微生物限度檢查方法驗(yàn)證課件

7-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法驗(yàn)證

7-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證內(nèi)容介紹1.法規(guī)對(duì)微生物限度檢查法驗(yàn)證的要求；2.微生物的基本知識(shí)；3.微生物限度檢查法的驗(yàn)證；

4.消除供試液抑菌性的方法；

7-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證一、法規(guī)對(duì)微生物限度法驗(yàn)證的要求ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證新版GMP（歐盟GMP和ICHQ7A）：12.8分析方法驗(yàn)證：12.80分析方法應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，除非采用的方法是相關(guān)的藥典或其他法規(guī)中收載的方法。然而所有測(cè)試方法的適應(yīng)性應(yīng)當(dāng)在實(shí)際使用條件下確認(rèn)，并應(yīng)有文件記錄。12.82應(yīng)在分析儀器/設(shè)備完成確認(rèn)后，再著手分析方法的驗(yàn)證。12.83對(duì)已驗(yàn)證分析方法的任何修改均應(yīng)有完整的記錄，這類記錄應(yīng)包括修改的理由和充分的數(shù)據(jù)，以證實(shí)經(jīng)修改的方法與規(guī)定的方法同樣準(zhǔn)確、可靠。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：前言；檢驗(yàn)量；供試液制備；計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基適用性；計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證；計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的操作方法；控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：控制菌檢查的方法驗(yàn)證；控制菌檢查的內(nèi)容；標(biāo)準(zhǔn)體系。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：前言：前言中修訂了控制菌檢查的溫度，規(guī)定與細(xì)菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)溫度相同，均為30～35℃；（35～37℃30～35℃）前言中增訂了對(duì)于特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告的規(guī)定。2）檢驗(yàn)量：檢驗(yàn)量中對(duì)要求進(jìn)行沙門菌檢查的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml的規(guī)定。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：3）供試液制備：增訂了貼劑供試品的制備方法；修訂了離心沉淀法，刪除了高速離心的規(guī)定，并對(duì)該方法的使用范圍進(jìn)行了限定。10版：取一定量的供試液，500rpm離心3分鐘，取全部上清夜混合。用于細(xì)菌檢查。05版：取一定量的供試液，3000rpm離心20分鐘，棄去上清夜，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：4）計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基適用性：該部分內(nèi)容均為新增；規(guī)定了該內(nèi)容的應(yīng)用范圍：細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配置的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。采用標(biāo)準(zhǔn)菌種計(jì)數(shù)，回收率以及形態(tài)比較的判定方法。標(biāo)準(zhǔn)菌種為：大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：4）計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基適用性：枯草芽孢桿菌；白色念珠菌；黑曲霉。規(guī)定了稀釋后的工作菌液的保存條件和保存期限：菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2-8℃,可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2-8℃，在驗(yàn)證過(guò)的儲(chǔ)存期內(nèi)使用。引入了對(duì)照培養(yǎng)基的概念；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：4）計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基適用性：結(jié)果判定：若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70％，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判定培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。5）計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證：增訂了常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法的參考表格；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：5）計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證：對(duì)采用多種方法仍無(wú)法得到滿意驗(yàn)證結(jié)果的情況，提供了兩種方法：允許使用更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證，若驗(yàn)證符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)；允許選擇回收情況最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢驗(yàn)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：6）計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的操作方法：平皿法刪除了應(yīng)取2～3個(gè)連續(xù)適宜稀釋級(jí)供試液進(jìn)行檢驗(yàn)的規(guī)定；細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間：由48小時(shí)3天；霉菌、酵母菌培養(yǎng)時(shí)間：由72小時(shí)5天必要時(shí)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間：由5～7天7天。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則進(jìn)行了修訂：計(jì)數(shù)不再設(shè)置下限；以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告供試品中所含的菌數(shù)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：6）計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的操作方法：薄膜過(guò)濾法濾膜直徑調(diào)整為約50mm，并規(guī)定若采用其它直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整；總沖洗量規(guī)定不得超過(guò)1000ml。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：該部分內(nèi)容均為新增；規(guī)定了該部分內(nèi)容的應(yīng)用范圍以及檢查的項(xiàng)目；控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配置的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：采用標(biāo)準(zhǔn)菌種比較的判定方法，標(biāo)準(zhǔn)菌種包括；大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；乙型副傷寒沙門菌；銅綠假單胞菌；生孢梭菌；白色念珠菌。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：根據(jù)培養(yǎng)基的用途不同，適用性檢查項(xiàng)目包括：增菌培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力；固體培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力；培養(yǎng)基的抑制能力；固體培養(yǎng)基的指示能力；液體培養(yǎng)基的指示能力。所謂促生長(zhǎng)能力指試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，同對(duì)照培養(yǎng)基管比較，該控制菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：7）控制菌檢查的培養(yǎng)基適用性：所謂抑制能力指試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長(zhǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。所謂指示能力指試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)等應(yīng)同對(duì)照培養(yǎng)基一致。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：8）控制菌檢查的方法驗(yàn)證：刪除了陰性菌對(duì)照組的概念。9）控制菌檢查的內(nèi)容：大腸菌群的培養(yǎng)基進(jìn)行了修訂，現(xiàn)改用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，05版為膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。梭菌的增菌培養(yǎng)基修訂為梭菌增菌培養(yǎng)基，刪除了庖肉培養(yǎng)基。增訂了白色念珠菌檢查法，并增訂了與之相關(guān)的培養(yǎng)基。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證中國(guó)藥典10版同05版的主要差別：10）標(biāo)準(zhǔn)體系：菌落計(jì)數(shù)單位從“個(gè)”修訂為“cfu”；陰道、尿道給藥制劑增訂了白色念珠菌控制要求；直腸給藥制劑刪除了大腸埃希菌的控制要求。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證二、微生物的基本知識(shí)ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證什么是微生物？微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見(jiàn)的微小生物的總稱。包括屬于原核類的細(xì)菌、放線菌、支原體、立克次氏體、衣原體和藍(lán)細(xì)菌（過(guò)去稱藍(lán)藻或藍(lán)綠藻），屬于真核類的真菌（酵母菌和霉菌）、原生動(dòng)物和顯微藻類，以及屬于非細(xì)胞類的病毒、類病毒和朊病毒等。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物特點(diǎn)：種類多、分布廣;迄今為止，我們知道的微生物約有10萬(wàn)種，目前已知的種類只占地球上實(shí)際存在的微生物總數(shù)的20%。2.個(gè)體小、面積大;

物體的表面積和體積之比稱為比表面積，大腸桿菌的比表面積是人的30萬(wàn)倍。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證3.吸收多、轉(zhuǎn)化快;

如大腸桿菌在合適條件下，每小時(shí)可以消耗相當(dāng)于自身重量2000倍的糖，而人體則需要40年之久。4.適應(yīng)強(qiáng)、易變異。微生物特點(diǎn)（續(xù)）：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證三、微生物限度檢查方法的驗(yàn)證ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證

微生物限度實(shí)驗(yàn)室的要求：CP2010要求微生物限度檢查的環(huán)境需要滿足…，標(biāo)準(zhǔn)為GBT1629X-1996。懸浮粒子的要求：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度實(shí)驗(yàn)室的要求：浮游菌和沉降菌：試驗(yàn)區(qū)域的懸浮粒子、浮游菌和沉降菌應(yīng)符合接受標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)區(qū)域的環(huán)境同生產(chǎn)區(qū)一致。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證方法驗(yàn)證的必要性：環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證方法驗(yàn)證的流程：需前處理不需前處理有抑菌作用無(wú)抑菌作用樣品檢查去除抑菌作用①驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。③驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。②可以通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判斷ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證驗(yàn)證什么？1.前處理；2.去除抑菌作用；3.用到的一切。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證在驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)對(duì)每一試驗(yàn)菌逐一驗(yàn)證。

通常微生物限度檢查法驗(yàn)證包括：1.細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證定量——回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)2.控制菌檢查方法的驗(yàn)證。定性——能否生長(zhǎng)、專屬性實(shí)驗(yàn)ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法：通常微生物限度檢查有兩種方法即：1.平皿法2.薄膜過(guò)濾法。兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)：平皿法：若樣品本身的混濁，會(huì)干擾計(jì)數(shù)結(jié)果；由于接種量限制，試驗(yàn)靈敏度受局限；操作簡(jiǎn)便，設(shè)備要求低。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法：兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)薄膜過(guò)濾法：操作復(fù)雜，設(shè)備要求高；不適用于無(wú)法溶解的樣品；大體積檢驗(yàn)量，檢驗(yàn)靈敏度不受局限；樣品中的抑菌因素可被濾除；中和試劑可應(yīng)用在淋洗液中，如：?-內(nèi)酰胺酶；分散劑可作為溶劑，如十四烷酸異丙酯。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定。供試液的制備：通常供試液的制備分為：1.1液體供試品；1.2固體、半固體或粘稠性供試品；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：供試液的制備：1.3需用特殊方法制備供試液的供試品：1.3.1非水溶性供試品；

1.3.2膜劑供試品；1.3.3腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品；1.3.4氣霧劑、噴霧劑供試品；1.3.5貼劑供試品；ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：通常采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性。1.4.1培養(yǎng)基稀釋法；取規(guī)定量的供試液至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測(cè)定細(xì)菌、霉菌和酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)的供試液2ml，每毫升供試液可等量分注多個(gè)平皿培養(yǎng)計(jì)數(shù)。每毫升供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌落數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)?？刂凭鷻z查時(shí)可加大培養(yǎng)基的用量。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：1.4.2離心沉淀法；取一定量的供試液，500rpm離心3分鐘，取全部上清夜混合。該方法僅適用于細(xì)菌計(jì)數(shù)或控制菌（細(xì)菌）檢查。該方法只用于去除供試液中的沉淀物。采用該方法時(shí)，供試液中的樣品顆粒大小、粘稠度及污染的微生物大小等直接影響著樣品中微生物的回收，易造成檢驗(yàn)結(jié)果不能真實(shí)反應(yīng)供試品的污染情況。因此，供試液制備時(shí)盡量避免使用該方法，更不易采用高速離心沉降集菌。

ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：1.4.2離心沉淀法；例如：小兒驚風(fēng)散。本法操作較煩瑣，藥品中污染的微生物有一定的損失。1.4.3薄膜過(guò)濾法；

通常薄膜孔徑應(yīng)不大于0.45um，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。濾器和濾膜在使用前采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。使用ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：時(shí)應(yīng)保證濾膜的在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試液其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。供試液經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過(guò)1000ml.例如：葡萄糖酸洗必泰含漱劑、氯霉素滴眼等。注意：供試液應(yīng)加入較多量的稀釋液稀釋后，再注入濾器中ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：供試液的制備：1.4具有抑菌活性的供試品：1.4.4中和法；常用的中和劑或滅活方法如下：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：1.4.4中和法；例如：①磺胺類可加對(duì)氨基苯甲酸（100ml增菌培養(yǎng)基中含1%對(duì)氨基苯甲酸0.5-1.0ml）如：復(fù)方新諾明片。②含重金屬鹽類可用含巰基化合物（硫乙醇酸鈉，L-胱氨酸）的培養(yǎng)基作增菌培養(yǎng)液。如：磺胺嘧啶銀軟膏-金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌的檢驗(yàn)。③脂溶性藥物用表面活性劑中和。如：復(fù)方痔瘡栓（含洗必泰）中的綠膿桿菌的檢驗(yàn)，僅用吐溫-80制備供試液即可。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：1.4.5聯(lián)合使用；適用于抑菌作用較強(qiáng)的中西藥制劑。如：①?gòu)?fù)方洗必泰栓（水溶性基質(zhì)）金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)—用1%吐溫-80稀釋液制備供試液＋膜法過(guò)濾＋濾膜置含5%吐溫-80的硫乙醇酸鹽增菌液中→（+）；②生白安片（含鹽酸小檗胺）大腸桿菌檢驗(yàn)—低速離心＋薄膜過(guò)濾法→（+）。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：在確定中和劑是否適用于所檢樣品及其用量時(shí)，除應(yīng)證明該試劑對(duì)所檢樣品的處理有效外，還須確認(rèn)該試劑不影響樣品中可能污染的微生物的檢出（即無(wú)毒性），因此無(wú)毒性試驗(yàn)的菌株不能僅局限于驗(yàn)證試驗(yàn)菌株，而應(yīng)當(dāng)包括產(chǎn)品中可能污染的微生物。綜上，對(duì)于具有抑菌活性的供試品，為了消除供試品的抑菌性應(yīng)盡量選擇操作簡(jiǎn)便、快速的方法，同時(shí)所選用的方法應(yīng)避免損傷供試品中污染的微生物。對(duì)于抑菌活性比較強(qiáng)的供試品，在供試品溶液形狀允許的情況下，應(yīng)盡量選用薄膜過(guò)濾法。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：詳細(xì)的供試液的制備參見(jiàn)中國(guó)藥典附錄XIJ附錄107頁(yè)

微生物限度檢查法進(jìn)行。

綜上，供試液制備的目的：溶解：避免讀數(shù)時(shí)的干擾；勻質(zhì)：保證檢驗(yàn)樣品的代表性；消除抑菌因素：提高檢驗(yàn)靈敏度。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：2.菌液制備：

2.1將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h，分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每ml含50~100cfu的菌懸液。2.2將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)48h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每ml含50~100cfu的菌懸液。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：2.菌液制備：

2.3將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)5天，使大量孢子產(chǎn)生。再加入5ml含0.05％(ml/ml)聚三梨脂80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液用無(wú)菌玻棒輕輕將孢子洗脫，然后用一支管口包有無(wú)菌棉花且能過(guò)濾菌絲的10ml吸管吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05％(ml/ml)聚三梨脂80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每ml中含50~100cfu的孢子懸液。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：3.驗(yàn)證方法：驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行三次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

3.1試驗(yàn)組

平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液1ml和50~100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50~100cfu試驗(yàn)ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：3.驗(yàn)證方法：

3.1試驗(yàn)組

菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。

3.2菌液組

測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。

3.3供試品對(duì)照組取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：3.驗(yàn)證方法：

3.4稀釋劑對(duì)照組

若供試品制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50~100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：3.驗(yàn)證方法：回收率的計(jì)算：ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：3.驗(yàn)證方法：結(jié)果判斷：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，若稀釋劑對(duì)照組的菌回收率和試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，則驗(yàn)證通過(guò)。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證控制菌檢查方法的驗(yàn)證：當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。

1.供試液的制備同計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)的制備方法。

2.試驗(yàn)菌種，通?？刂凭鷻z查的菌種包括：大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；乙型副傷寒沙門菌；銅綠假單胞菌；生孢梭菌；白色念珠菌。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證控制菌檢查方法的驗(yàn)證：3.菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)48h。用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證控制菌檢查方法的驗(yàn)證：4.驗(yàn)證方法：取規(guī)定量供試液及10~100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查（詳見(jiàn)中國(guó)藥典附錄XIJ附錄111頁(yè)微生物限度檢查法）。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。

結(jié)果判斷：若上述試驗(yàn)檢出試驗(yàn)菌，則驗(yàn)證通過(guò)；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證控制菌檢查方法的驗(yàn)證：4.驗(yàn)證方法：綜上，該方法驗(yàn)證沒(méi)有進(jìn)行陰性菌對(duì)照試驗(yàn)(也就是通常我們進(jìn)行的：驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌)，因?yàn)楝F(xiàn)在微生物限度檢查時(shí)需要進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，該陰性菌對(duì)照試驗(yàn)已經(jīng)包括在培養(yǎng)基的適用性檢查中，不在重復(fù)進(jìn)行。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法的驗(yàn)證：5.報(bào)告方法：5.1采用“平均計(jì)數(shù)×稀釋倍數(shù)”的計(jì)算或報(bào)告方法；5.2若在1:10稀釋樣品中沒(méi)有檢出，報(bào)告<10cfu/g(ml)；5.3若平均值有小數(shù)，應(yīng)取整數(shù)后乘稀釋倍數(shù)，

例如：1:10稀釋樣品：平板1:1cfu；

平板2：0cfu；平均為0.5。報(bào)告結(jié)果是10cfu/ml，而不是5cfu/ml。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法的驗(yàn)證：6.注意事項(xiàng)：6.1對(duì)照培養(yǎng)基系指按培養(yǎng)基處方特別制備、質(zhì)量?jī)?yōu)良的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)基適用性檢查。由中國(guó)藥品生物制品鑒定所研制及分發(fā)。6.2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，若因沒(méi)有合適的方法消除供試品中的抑菌作用而導(dǎo)致微生物回收的失敗，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。此時(shí)更高稀釋級(jí)供試液的確認(rèn)要從低往高的稀釋級(jí)進(jìn)行，但最高稀釋級(jí)供試液應(yīng)根據(jù)供試品應(yīng)符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，如供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是每1g供試品細(xì)菌數(shù)不得過(guò)1000cfu，那么最高稀釋級(jí)是1X10-3。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法的驗(yàn)證：6.注意事項(xiàng)：6.3用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應(yīng)符合無(wú)菌檢查法要求，對(duì)用于創(chuàng)傷程度難以判定的局部給藥制劑，若沒(méi)有證據(jù)證明藥品不存在安全性風(fēng)險(xiǎn)，那么該藥品應(yīng)符合無(wú)菌檢查法要求。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法的驗(yàn)證：下列情況應(yīng)對(duì)檢查方法進(jìn)行再驗(yàn)證：檢驗(yàn)方法變更；培養(yǎng)基變更（包括，滅菌參數(shù)變更）；產(chǎn)品處方變更。

ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物限度檢查方法的驗(yàn)證：國(guó)際上微生物限度檢查方法的主要法規(guī)：USP29<61>Ph.eursupplement6th2.6.13中國(guó)藥典附錄XIJJPXVSECTION35BP2002AppendixXVIBTGAguidelines2004App17ISO14730.2ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證四、消除供試液抑菌性的方法ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證微生物檢查的主要影響因素：在藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，檢驗(yàn)結(jié)果主要受以下因素影響，①藥品本身的抑菌性；②培養(yǎng)基的促菌生長(zhǎng)能力；③培養(yǎng)條件(溫度、濕度及需氧或厭氧)；④過(guò)濾系統(tǒng)的材質(zhì)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證其中抑菌因素由于其特殊的重要性而備受關(guān)注，因此在微生物檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證（包括細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法、控制菌檢查和無(wú)菌實(shí)驗(yàn)方法）中尤其重要，也是法規(guī)審計(jì)中的重點(diǎn)關(guān)注點(diǎn)，本部分將著重對(duì)其介紹。微生物培養(yǎng)條件也是影響供試品中菌檢計(jì)數(shù)準(zhǔn)確與否的重要因素。應(yīng)注意影響結(jié)果的兩個(gè)方面：一是培養(yǎng)基本身的性質(zhì)；二是培養(yǎng)條件。通俗說(shuō)來(lái)，培養(yǎng)基應(yīng)具備應(yīng)廣譜性，即有助于供試品中所有存活微生物的生長(zhǎng)。另外，應(yīng)注意采用最佳培養(yǎng)條件，以確保微生物充分生長(zhǎng)并使計(jì)數(shù)結(jié)果呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證消除抑菌性的方法：消除藥品抑菌性常見(jiàn)的方法有：化學(xué)中和法、稀釋法和薄膜過(guò)濾淋洗法。根據(jù)產(chǎn)品的具體情況，也可將此三

種方法適當(dāng)組合使用。

1.化學(xué)中和法當(dāng)產(chǎn)品具有抑菌作用時(shí)，選用一定的化學(xué)中和劑，加入其中，以方便而快捷地中和抑菌劑，消除抑菌作用。有些化學(xué)中和劑在有效消除抑菌作用的同時(shí)，對(duì)微生物有輕微的傷害作用，這點(diǎn)應(yīng)在驗(yàn)證過(guò)程中注意。搞清產(chǎn)品是否具有抑菌作用是檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的先決條件。根據(jù)檢品抑菌作用的大小和藥典的通則要求，需設(shè)計(jì)方案，通過(guò)試驗(yàn)確認(rèn)化學(xué)中和劑的濃度、加量及其他有關(guān)的檢驗(yàn)條件。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證消除抑菌性的方法（續(xù)）：抗生素對(duì)化學(xué)抑制劑并不敏感，在無(wú)菌檢查中，應(yīng)根據(jù)具體品種采用不同的酶(如青霉素酶)將抗生素活性破壞后，方能進(jìn)行檢驗(yàn)。這類方法均須驗(yàn)證。2.消除產(chǎn)品抑菌性的第二種方法是稀釋。實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)抑菌劑的濃度與其抑菌效果相關(guān)。不同抑菌劑在不同濃度下的抑菌作用各不相同。但對(duì)某一特定的抑菌劑來(lái)說(shuō)，抑菌劑濃度與抑菌效率呈指數(shù)關(guān)系。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證消除抑菌性的方法（續(xù)）：

3.薄膜過(guò)濾法在藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，尤其是無(wú)菌檢查，常用薄膜過(guò)濾法來(lái)消除產(chǎn)品的抑菌性。該法基本原理是當(dāng)抑菌產(chǎn)品通過(guò)濾膜時(shí)，微生物被截留在濾膜上，具有抑菌作用的藥品被過(guò)濾掉，過(guò)濾過(guò)程消除了藥品的抑菌作用。經(jīng)過(guò)濾后，將濾膜置于通常為l00ml的特定培養(yǎng)基內(nèi)，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，觀察其是否有微生物生長(zhǎng)。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證消除抑菌性的方法（續(xù)）：殘留于濾膜上的抑菌劑仍有一定的抑菌作用，因此，應(yīng)盡可能采用對(duì)檢品具有低吸附性的濾膜(如聚偏四氟乙烯)，以便減少抑菌作用；此外，可通過(guò)稀釋防腐劑或淋洗濾膜的方式來(lái)進(jìn)一步消除殘留物的抑菌作用。所用的稀釋液或淋洗液應(yīng)比較溫和，如0.1％的蛋白胨水溶液。當(dāng)淋洗液中需添加化學(xué)中和劑時(shí)，要保證濾膜上的殘留物對(duì)截留在濾膜上所有微生物的生長(zhǎng)無(wú)不良影響。ReportedbyWangYanzhong2010.127-微生物限度檢查方法和驗(yàn)證消除抑菌性方法的驗(yàn)證：一、化學(xué)中和法

（一）試驗(yàn)方法按照下列要求配置三組樣品：

1.樣品組――按照常規(guī)藥品的微生物檢驗(yàn)法進(jìn)行，加入抑菌中和劑，最后接入已知量的菌株(少于100個(gè)菌)，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。2.對(duì)照組――用蛋白胨代替藥品，即以0.1%的蛋白胨溶液作為供試品，菌株接種操作同樣品組。3.菌種活性檢查組――不加抑菌中和劑，將試驗(yàn)菌株直接接種培養(yǎng)。ReportedbyWangYanzhong2010.12