.996.29-0.15543.44transcript_HQ_SP_transcript60265/f1p0/3895NHX1770077.405.790.36933.91transcript_HQ_SP_transcript113099/f1p0/4843NHX1869978.816.25-0.3850.77transcript_HQ_SP_transcript91869/f1p0/1884NHX194284539.52transcript_HQ_SP_transcript54801/f1p0/1783NHX204284539.52transcript_HQ_SP_transcript208293/f1p0/1857NHX2142847.266.140.45539.72transcript_HQ_SP_transcript87814/f1p0/3267NHX2279184.468.950.541.08transcript_HQ_SP_transcript210668/f1p0/4469NHX231230132.295.080.01939.61transcript_HQ_SP_transcript208198/f1p0/4521NHX241231132.574.99-0.00242.66transcript_HQ_SP_transcript93969/f1p0/4258NHX251042111.944.870.11342.3transcript_HQ_SP_transcript192129/f1p0/4283NHX26978105.715.04-0.0341.49transcript_HQ_SP_transcript204225/f1p0/2542NHX2747650.648.890.73133.07transcript_HQ_SP_transcript121008/f1p0/3361NHX2885094.168.81-0.72452.18transcript_HQ_SP_transcript3708/f2p0/3071NHX2981189.988.69-0.70951.91transcript_HQ_SP_transcript98884/f1p0/3064NHX3082591.458.69-0.69151.58transcript_HQ_SP_transcript3628/f2p0/3092NHX3181690.628.71-0.7350.7transcript_HQ_SP_transcript76765/f1p0/1986NHX3245149.839.56-1.02648.94transcript_HQ_SP_transcript71242/f1p0/3038NHX3333036.609.420.39850.23transcript_HQ_SP_transcript153860/f1p0/3489NHX3477786.006.690.3431.53transcript_HQ_SP_transcript163877/f1p0/3359NHX3577786.036.840.34430.23transcript_HQ_SP_transcript117343/f1p0/2254NHX3658463.755.610.5931.02transcript_HQ_SP_transcript156480/f1p0/1904NHX3744147.818.380.94829.13transcript_HQ_SP_transcript131172/f1p0/2495NHX3859063.685.660.62127.32transcript_HQ_SP_transcript211693/f1p0/2426NHX3959063.685.660.62127.32transcript_HQ_SP_transcript120207/f1p0/1904NHX4042745.577.231.06128.75transcript_HQ_SP_transcript6542/f2p0/2665NHX417786636.66transcript_HQ_SP_transcript70996/f1p0/2114NHX4229030.884.930.66622.622.2.2海馬齒NHX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析通過(guò)利用擬南芥（ArabidopsisthalialaHeynh，At）8個(gè)NHX基因、桃（PrunuspersicaBatsch，Pp）7個(gè)NHX基因及海馬齒（Sesuviumportulacastrum，Sp）NHX家族42個(gè)NHX基因的蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），根據(jù)進(jìn)化分析可以分為七個(gè)亞組。Ⅰ亞組中包含SpNHX（6、7、12、26、27、28），Ⅱ亞組包含SpNHX（18、24、30、31、37、38、41、42），SpNHX16屬Ⅳ亞組。由此可以看出NHX基因家族成員之間進(jìn)化的方向存在一定差異。圖1NHX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.1PhylogeneticrelationshipofNHXproteins2.2.3海馬齒NHX蛋白的保守基序分析通過(guò)在線軟件MEME分析SpNHX蛋白序列保守基序（圖2）。從圖3可以看出，不同SpNHX的Motif數(shù)量相差較大，為3～9個(gè)。SpNHX1、SpNHX2、SpNHX3、SpNHX4、SpNHX5均含有Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif6、Motif7、Motif8，說(shuō)明這7個(gè)基序在SpNHX（1、2、3、4、5）蛋白具有高度保守性。圖2海馬齒NHX蛋白保守基序分析Fig.2ConservedmotifanalysisofNHXproteinsinSesuviumportulacastrum2.2.4海馬齒NHX蛋白的多序列比對(duì)利用ClustalX2.1對(duì)從blast調(diào)取出的四十二條海馬齒NHX蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)使用完全比對(duì)的方法進(jìn)行分析比對(duì)（圖3）。圖中紅線框?yàn)楸Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域圖3海馬齒NHX蛋白多序列比對(duì)分析Figure3Multi-sequenceanalysisofNHXproteininSesuviumportulacastrum2.2.5海馬齒NHX蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析使用42個(gè)SpNHX的蛋白序列在蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)的網(wǎng)站進(jìn)行分析（圖4），在海馬齒的SpNHX中有35個(gè)存在多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，有7個(gè)NHX蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域（SpHNX41、SpHNX32、SpHNX31、SpHNX30、SpHNX29、SpHNX28、SpHNX18）。在含有跨膜結(jié)構(gòu)域的SpNHX蛋白中，也各有不同SpNHX13、SpNHX14、SpNHX15、SpNHX17、SpNHX22、SpNHX23、SpNHX27含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，SpNHX1、SpNHX2、SpNHX3、SpNHX4、SpNHX5、SpNHX36、SpNHX38、SpNHX39含有11個(gè)，SpNHX6、SpNHX7、SpNHX8、SpNHX9、SpNHX24、SpNHX25、SpNHX34、SpNHX35、SpNHX37、SpNHX40有10個(gè)，SpNHX19、SpNHX20、SpNHX21、SpNHX26含有7個(gè)，SpNHX10、SpNHX11含有6個(gè)，SpNHX12含有4個(gè)，SpNHX16、SpNHX33、SpNHX42只含有3個(gè)（圖4）。圖4海馬齒NHX蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4TransmembranestructurepredictionsofNHXproteinsinSesuviumportulacastrum第三章海馬齒NHX基因在逆境脅迫后的表達(dá)分析3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1供試海馬齒使用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（表2）培養(yǎng)對(duì)海馬齒進(jìn)行培養(yǎng)，海馬齒來(lái)自海南省文昌市高隆灣處。選取健康的海馬齒作為培養(yǎng)對(duì)象，從海馬齒的頂端向底端數(shù)在第三處的莖節(jié)處剪切，取下的長(zhǎng)度要大致相同。處理好的海馬齒使用可以將植物培養(yǎng)在水體的載體，培養(yǎng)在霍格蘭培養(yǎng)液中。海馬齒經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，直到其根的長(zhǎng)度達(dá)到8cm左右便可以采集使用，葉片采集五片即可。表2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配置（1倍濃度）化合物分子量貯存液液濃度貯存液液濃度每升最終溶液中貯存液的體積元素元素最終濃度g/molmmol/Lg/Lmlmmol/Lmg/LKNO3101.101000101.106.0N16000224Ca(NO3)2·4H2O236.161000236.164.0K6000235NH4H2PO4115.081000115.082.0Ca4000160MgSO4·7H2O246.481000246.491.0P200062KCL74.55251.8642.0Cl501.77H3BO361.8312.50.77732.0B250.27MnSO4·H2O169.011.00.1692.0Mn2.00.11ZnSO4·H2O287.541.00.2882.0Zn2.00.13CuSO4·5H2O249.680.250.0622.0Cu0.50.03H2MoO4161.970.250.0402.0Mo0.50.05NaFeDTPA(10%Fe)558.56430.00.3-1.0Fe16-531-33.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1基于鹽脅迫和鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因表達(dá)分析 第一組使用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天，第二組在霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中加入40mMNaCl培養(yǎng)7天，第三組在霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中加入40mMNaCl培養(yǎng)14天。鎘脅迫采用25mg/LCdCl2溶液，處理海馬齒方法和時(shí)間同上，將處理好的樣本使用干冰保存送往貝瑞和康生物技術(shù)公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。進(jìn)行鎘脅迫后海馬齒的表達(dá)分析需要FPKM值。計(jì)算方法如下：FPKM=cDNAFragments/MappedFragments(Millions)×TranscriptLength(kb)片段：與特定轉(zhuǎn)錄本比較的片段數(shù)量；匹配片段；與轉(zhuǎn)錄本匹配的片段數(shù)量；轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度（kb）：轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度。使用制圖軟件將熱圖制作出，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，從中選出具有明顯變化基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。3.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)海馬齒進(jìn)行25mg/LCdCl2脅迫處理于0（CK）、2h、4h、6h、8h、12h、7d、12d后取下的根系和葉片并錫紙包裹好，迅速放入液氮中進(jìn)行急速冷卻，分別進(jìn)行標(biāo)記然后放入超低溫冰箱進(jìn)行保存，每個(gè)處理3次重復(fù)。使用天根生化科技公司的RNA提取試劑盒DP441提取RNA，反轉(zhuǎn)錄使用GoScriptTMReverseTranscriptionSystem〔普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，A5001〕合成cDNA第一鏈。用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物（表3），并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用北京全式金生物技術(shù)公司2xTransTaqHighFidelity（HiFi）PCRSuperMix（AS131）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR需要cDNA模板、上下游引物、2×SYBRqPCRMix和雙蒸水配置為10ul的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s；95℃15s，58℃30s，72℃60s，40個(gè)循環(huán)；65℃5s；95℃變性DNA產(chǎn)物。每個(gè)基因進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)熔融曲線檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。以GAPDH作為內(nèi)參基因，穩(wěn)定性好品質(zhì)優(yōu)良的內(nèi)參基因是能夠準(zhǔn)確分析待測(cè)目的基因表達(dá)量的關(guān)鍵因素，所以進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)需要挑選合適的內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)選擇的管家基因是GAPDH，周琳在2020年發(fā)現(xiàn)GAPDH基因能夠穩(wěn)定表達(dá)在西紅花的六種不同組織間。REF_Ref1538\r\h[19]2020年劉小飛發(fā)現(xiàn)GAPDH基因在杜鵑紅山茶各器官和各時(shí)期穩(wěn)定性最佳。REF_Ref1649\r\h[20]基因的相對(duì)表達(dá)量采用Livak法計(jì)算，將在對(duì)照組的表達(dá)量定為1，其他基因及不同處理時(shí)間的表達(dá)量均與其比較進(jìn)行定量。表3用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物引物名稱引物序列（5-3）堿基數(shù)（bp）NHX7-FTGCAGGTCCTCCATCAGG18NHX7-RCATCGAACTAAGGTTGGTCATA22NHX30-FGACGGGATCAGTGACGAA18NHX30-RTGCCCTCAAACCTGCTAT18NHX31-FAGGGGCTTTGAAGGACAA18NHX31-RCCACCCAAGTGTATGACTAACT22NHX32-FGGGAACAGTGAGGACAGAAA20NHX32-RGAAGAATCGGACCTTGGAG19GAPDH-FTTGGCATCGTTGAGGGTCT19GAPDH-RCAGTGGGAACACGGAAAGC193.3結(jié)果與分析3.3.1鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的海馬齒NHX家族基因表達(dá)分析已經(jīng)有前人將鹽脅迫后海馬齒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)制作成熱圖（圖5）和對(duì)其實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究鹽脅迫后的表達(dá)規(guī)律。SpNHX的大多數(shù)成員在鹽脅迫后表達(dá)量總體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。圖5鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的海馬齒NHX家族基因表達(dá)分析Fig.5GeneexpressionanalysisofSesuviumportulacastrumNHXfamilyintranscriptomicdataundersaltstress3.3.2鎘脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的海馬齒NHX家族基因表達(dá)分析利用FPKM值制作的熱圖（圖6），對(duì)其NHX基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下，海馬齒NHX家族基因均受到不同程度的誘導(dǎo)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，本實(shí)驗(yàn)從中選出NHX7、NHX30、NHX31、NHX32具有明顯變化的四個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。Ck-14d-RCd-7d-RCk-7d-RCd-14d-APCd-7d-APCk-7d-APAP：葉片Ck-14d-RCd-7d-RCk-7d-RCd-14d-APCd-7d-APCk-7d-APAP：葉片R：根圖6鎘鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的海馬齒NHX家族基因表達(dá)分析Fig.6AnalysisofNHXfamilygeneexpressioninSesuviumportulacastrumfromtranscriptomicdataundercadmiumstress3.3.3鎘脅迫下海馬齒NHX家族的表達(dá)驗(yàn)證由圖7可以看出（圖7中的A為根部，L為葉片），在鎘脅迫下四個(gè)SpNHX基因在根和葉的表達(dá)量各有不同，隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，除了海馬齒NHX30在根部的表達(dá)量在總體表現(xiàn)上有微小上調(diào)趨勢(shì)外，其余海馬齒NHX30在葉片、NHX7在根部和葉、NHX31在根部和葉、NHX32在根部和葉基因的表達(dá)量總體都表達(dá)出下調(diào)趨勢(shì)。NHX31在根部和葉、NHX7在根部和葉處理過(guò)程中的任何時(shí)段的表達(dá)量都小于0h（空白組）。NHX32在的葉處理過(guò)程中的任何時(shí)段的表達(dá)量都小于0h，NHX32在的根在10h高于0h但是12h又降低于0h。NHX30在根部表達(dá)量在10h的表達(dá)量高于0h，在6h與0h表達(dá)量接近其余時(shí)段小于0h，NHX30在葉表達(dá)量只有在6h大于0h其余時(shí)間段均小于。從總體表達(dá)量的數(shù)值看其上調(diào)和下調(diào)的幅度在相對(duì)穩(wěn)定的區(qū)間，但是上調(diào)的數(shù)值稍微高于下調(diào)的數(shù)值。AerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialParts圖7海馬齒根系中NHX基因?qū)?5mg/LCdCl2脅迫的響應(yīng)Fig.7ResponseofNHXgenesintherootsandleavesofSesuviumportulacastrumto25mg/LCdCl2stress第四章結(jié)論Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX是植物體內(nèi)一類重要的反向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其主要作用是將Na+或K+或H+進(jìn)行跨膜反向轉(zhuǎn)運(yùn)，維持細(xì)胞內(nèi)pH和Na+的動(dòng)態(tài)平衡，在植物響應(yīng)鹽脅迫、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、離子穩(wěn)態(tài)、滲透調(diào)節(jié)等生理生化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。如今已經(jīng)有許多學(xué)者發(fā)表文章證明，植物在面對(duì)來(lái)自環(huán)境中的危害脅迫（如高溫、干旱、土地鹽堿化和土地重金屬污染等），植物中的脅迫蛋白相關(guān)基因表達(dá)會(huì)有利于植物抵御有害于其生存的危害脅迫。本實(shí)驗(yàn)采用鹽生植物海馬齒作為研究對(duì)象，用重金屬鎘對(duì)其進(jìn)行脅迫探究NHX基因家族的功能。本實(shí)驗(yàn)鑒定了海馬齒NHX基因家族的成員共42個(gè)，并對(duì)42個(gè)NHX基因家族成員進(jìn)行了理化性質(zhì)的鑒定和分析。選取四個(gè)NHX家族成員NHX7、NHX30、NHX31、NHX32，使用這四個(gè)成員進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。通過(guò)分析鎘脅迫處理時(shí)間延長(zhǎng)的表達(dá)量得知，NHX基因家族對(duì)于鎘脅迫并不敏感，而且大多數(shù)成員在鎘脅迫中沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的表達(dá)升高，但這些基因家族的某些成員如NHX30在使用25mg/LCdCl2處理6h時(shí)的葉片當(dāng)中表現(xiàn)出顯著的表達(dá)升高。可以克隆該基因家族的特定成員并確認(rèn)其功能特征。這將允許將這些成員轉(zhuǎn)移到其他植物中進(jìn)行耐受性研究。本研究結(jié)果為海馬齒NHX家族基因的克隆及功能預(yù)測(cè)提供了一定的理論參考。參考文獻(xiàn)環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部發(fā)布全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)[J].資源與人居環(huán)境,2014,(04):26-27.彭少邦,蔡樂(lè),李泗清.土壤鎘污染修復(fù)方法及生物修復(fù)研究進(jìn)展[J].環(huán)境與發(fā)展,2014,26(03):86-90.綦崢,齊越,楊紅,等.土壤重金屬鎘污染現(xiàn)狀、危害及治理措施[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2020,11(07):2286-2294.DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2020.07.048.吳雙桃.鎘污染土壤治理的研究進(jìn)展[J].廣東化工,2005,(04):40-41+50.中國(guó)植物志.北京市，中國(guó)科學(xué)院植物研究所,2007-01-01.楊成龍.海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因克隆及功能驗(yàn)證[D].海南大學(xué),2014.張利紅,李培軍,李雪梅,等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