大腸桿菌感受態(tài)細胞的置備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化教學幻燈片_第1頁
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文檔簡介

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化

一.實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗，學習大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)方法。

二.實驗原理感受態(tài)細胞(Competentcells):受體細胞經(jīng)過一些特殊方法處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能使許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competentcell)。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化的方法：化學法：使用化學試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞；電轉(zhuǎn)化法：通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。轉(zhuǎn)化子的篩選：利用導入的DNA上的選擇性標記，區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。選擇性標記主要有兩類： 營養(yǎng)篩選標記 抗性篩選標記三．實驗方法

1．挑取大腸桿菌DH5α單菌落，接于5mLLB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜2．以1:50比例將1ml菌液轉(zhuǎn)移到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1.5－2hr左右，使A600在0.4－0.5左右3．將培養(yǎng)液4ml轉(zhuǎn)移到5ml離心管中，4℃，2000g離心3min4．棄上清，加0.5mL用冰預冷的0.1MCaCl2溶液，輕輕吹打或搖動混勻細胞注意：加入CaCl2動作需輕柔，勿劇烈震蕩，并且盡量使細胞處于低溫中5．冰上放置20min，2000g離心2min

6．棄上清，加0.1ml預冷的0.1MCaCl2溶液，輕輕吹打或搖動混勻細胞，即得感受態(tài)細胞注意：離心后觀察沉淀，如果出現(xiàn)中間空心的沉淀說明操作正常7．將取0.1ml感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加2μl質(zhì)粒，混勻，冰上放置30min8．42℃水浴90秒,在冰上放置2min9．加入0.5ml新鮮LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩約30min－45min（注：轉(zhuǎn)純質(zhì)?？墒÷?，轉(zhuǎn)連接產(chǎn)物需進行）10.取100μl涂布到含有氨芐青霉素的平板上,加X-gal/IPTG各3μL

11．倒置平皿，37℃培養(yǎng)12~16h每個平板大約20ml的培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5106

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