醫(yī)院培訓課件：《腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移》

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移

肝癌肺轉(zhuǎn)移LiverMetastasisofLungCancer主要內(nèi)容一、概述二、侵襲、轉(zhuǎn)移的定義三、癌轉(zhuǎn)移的條件及特點四、腫瘤轉(zhuǎn)移過程五、腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制什么是侵襲、轉(zhuǎn)移？腫瘤侵襲（Invasion)是指惡性腫瘤細胞離開原發(fā)灶而侵犯鄰近組織并繼續(xù)增殖的過程。◆腫瘤細胞的增殖◆腫瘤從原發(fā)灶脫離—E-鈣粘連素下降◆腫瘤細胞的運動和趨化◆血管生成與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲包括四個過程是惡性腫瘤細胞脫離原發(fā)部位，通過各種渠道轉(zhuǎn)運到不連續(xù)的靶組織中繼續(xù)增殖，形成同樣性質(zhì)腫瘤的過程。遠隔部位繼發(fā)瘤形成繼發(fā)瘤繼續(xù)生長繼發(fā)瘤再侵襲轉(zhuǎn)移腫瘤轉(zhuǎn)移(Metastasis)人類對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的認識腫瘤是高度異質(zhì)性的細胞群體轉(zhuǎn)移是一個多步驟、序貫的復雜過程轉(zhuǎn)移的發(fā)生是多因素相互作用的結(jié)果（Fidler,IJ

SurgicalOncologyClinicsofNorthAmerica.2001，10（2）：257-269）

轉(zhuǎn)移有什么特點？腫瘤轉(zhuǎn)移的特點1.不同腫瘤轉(zhuǎn)移能力有差異

低轉(zhuǎn)移性：基底細胞癌、脊髓瘤、唾液腺腺樣囊性癌、軟骨肉瘤

高轉(zhuǎn)移性：甲狀腺濾泡型腺癌、

黑色素瘤2.不同類型腫瘤其轉(zhuǎn)移途徑不同淋巴道轉(zhuǎn)移癌如肺癌、

NPC血道轉(zhuǎn)移肉瘤、絨癌、腎癌前列腺癌等3.轉(zhuǎn)移的器官特異性原發(fā)瘤轉(zhuǎn)移器官乳腺癌

骨、腦、腎上腺前列腺癌骨肺小細胞癌

骨、腦、肝甲狀腺癌

骨腎癌

骨、肝、甲狀腺膀胱癌

腦睪丸癌

肝“SeedandSoil”theoryByPagetS.ThedistributionofsecondarygrowthincancerofthebreastLancet,1889Seed:tumorcellwithmetastaticpotentialSoil:microenviroment轉(zhuǎn)移器官特異性的機制(1)腫瘤細胞表型的差異

異質(zhì)性表現(xiàn)細胞表面糖蛋白復合物、抗原、酶活性、運動能力等如EGFR(-)/EGFR(+)（2）組織器官微環(huán)境差異實驗證明不同腫瘤移植于相同器官同種腫瘤移植于不同器官侵襲轉(zhuǎn)移能力有差異繼發(fā)器官微環(huán)境對腫瘤細胞的特殊親和性

①繼發(fā)器官脈管內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)②化學趨化因子作用③器官相關(guān)的免疫狀態(tài)④各種生長因子作用

腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移需要哪些條件？三、腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的條件和特點（一）轉(zhuǎn)移發(fā)生的條件

1.細胞變異—轉(zhuǎn)移異質(zhì)性瘤細胞遺傳不穩(wěn)定異質(zhì)性演進轉(zhuǎn)移亞克隆優(yōu)勢生長依據(jù)：轉(zhuǎn)移異質(zhì)性實驗依據(jù)1977FidlerCloneTissuecultureSpontaneousmetastasisNinetimesA549/CXCR2本課題組進行裸鼠體內(nèi)篩選高轉(zhuǎn)移癌株：BALB/cnudemice2.微環(huán)境和機體免疫狀態(tài)（1）毗鄰細胞旁分泌各種生長因子，促進腫瘤生長（2）血液流變學改變表現(xiàn)血漿粘稠度及紅細胞密度高（3）機體的免疫反應(yīng)（4）細胞粘附性改變瘤細胞—瘤細胞間粘附力下降瘤細胞—細胞外基質(zhì)(ECM)粘附力增高

腫瘤轉(zhuǎn)移的過程（一）原發(fā)瘤的形成與生長即正常細胞的轉(zhuǎn)化和生長?受血管生成因子和抑制因子共同調(diào)控（二）腫瘤血管生成

?始于腫瘤直徑達1-2mm

?與宿主血管網(wǎng)互相聯(lián)系（三）腫瘤細胞脫落并侵入基質(zhì)

1.瘤細胞粘附能力改變

同質(zhì)型粘附力低異質(zhì)性粘附力高易侵襲轉(zhuǎn)移細胞粘附力與轉(zhuǎn)移關(guān)系細胞系同質(zhì)粘附%轉(zhuǎn)移率%LA191.290LAD88.516LA572.532

CNE2L46313CNE2L292100異質(zhì)粘附%瘤細胞間橋粒減少瘤細胞表面負電荷增加鈣粘蛋白表達水平下降瘤細胞表面受體改變瘤細胞表面纖維連接蛋白減少有關(guān)影響因素2.瘤細胞表面負電荷增加實驗表明：細胞系電泳率轉(zhuǎn)移率%MFC-C-640.73μm/sec/v/cm7.5MFC-C-380.83μm/sec/v/cm31.4CNE2L40.76μm/sec/v/cm13CNE2L21.36μm/sec/v/cm1003.瘤細胞運動能力增強細胞系36h(μm/h)轉(zhuǎn)移率%LA11980LAD28516LA531632

CNE2L416.9413CNE2L228.94100刺激瘤細胞運動而抑制其生長，如TGF,干擾素等參與調(diào)控腫瘤細胞運動的因子促進瘤細胞運動與生長，如

EGF,肝細胞生長因子等刺激腫瘤細胞運動和侵襲的因子，如：自分泌運動因子(AMF)4.瘤細胞產(chǎn)生蛋白水解酶增加主要包括?血漿纖維蛋白溶解酶原激活物（Plasminogenactivators,PA)?組織蛋白酶(cathepsins)?

基質(zhì)金屬蛋白酶

(Matrixmetalloproteinase,MMPs）（四）瘤細胞進入脈管系統(tǒng)新生脈管管壁不完整瘤細胞通過運動、粘附、侵襲血管基底膜而進入脈管（五）瘤細胞與脈管粘附及瘤栓形成循環(huán)中的瘤細胞互相粘連或與血小板粘附形成瘤栓。瘤細胞通過粘附分子介導與內(nèi)皮細胞粘附（選擇素、整合素及其受體等）但瘤細胞與內(nèi)皮細胞粘附有異質(zhì)性（六）瘤細胞穿出血管內(nèi)皮細胞層損傷內(nèi)皮下基底膜暴露瘤細胞粘附降解基底膜瘤細胞運動進入間質(zhì)（七）轉(zhuǎn)移灶生長及再侵襲轉(zhuǎn)移瘤細胞與靶器官的實質(zhì)細胞粘附瘤細胞和靶器官分泌各種生長因子刺激瘤細胞增殖新生血管形成五、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制(一)腫瘤轉(zhuǎn)移的基因表達調(diào)控1.癌基因(Oncogenes)

研究表明：多種癌基因與轉(zhuǎn)移相關(guān)，如Myc,Mos,Raf,Fos,Ras等以Ras為例：

Ras家族：N-Ras,K-Ras,H-Ras實驗依據(jù)：Collard(1987)H-RasgeneH-RasgeneTransfection體外侵襲體內(nèi)轉(zhuǎn)移

小鼠T淋巴瘤細胞

BW5147(無侵襲轉(zhuǎn)移力）提示：H-Ras促進BW5147

侵襲轉(zhuǎn)移2.抑癌基因目前已發(fā)現(xiàn)的抑癌基因近20種如Rb,P53,P15,P16,APC等。實驗證實：高轉(zhuǎn)移肺癌細胞系PGP53wtmRNA低于正常PCR-SSCP檢測p53,CD44v突變情況P53突變CD44v6突變3.轉(zhuǎn)移抑制基因—nm23發(fā)現(xiàn)Steeg(1988)從小鼠黑色素瘤細胞系中克隆出蛋白17KD,與核苷酸二磷酸激酶(NDPK)高度同源基因定位17q22,533bp有兩個亞型H1,H2功能A.

通過與NDPK相似途徑參與細胞分化、信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控B.

影響微管的聚合以調(diào)節(jié)細胞運動C.影響G蛋白的信號轉(zhuǎn)導過程A.

在多數(shù)腫瘤中，nm23-H1表達水平與轉(zhuǎn)移潛能呈負相關(guān)B.

在癌轉(zhuǎn)移過程中，出現(xiàn)等位基因缺失，造成其蛋白功能異常C.nm23-H2基因常出現(xiàn)點突變，蛋白結(jié)構(gòu)被破壞與轉(zhuǎn)移的關(guān)系（二）粘附分子與腫瘤轉(zhuǎn)移1.粘附的類型細胞間粘附(同質(zhì)或異質(zhì)）細胞與ECM粘附2.粘附分子的種類與作用（1）整合素(integrins)?整合素為跨膜糖蛋白?由α和β兩個亞基構(gòu)成異二聚體?參與不同細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)粘附?受多種活化因子活化（2）鈣粘蛋白(Cadherin)

?為跨膜糖蛋白家族

E-CD:上皮組織

P-CD:上皮、胎盤

N-CD:神經(jīng)組織?基因定位于16q22-q23.1?E-CD和

Catenin構(gòu)成復合體介導同源細胞粘附?E-CD的低表達促進多數(shù)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移?主要介導細胞與細胞間粘附

?包括ICAM-1、VCAM-1、

NCAM等

?ICAM-1，VCAM-1過表達，腫瘤侵襲能力強?NCAM低表達，促進轉(zhuǎn)移(3)免疫球蛋白類粘附分子?包括

L-選擇素存在于白細胞表面

E-選擇素內(nèi)皮細胞

P-選擇素參與瘤細胞與血小板粘附?選擇素參與瘤細胞聚集和瘤細胞與特定內(nèi)皮細胞錨定(4)選擇素（selectins)?分標準型(CD44s)和變異型

(CD44v)

?為跨膜蛋白，細胞內(nèi)部分與細胞骨架相連，膜外部分與透明質(zhì)酸(HA)等配體作用（5）CD44分子介導細胞與細胞、細胞與ECM之間粘附，為淋巴細胞的歸巢受體具有信號轉(zhuǎn)導作用通過影響細胞粘附、運動和胞外基質(zhì)降解而參與腫瘤轉(zhuǎn)移(三)腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移1.血管生成的過程⑴血管內(nèi)皮基底膜降解⑵內(nèi)皮細胞向腫瘤組織遷移⑶內(nèi)皮細胞增殖⑷管腔及血管網(wǎng)形成⑸形成新基底膜Fig4-14CancercellsdisseminatetoremoteorgansviabloodstreamxFunctionoftumorvesselsSupplytumorswithoxygen,nutrientsandgrowthfactorsTransportofCO2andtoxiccomponentsawayfromthetissueMediatetumormetastasis2.腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)促進因子纖維母細胞生長因子(bFGF)

干擾素(INF-α,β)血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)血小板因子4TNFαPAI

PATIMPsPDEGFMMPs

IL-8

抑制因子低氧誘導VEGFmRNA表達(RT-PCR)IsoformsFoldss

VEGF1892.67±0.30(P>0.05)VEGF1652.05±0.03(P<0.01)VEGF1452.73±0.15(P<0.05)VEGF1211.65±0.01(P<0.05)低氧誘導VEGF蛋白表達(Western-Blot)VEGFinhypoxiccellswas(2.20±0.07)-foldofthatinnormoxiccells.*IndependentSamplesT-Test:t=8.944,P<0.05（四）蛋白水解酶與腫瘤轉(zhuǎn)移1.纖維蛋白溶解酶原激活劑及其抑制劑(PAandPAI)(1)PA的分類與功能

?分組織型(t-PA)和尿激酶型

(u-PA)不同的基因產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)相似，即單鏈絲氨酸蛋白酶參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程，包括細胞分化、血管生成、細胞遷移、基質(zhì)降解等luPAmRNA246bpMCNE-2ZCNE-2Z-H5CNE-2Z-H5-9圖1uPA在鼻咽癌細胞中的表達圖2各鼻咽癌細胞RT-PCR結(jié)果uPAmRNA與GAPDHmRNA灰度比值圖3uPARmRNA在鼻咽癌細胞中的表達圖4各鼻咽癌細胞RT-PCRuPARmRNA結(jié)果與GAPDHmRNA灰度比值CNE-2ZH5H5-960KD55KDWesternBlot檢測

uPAR在CNE-2Z,H5,H5-9中的表達圖5PAI-1mRNA在鼻咽癌細胞中的表達?包括PAI-1,2,3

?PAI-1為糖蛋白，52KD,PAI-2分子量46.6KD,

為u-PA抑制劑

?在多數(shù)腫瘤中高表達，提示預后好(2)PAI的分類與功能圖6各鼻咽癌細胞RT-PCR結(jié)果PAI-1mRNA與GAPDHmRNA灰度比值(1)分類與結(jié)構(gòu)

?為Zn

依賴的內(nèi)肽酶，包括膠原酶(collagenase)

明膠酶(gelatinase)

基質(zhì)溶素(tromitysinase)

膜型MMP(MT-MMPs)2.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑(MMPs/TIMPs)?能降解ECM中所有成分

?誘導和促進新生血管形成調(diào)節(jié)瘤細胞的粘附細胞外基質(zhì)（ECM）

膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖免疫組化檢測鼻咽癌組織中MMP-2,MMP-9,LMP-1的表達情況（五）機體免疫與轉(zhuǎn)移（1）NK細胞為第一道防線，無需抗原刺激可殺傷瘤細胞依據(jù)1.參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細胞小鼠環(huán)磷酰胺清除NK細胞移植腫瘤于小鼠轉(zhuǎn)移早裸小鼠T細胞缺陷，NK細胞存在移植腫瘤于小鼠轉(zhuǎn)移率相對低（2）巨噬細胞其活性與轉(zhuǎn)移抑制能力呈正相關(guān)實驗表明巨噬細胞抑制劑促進轉(zhuǎn)移巨噬細胞激活劑減少轉(zhuǎn)移（3）T細胞Ts細胞促進腫瘤生長與轉(zhuǎn)移Th細胞增強殺傷T細胞的作用殺傷T細胞抑制和殺傷瘤細胞問題與展望：轉(zhuǎn)移各步驟和不同微環(huán)境中癌細胞基因表達譜變化尚難確定各信號轉(zhuǎn)導通路之間形成的交叉對話(Cross-talking)機制有待闡明腫瘤臨床診斷、療效評價及預后判斷的敏感標記物有待確定。高通量技術(shù)平臺的建立將為腫瘤轉(zhuǎn)移研究帶來新的希望策略針對腫瘤細胞（嚴打：應(yīng)用各種細胞毒藥物）針對瘤細胞生存微環(huán)境（整治環(huán)境）二、抗轉(zhuǎn)移治療的新策略抗轉(zhuǎn)移治療的新方法1.抑制腫瘤血管生成即針對腫瘤血管形成的某些因子及其關(guān)鍵步驟進行干預⑴抑制血管內(nèi)皮細胞活化類藥物，如RhuMAbVEGF，F(xiàn)LK-1(DC101)(2)抑制血管內(nèi)皮細胞的分裂與遷移,如Angiostatin(血管抑素），endostatin（內(nèi)皮抑素），tumstatin（癌抑素），TNP-470(3)抑制基底膜或細胞外基質(zhì)降解類藥物(4)封閉整合素功能類藥物2.細胞粘附分子抑制劑與抗轉(zhuǎn)移（1）阻止粘附信號的傳遞蛋白酪氨酸激酶(PTK)

抑制劑（Genistein)（3）增強E-cadherin介導的同質(zhì)粘附（2）抑制Integrins依賴性的粘附如環(huán)孢霉素等3.蛋白酶抑制劑的應(yīng)用（1）MMPs抑制劑

a.Batimastat

為人工合成的小分子MMP

抑制劑，能與MMP活性基團結(jié)合，能抑制MMP-2,9等b.Marimastas

為第二代人工合成MMP抑制劑，副作用小，病人耐受好等，能抑制多種MMP活性

（2）uPA抑制劑如抗uPA抗體及多肽4.基因治療1.定義基因治療將正常的外源基因?qū)肷矬w或人體靶細胞內(nèi)以彌補所缺失的基因、或關(guān)閉、降低異常表達的基因，以達到治療疾病的目的。⑴增強宿主抗癌免疫⑵恢復或增強抑癌基因的功能⑶阻斷癌基因⑷增強化療和放療敏感性⑸細胞基因殺傷效應(yīng)2.腫瘤轉(zhuǎn)移基因治療的策略3.基因治療的途徑1.exvivo

途徑:將人體細胞從體內(nèi)取出,基因改造,再移植到人體中.自體,同種異體,異種細胞,同種異體或異種組織和器官等.2.invivo

途徑:直接將基因轉(zhuǎn)移到人體中,如DNA注射,口服,噴霧等.有如普通治療藥物,商業(yè)化發(fā)展方向所在.基因治療的exvivo

途徑基因治療就與打針和吃藥一樣.

基因治療的invivo

途徑舉例

nm23geneTIMPgene轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移癌細胞轉(zhuǎn)移能力降低三、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究的基本策略與技術(shù)（一）研究策略整體水平：人癌動物模型自發(fā)性癌癥動物模型誘發(fā)性癌癥動物模型可移植性癌癥動物模型（裸鼠，SCID小鼠）轉(zhuǎn)基因癌癥動物模型細胞水平（細胞培養(yǎng)、雜交瘤技術(shù)等）裸小鼠特征：外觀無毛，裸體，皮膚薄，發(fā)育遲緩。無胸腺T細胞功能欠缺無細胞毒效應(yīng)，無移植排斥成年鼠NK細胞活性增加抵抗力低11號染色體突變SCID小鼠特征(SevereCombinedImmuneDeficency)外觀正常16號染色體突變，T、B缺陷免疫學特征為T、B細胞明顯減少細胞水平（細胞培養(yǎng)技術(shù)等）組織水平研究分子水平研究染色體水平DNA水平RNA水平蛋白水平（二）高通量技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用1.常用分子生物學技術(shù)的應(yīng)用重組DNA技術(shù)PCR,RT-PCR,PCR-SSCPSouthernblot,NorthernblotWesternblot2.高通量技術(shù)的應(yīng)用染色體、DNA水平(Genomics):比較基因組雜交(CGH)RNA水平(Transcriptomics):差異顯示(DD-PCR),抑制消減雜交(SSH)，基因表達系列分析(SAGE),基因芯片(cDNAarray).蛋白質(zhì)水平(Proteomics):2-Dgels比較基因組雜交(ComparativeGenomicHybridization,CGH)

CGH原理：將兩種不同熒光標記的基因組DNA等比例與正常分裂中期染色體競爭雜交，分析每條染色體上熒光強度比率，推測待檢DNA拷貝數(shù)變化?；痉椒ǎ赫Ｖ衅谌旧w制備基因組DNA分離DNA標記雜交和染色熒光鏡檢和圖象分析TissueMicrodissection

equipmentsTissueMicrodissection

Analysisofsinglecellbyimmunohistochemicalstain(p53)V.

SequenceanalysistodetectmutationsIV.

StimulatedPCRfromsinglecellsIII.MicrodissectionofstainedsinglecellsII.p53ImmunohistochemicalstainingI.Ethanolfixation/paraffinembeddingBreastColonLaserCaptureMicrodissection(LCM)

應(yīng)用：確定腫瘤染色體區(qū)DNA擴增與丟失對腫瘤進行分期與分級診斷與鑒別診斷預后與治療反應(yīng)RNA水平(Transcriptomics)研究差異顯示