骨髓造血干細(xì)胞

造血干細(xì)胞移植

進(jìn)展云南省腫瘤醫(yī)院血液科何明生博士11999年12月美國(guó)《SCIENCE》

人類干細(xì)胞研究

列入人類十大科學(xué)成就

榜首22003年度

十大科學(xué)進(jìn)展中同樣涉及了干細(xì)胞，即鼠的胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)皿中既能發(fā)育成精子也能發(fā)育成卵子，有望發(fā)展出新一代的試管嬰兒技術(shù)。

3hematopoieticstemcellinPubMedItems1-500of5666312/5/20054干細(xì)胞移植進(jìn)展

第一部分基礎(chǔ)理論第二部分實(shí)驗(yàn)技術(shù)第三部分臨床移植51．骨髓造血干細(xì)胞的基本概念骨髓造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcell,HSC)是指存在于骨髓中的一小群具有無限或較長(zhǎng)期的自我更新能力,并具有多向分化潛能的原始造血細(xì)胞61．骨髓造血干細(xì)胞的基本概念傳統(tǒng)觀念認(rèn)為HSC的生物學(xué)特征是：①具有高度增殖分裂能力；②能多向分化產(chǎn)生各系血細(xì)胞；③可移植性；④能自我更新(self-renew)，持久地維持正常造血功能。72.骨髓造血干細(xì)胞的研究歷史

82.骨髓造血干細(xì)胞的研究歷史9造血干細(xì)胞移植

在近30年里迅猛發(fā)展壯大至今

1990年，美國(guó)的Thomas因在骨髓移植中做出重要貢獻(xiàn)，從而共同獲得該年度的諾貝爾生理獎(jiǎng)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，這是臨床醫(yī)學(xué)首次獲得此項(xiàng)殊榮。103.造血干細(xì)胞的體外研究造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞分化造血干細(xì)胞向粒細(xì)胞分化造血干細(xì)胞向單核細(xì)胞分化造血干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞分化造血干細(xì)胞向血小板分化造血干細(xì)胞向NK細(xì)胞分化113.造血干細(xì)胞的體外研究造血干細(xì)胞還可向心肌細(xì)胞分化、肝細(xì)胞、神經(jīng)組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等非血液細(xì)胞分化124．造血干細(xì)胞的體內(nèi)特性骨髓造血干細(xì)胞來源于胚胎干細(xì)胞的成血－血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)由卵黃囊、胎肝、胸腺、脾、最后到骨髓，在體內(nèi)不斷增殖發(fā)育，產(chǎn)生髓系、紅細(xì)胞系和淋巴細(xì)胞系，逐步分化至各系成熟血細(xì)胞。4．造血干細(xì)胞的體內(nèi)特性134．造血干細(xì)胞的體內(nèi)特性骨髓造血干細(xì)胞在體內(nèi)具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，不斷的產(chǎn)生髓系、紅系和淋巴系細(xì)胞。4．造血干細(xì)胞的體內(nèi)特性14神經(jīng)性疾病

南佛羅里達(dá)醫(yī)學(xué)院和佐治亞醫(yī)學(xué)院的研究人員在2003年美國(guó)神經(jīng)年會(huì)上報(bào)告，將血液中的干細(xì)胞移植到卒中大鼠的大腦中能大大促進(jìn)大腦的功能恢復(fù)。15神經(jīng)性疾病巴西圣保羅大學(xué)的研究小組從30例脊椎損傷所致癱瘓患者的血液中抽取干細(xì)胞，再注入患者脊椎動(dòng)脈血管，幾個(gè)月后，12例患者的癱瘓肢體恢復(fù)了知覺。16神經(jīng)性疾病

我們與昆醫(yī)神經(jīng)科學(xué)研究所的合作研究表明，骨髓的CD34+細(xì)胞移植對(duì)恢復(fù)全脊髓損傷有治療作用，相關(guān)論文正在審稿之中。17（HSC）向神經(jīng)細(xì)胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

干細(xì)胞移植成為治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病唯一可能有效的手段。但是，目前NSC移植還未廣泛用于臨床實(shí)踐中，原因主要有3點(diǎn)：NSC取材困難，需做開顱手術(shù)，對(duì)患者創(chuàng)傷較大，給患者帶來較大痛苦。再加上神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病患者多為高齡者，故患者已經(jīng)受不住神經(jīng)干細(xì)胞移植。18（HSC）向神經(jīng)細(xì)胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

NSC分離提純技術(shù)尚未成熟，想要得到一定數(shù)量一定純度的NSC困難較大。NSC較脆弱，易受各種因素的影響，即使分離提純出NSC，也很難斷定這些神經(jīng)干細(xì)胞仍具有正常功能和特性，以及將這些“神經(jīng)干細(xì)胞”注入神經(jīng)系統(tǒng)后能否分化為一定數(shù)量的神經(jīng)細(xì)胞。19（HSC）向神經(jīng)細(xì)胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

與NSC相比HSC具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）HSC取材容易，無論是骨髓HSC還是外周血HSC的采集都具有創(chuàng)口小、患者痛苦小、安全性高的特點(diǎn)。2）HSC的分離提純技術(shù)已較為成熟，可較容易的得到一定數(shù)量一定純度的HSC。20（HSC）向神經(jīng)細(xì)胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

3）對(duì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)首先從HSC開始，因此關(guān)于HSC的研究較NSC要深入得多。4）HSC呈懸浮狀態(tài)，再采集和培養(yǎng)等過程中損傷較小。21（HSC）向神經(jīng)細(xì)胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

臨床價(jià)值可將HSC培養(yǎng)分化出“神經(jīng)細(xì)胞”的特性及功能，將這些“神經(jīng)細(xì)胞”注入神經(jīng)系統(tǒng)病變局部，從而替代或部分替代受損神經(jīng)細(xì)胞的功能治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。HSC源自患者本人，既可以避免移植后免疫排斥反應(yīng)，年齡的限制也可延長(zhǎng)。22（HSC）向神經(jīng)細(xì)胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

預(yù)期研究成果1、骨髓干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為具有神經(jīng)細(xì)胞功能的細(xì)胞2、骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)脊髓損傷有治療作用23第二部分

實(shí)驗(yàn)技術(shù)241.問題①如何取得干細(xì)胞②如何體外培養(yǎng)干細(xì)胞③如何保持體外培養(yǎng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性252.髓造血干細(xì)胞的培養(yǎng)原理骨髓造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)指在模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體外條件下，進(jìn)行干細(xì)胞的孵育培養(yǎng)，使之生存并生長(zhǎng)。造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)呈懸浮狀生長(zhǎng)，無需底物支持。1.體外培養(yǎng)原理263.動(dòng)物取材在置備細(xì)胞懸液之前須將目的細(xì)胞所在組織材料分散成單細(xì)胞。機(jī)械分離和酶學(xué)解離是將組織分散成單細(xì)胞最常用的方法。273.1細(xì)胞懸液的制備

介紹兩種方法：①在無菌條件下利用穿刺法從髂骨抽取骨髓，緩慢加入到比重為1.077g/㎝3的淋巴細(xì)胞分離液中，經(jīng)密度梯度離心吸取白細(xì)胞層，多次離心后可得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMNC），重新懸浮在含有10U/ml肝素的RPMI-1640液中，制成細(xì)胞懸液。283.1細(xì)胞懸液的制備

介紹兩種方法：②無菌條件下從髂骨抽取骨髓經(jīng)輸血濾網(wǎng)過濾后，自然沉淀，去除大部分紅細(xì)胞，再以200r/min低速離心，漂洗2～3次去除血漿，保留有核細(xì)胞。

然后加入到RPMI-1640液中，制成密度為（1～5）×107MNC/ml的細(xì)胞懸液。293.2培養(yǎng)方法兩種常用的干細(xì)胞分離方法:1、免疫親和柱分離法2、免疫磁珠分離法301）免疫親和柱分離法具體方法如下：取收集的單核細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中，并加入胎牛血清過夜，以除去貼壁的細(xì)胞，在形成玫瑰花環(huán)的細(xì)胞中直接加入生物素標(biāo)記的抗-CD34單克隆抗體，于4℃條件下旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘，然后用Hanks液清洗。311）免疫親和柱分離法將結(jié)合好的細(xì)胞放入親和層析柱中，通過親和素和生物素的結(jié)合作用，標(biāo)記的細(xì)胞被親和柱吸收，清洗親和柱除去非特異結(jié)合的細(xì)胞，即可獲得CD34＋細(xì)胞。322）免疫磁珠分離法此法特異性高、純度好、簡(jiǎn)便快速、可以處理大量的細(xì)胞樣品以滿足臨床移植的需要。33c磁珠準(zhǔn)備從被覆綿羊抗小鼠IgG1（Fc）抗體DynabeadsM-450的小瓶中（磁珠密度4×108/ml，30mg/ml），按0.5個(gè)磁珠/MNC的比例取出預(yù)計(jì)磁珠量，用RPMI/HAS漂洗后將磁鐵置于試管外壁吸引2分鐘，棄去上清液，收集磁珠，加入RPMI/HAS/IG1ml懸浮磁珠，置于冰浴中，立即使用。34d致敏細(xì)胞用CD34單克隆抗體（9C5）按0.5μg/106細(xì)胞比例致敏細(xì)胞，MNC濃度為（1～5）×107MNC/ml，混合均勻后置于4℃的旋轉(zhuǎn)混合器上以4r/min的速度低速轉(zhuǎn)動(dòng)孵育30～60分鐘，用RPMI/HAS清洗細(xì)胞后4℃低速離心5分鐘，去除未結(jié)合的單克隆抗體，最后將致敏細(xì)胞加入RPMI/HAS中形成細(xì)胞懸液。35e混合按磁珠與致敏細(xì)胞0.5:1的比例將致敏細(xì)胞與磁珠結(jié)合，在4℃旋轉(zhuǎn)混合物器上轉(zhuǎn)動(dòng)混合30分鐘，用磁鐵在管壁外吸引，收集磁珠-玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞，再用RPMI/HAS漂洗，除去非玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞。363）培養(yǎng)造血干細(xì)胞的常用方法①液體懸浮培養(yǎng)法②體外集落形成實(shí)驗(yàn)

③骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)法

④微載體-微囊培養(yǎng)技術(shù)374.鑒定結(jié)果

一般采用脾結(jié)節(jié)形成測(cè)定法，計(jì)數(shù)脾臟的結(jié)節(jié)數(shù)一個(gè)造血干細(xì)胞增殖分化成一個(gè)集落，通常植入的造血干細(xì)胞數(shù)與生成的脾結(jié)節(jié)數(shù)呈線性相關(guān)。384.鑒定結(jié)果

采用造血干細(xì)胞表面標(biāo)志即分化抗原的鑒定造血干細(xì)胞。如CD34分子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2,又稱KDR）CD133（AC133）分子。39體外細(xì)胞的生長(zhǎng)過程體外細(xì)胞培養(yǎng)的過程大致分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期三個(gè)階段。

原代培養(yǎng)期：細(xì)胞自體內(nèi)新鮮組織取出并在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)至第一次傳代的時(shí)期，約持續(xù)1～4周。此期細(xì)胞活動(dòng)較活躍40體外細(xì)胞的生長(zhǎng)過程傳代期：原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至一定時(shí)間后，達(dá)到較高密度，此時(shí)應(yīng)將原代細(xì)胞接種至其他培養(yǎng)皿中，此過程稱為傳代。衰退期：此期細(xì)胞仍在生存，但增殖很慢或不增殖。細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，直至衰退死亡。41培養(yǎng)細(xì)胞的傳代生長(zhǎng)過程細(xì)胞傳一代經(jīng)歷四個(gè)階段：滯后期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期衰退期42滯后期

包括懸浮期和潛伏期。細(xì)胞的胞質(zhì)收縮，包體呈圓球狀，懸浮于培養(yǎng)基中。經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，有活力的細(xì)胞開始附著于底物并逐漸延伸，恢復(fù)原來的形態(tài)，但還不分裂增殖。正常細(xì)胞的滯后期約為24～96小時(shí)。43對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖旺盛，開始階段細(xì)胞的增長(zhǎng)速率與最初細(xì)胞數(shù)成正比，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)。此期持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短因細(xì)胞本身的特性和培養(yǎng)條件而異，一般持續(xù)3～5天。44穩(wěn)定期此期細(xì)胞雖仍保持分裂增殖能力，但增殖的細(xì)胞數(shù)與死亡的細(xì)胞數(shù)相當(dāng)，從而處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。45衰退期處于穩(wěn)定期的細(xì)胞如不傳代或不加入新的培養(yǎng)基，則會(huì)進(jìn)入衰退期，逐漸死亡。此期死亡細(xì)胞數(shù)超過分裂細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)因此逐漸減少。46培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞周期

G1期發(fā)生在上一細(xì)胞周期的M期之后，此細(xì)胞周期S期之前，有稱為細(xì)胞分裂后期。在G1期主要發(fā)生與DNA合成前有關(guān)的生化變化。S期此期主要進(jìn)行DNA的合成，各種細(xì)胞的S期持續(xù)時(shí)間的差別較小，一般為6～8小時(shí)。47培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞周期

G2期發(fā)生在DNA合成后或細(xì)胞分裂前，有稱細(xì)胞分裂前期。G2期持續(xù)時(shí)間較短，一般為2～3小時(shí)。M期即細(xì)胞分裂期。處于分裂期的細(xì)胞是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)能力的參考指標(biāo)。此期持續(xù)時(shí)間很短，一般只有1～2小時(shí)485.注意事項(xiàng)污染預(yù)防和處理培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基的酸堿度495.注意事項(xiàng)另外①接種細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。處于靜止期的細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中開始階段生長(zhǎng)緩慢或根本不生長(zhǎng)。505.注意事項(xiàng)②細(xì)胞接種前，培養(yǎng)基要預(yù)先加熱至37℃，培養(yǎng)基的PH用CO2預(yù)先平衡。③細(xì)胞的接種密度要大于1×105/ml。51

5.注意事項(xiàng)④攪拌速度在100～300r/min的范圍內(nèi)，能夠保持細(xì)胞處于均勻的懸浮狀態(tài)即可。⑤至少每天取樣一次，檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。52

第三部分

臨床移植531.1移植的基本概念對(duì)患者進(jìn)行超大劑量化療和（或）放療以摧毀患者的造血和免疫功能，同時(shí)最大限度的殺滅腫瘤細(xì)胞，然后輸入正常供體的造血干細(xì)胞或預(yù)先采集的患者自體造血干細(xì)胞，以重建患者的造血和免疫功能，稱為造血干細(xì)胞移植技術(shù)。541.1移植的基本概念造血干細(xì)胞主要存在于單個(gè)核細(xì)胞中，表達(dá)CD34抗原。CD34+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的1%～4%。大量研究提示，CD34+HSC源于CD34-HSC，即CD34-細(xì)胞才是真正的造血干細(xì)胞。551.2骨髓移植的分類

自體骨髓造血干細(xì)胞移植（AHSCT）.同基因造血干細(xì)胞移植,即單卵孿生同胞（identicaltwin）供髓。561.2骨髓移植的分類

異基因造血干細(xì)胞移植（Allo-HSCT），包括：HLA相合或半相合的同胞供髓；HLA相合或部分相合的相關(guān)供髓；HLA相合或部分相合的無關(guān)供髓。571.3骨髓移植前的準(zhǔn)備最重要的是移植患者的準(zhǔn)備58①系統(tǒng)檢查及注意事項(xiàng)a．原發(fā)病狀況b．心，肺，肝，腎功能c．糖代謝功能d．口腔科檢查此外，應(yīng)去處隱性感染灶，如耳、鼻、喉、肛周等處的病灶。59②全環(huán)境保護(hù)全環(huán)境保護(hù)（tTEP）包括口服腸道不吸收抗生素（常用抗生素有黃連素、慶、無菌飲食、皮膚清潔消毒和眼、耳、鼻、口腔、臍、陰道等部位的消毒；住空氣層流病房（LAFR）等。60②全環(huán)境保護(hù)TEP的時(shí)間應(yīng)持續(xù)10～14天左右，其目的是盡量減少患者體內(nèi)致病菌的負(fù)荷，從而最大限度地降低骨髓移植后感染的發(fā)生率。61③移植前預(yù)防感染的措施清除感染灶及體內(nèi)已存在的病原體，以防預(yù)處理激活體內(nèi)已存在的病原體。a．細(xì)菌感染的預(yù)防b．真菌感染的預(yù)防c．病毒感染的預(yù)防621.4供者的選擇骨髓移植供髓者的選擇關(guān)系到骨髓移植的方法、預(yù)處理方案、移植后處理及預(yù)后等。631.4供者的選擇供受者之間HLA相合與否直接影響著造血干細(xì)胞移植的成敗，所以通過HLA的檢測(cè)來篩選供者。641.4供者的選擇HLA基因系統(tǒng)是人類主要組織相容性復(fù)合體。由一系列緊密連鎖的基因坐位所組成的HLA系統(tǒng)構(gòu)成了人體生物學(xué)的“身份證”。651.4供者的選擇個(gè)體的免疫活性細(xì)胞均以HLA作為識(shí)別“自己”與“非己”的標(biāo)志，從而通過免疫反應(yīng)排除“非己”，保持“自體”的完整性。661.5移植免疫學(xué)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)三大支柱：1、神經(jīng)生物學(xué)：解決生物信息如何傳遞問題2、分子免疫學(xué)：認(rèn)識(shí)自己和排斥異己的問題3、分子生物學(xué)：研究分子機(jī)制的方法和工具671.6骨髓造血干細(xì)胞的采集麻醉抗凝采髓前準(zhǔn)備骨髓采集采髓部位為髂后上棘，多點(diǎn)穿刺，分次采取。采集的有核細(xì)胞數(shù)應(yīng)＞2×108/kg，CD34+細(xì)胞應(yīng)＞2×106/kg。1.5骨髓造血干細(xì)胞的采集681.7預(yù)處理移植前的預(yù)處理是指移植前14天到移植時(shí)給予患者的化學(xué)藥物治療及放射治療。691)目的①最大限度的消滅患者體內(nèi)的異常克隆或腫瘤細(xì)胞，減少?gòu)?fù)發(fā)；②破壞患者免疫系統(tǒng)，為造血干細(xì)胞的植入提供條件，防止排斥反應(yīng)；③清除異常細(xì)胞，為造血干細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的植入和增殖提供必要的空間。1)目的701)目的①最大限度的消滅患者體內(nèi)的異?？寺』蚰[瘤細(xì)胞，減少?gòu)?fù)發(fā)；②破壞患者免疫系統(tǒng)，為造血干細(xì)胞的植入提供條件，防止排斥反應(yīng)；③清除異常細(xì)胞，為造血干細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的植入和增殖提供必要的空間。1)目的71①用于消除白血病細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的措施全身照射（TBI）+化療不含TBI的聯(lián)合化療72②抗腫瘤化學(xué)藥物

幾乎所有的抗白血病藥物均可用于白血病患者骨髓移植的預(yù)處理73③用于抑制受者免疫功能的藥物a．抗淋巴細(xì)胞球蛋白（ALG或ATG）b．全淋巴結(jié)照射（TLI）c．最常用藥物有環(huán)孢菌素(CSA)741.8移植并發(fā)癥1)造血和免疫功能受抑2)出血性膀胱炎3)間質(zhì)性肺炎751.8移植并發(fā)癥

4)肝靜脈閉塞病5)移植物抗宿主?。℅VHD）和移植排斥反應(yīng)6)晚期并發(fā)癥762．骨髓造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用血液病1、血液腫瘤白血病2、非血液腫瘤再生障礙性貧血2．骨髓造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用772．骨髓造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用非血液病1、實(shí)體瘤1）乳腺癌2）小細(xì)胞肺癌3）生殖腺腫瘤2．骨髓造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用78HSCandlungcancer

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HSCandbreastcancer

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12/5/2005

（fromPubMed）

792．骨髓造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用4）神經(jīng)母細(xì)胞瘤5）其他進(jìn)行造血干細(xì)胞移植的實(shí)體腫瘤還有腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、肉瘤、鼻咽癌等，有效率0～100%不等。2、自身免疫性疾病2．骨髓造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用803.移植適應(yīng)癥的擴(kuò)大與縮小1998年美國(guó)學(xué)者Goldman等干細(xì)胞移植的適應(yīng)癥分成4類：①