《重組膠原蛋白醫(yī)用敷料體外透皮吸收評(píng)價(jià)指南》

ICS11.040

CCSC30

GDMDMA

廣東省醫(yī)療器械管理學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDMDMAXXXX—XXXX

重組膠原蛋白醫(yī)用敷料體外透皮吸收評(píng)價(jià)

指南

Guidelinesforevaluatingpercutaneousabsorptioninvitroofrecombinantcollagen

medicaldressings

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

廣東省醫(yī)療器械管理學(xué)會(huì)發(fā)布

T/GDMDMAXXXX—XXXX

重組膠原蛋白醫(yī)用敷料體外透皮吸收評(píng)價(jià)指南

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了重組膠原蛋白醫(yī)用敷料透皮吸收試驗(yàn)方法的適用的范圍、術(shù)語和定義、試驗(yàn)原理、試

驗(yàn)用受試物的要求、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于重組膠原蛋白醫(yī)用敷料用于非慢性創(chuàng)面時(shí)所含重組膠原蛋白透皮吸收的評(píng)價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)

適用的敷料類型為創(chuàng)面敷貼、凝膠敷料、液體敷料、膏狀敷料。本標(biāo)準(zhǔn)并非適用于檢測所有的情況，僅

適用于皮膚透皮的最初定性評(píng)價(jià)。在某些情況下，應(yīng)進(jìn)一步參考體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

醫(yī)用敷料中常見的絲素蛋白、貽貝蛋白及其它蛋白類可參考本標(biāo)準(zhǔn)，但需要根據(jù)具體的產(chǎn)品特性進(jìn)

行評(píng)價(jià)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T27818-2011《化學(xué)品皮膚吸收體外試驗(yàn)方法》

《皮膚外用化學(xué)仿制藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》

《中華人民共和國藥典》

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

離體皮膚組織

從人或動(dòng)物體表分離出的符合體外透皮吸收試驗(yàn)需要的皮膚組織，可直接用于試驗(yàn)，或經(jīng)過一定創(chuàng)

面制備流程后用于體外透皮吸收試驗(yàn)。

創(chuàng)面

正常皮膚（組織）在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因

素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，

同時(shí)，皮膚的正常功能受損。

受試物

重組膠原蛋白經(jīng)熒光標(biāo)記后，按終產(chǎn)品生產(chǎn)工藝制備成的重組膠原蛋白醫(yī)用敷料。

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待測物

熒光標(biāo)記后的重組膠原蛋白。

終產(chǎn)品

經(jīng)受過所有加工過程處于“待上市”的醫(yī)療器械或醫(yī)療器械組件，其加工過程包括包裝以及滅菌（如

適用）。

4試驗(yàn)原理

將重組膠原蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記后配置受試物，將離體豬皮制備創(chuàng)面后進(jìn)行體外透皮吸收試驗(yàn)，用熒

光信號(hào)來定量、定性和追蹤重組膠原蛋白，從而評(píng)價(jià)重組膠原蛋白是否透過皮膚。

5受試物要求

熒光標(biāo)記

將熒光通過共價(jià)結(jié)合的方式標(biāo)記到重組膠原蛋白上，常用熒光標(biāo)記有Cy5、FITC、CyP等。

標(biāo)記率考察

應(yīng)提供標(biāo)記前后全波段吸收峰掃描圖和SDS電泳，同時(shí)報(bào)告標(biāo)記產(chǎn)物的熒光標(biāo)記率。

受試物制備

應(yīng)提供采用標(biāo)記的重組膠原蛋白制備受試物的詳細(xì)過程。受試物的制備過程應(yīng)與終產(chǎn)品的工藝過

程相同，如有不同，應(yīng)給出理由。

受試物穩(wěn)定性考察

應(yīng)在與試驗(yàn)條件相同條件下（溫度、濕度、光照程度等）考察受試物的熒光穩(wěn)定性，建議受試物穩(wěn)

定性至少考察48h。

6試驗(yàn)方法

體外透皮吸收試驗(yàn)

6.1.1擴(kuò)散池的選取

考慮到設(shè)備的可及性，建議選擇靜止式（Franz）擴(kuò)散池作為擴(kuò)散設(shè)備。

6.1.2離體皮膚組織的選取

考慮到物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性、創(chuàng)面制備的要求、以及對(duì)親水性分子來說豬皮通透性高于人

皮，離體皮膚組織選取1~2月齡巴馬豬背部或腹部皮膚，厚度1mm以下，新鮮離體皮膚組織或冷藏、冷

凍后的離體皮膚組織使用前建議采用經(jīng)皮失水儀對(duì)皮膚的經(jīng)皮失水率進(jìn)行檢測，以便了解皮膚屏障功

能的情況。

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6.1.3接收液

考慮到待測物重組膠原蛋白水溶性極好，推薦接收池的溶液為磷酸緩沖液、HBSS溶液等。溫度建議

設(shè)置為32℃±1℃。

6.1.4上樣

a)半固體、固體受試物:5mg/cm2

b)液體受試物：10μL/cm2

c)或依據(jù)產(chǎn)品說明書使用量。

6.1.5試驗(yàn)時(shí)長

依據(jù)終產(chǎn)品說明書確定產(chǎn)品每日積累使用時(shí)長，建議的試驗(yàn)時(shí)長最低為每日積累使用時(shí)長的2倍，

最低試驗(yàn)時(shí)長不低于1h，也不宜超過24h。建議至少在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)間取樣檢測，不限制期間取

樣次數(shù)。

6.1.6實(shí)驗(yàn)分組

為了去除豬皮本身的膠原蛋白帶來的誤差，設(shè)置空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組的受試物為與樣品組受試

物配方相同，但不加入重組膠原蛋白的空白對(duì)照品。樣品組的受試物是重組膠原蛋白醫(yī)用敷料?？瞻讓?duì)

照最少設(shè)置2個(gè)平行樣、樣品組最少設(shè)置4個(gè)平行樣。

6.1.7裝置準(zhǔn)備

將配套的磁子放置于擴(kuò)散池的接收池內(nèi)，并將離體皮膚組織固定于供給池和接收池之間，固定后在

接收池中加滿接收液。排盡空氣，使離體皮膚組織的底面與接收液緊密接觸。攪拌速率的選取以實(shí)現(xiàn)對(duì)

接收池內(nèi)樣品進(jìn)行充分混勻但表面無渦旋為宜。

創(chuàng)面皮膚制備

應(yīng)使用合適的方法制備皮膚創(chuàng)面，不恰當(dāng)?shù)奶幚砜赡芡耆茐慕琴|(zhì)層，使離體皮膚組織無任何屏障

功能。為了保證試驗(yàn)的順利進(jìn)行，創(chuàng)面的制備過程應(yīng)結(jié)合終產(chǎn)品的臨床用途，重點(diǎn)考慮角質(zhì)層的損傷程

度，建議保留角質(zhì)層部分屏障功能；如有穿刺或切割傷，建議損傷僅達(dá)表皮層，不傷及真皮層。

角質(zhì)層完整的皮膚經(jīng)皮失水值為＜15g/m2·h，考慮到經(jīng)皮失水值在不同部位的差異和加嚴(yán)情況，

建議造模后創(chuàng)面經(jīng)皮失水值在20g/m2·h以上。

推薦的創(chuàng)面皮膚制備方法有膠帶剝離法、微針穿刺法、砂紙擦傷法等。基于不同模型，不同受試物

條件下，造模過程和透皮試驗(yàn)均受多種因素影響，創(chuàng)面制備方法不做具體規(guī)定，試驗(yàn)人員可參考相關(guān)文

獻(xiàn)。

受試物檢測

6.3.1定量檢測

試驗(yàn)的2個(gè)空白對(duì)照平行樣和至少3個(gè)樣品組平行樣應(yīng)該用于重組膠原蛋白的定量檢測。

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熒光標(biāo)記的重組膠原蛋白的檢測可用酶標(biāo)儀或熒光分光光度計(jì)測定皮上、皮中和皮下部分的熒光

值，用熒光標(biāo)記物制備重組膠原蛋白濃度-熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算體外透皮吸收試驗(yàn)皮上、皮中和

皮下的受試物的含量。

由于分析的樣本涉及皮上、皮中和皮下三部分，且不同的基質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線有影響，因此檢測皮上、

皮中和皮下樣本的檢測方法均需要進(jìn)行方法驗(yàn)證。定量檢測的方法驗(yàn)證應(yīng)考慮方法的定量限，精密度和

準(zhǔn)確度；

定量檢測應(yīng)計(jì)算體外透皮吸收試驗(yàn)中待測物在每個(gè)擴(kuò)散池的回收率，且討論回收率的合理性。

a)原始樣本中待測物含量測定（?0）。

b)皮上待測物含量（?1）：皮膚組織表面洗出物的重組膠原蛋白含量，可包括皮膚清洗液、供給

池清洗液等部分。

c)皮中待測物含量（?2）：皮膚組織中重組膠原蛋白含量，將皮膚剪碎或磨碎后用接收池溶液進(jìn)

行提取。

d)皮下待測物含量（?3）：接收液中重組膠原蛋白的含量，包括不同時(shí)間點(diǎn)的接收液、接收池清

洗液等部分。

e)受試物回收率計(jì)算：

??+?

1+23··············································································(1)

?0

式中：

?0——原始樣本中待測物含量測定；

?1——皮上待測物含量；

?2——皮中待測物含量；

?3——皮下待測物含量。

6.3.2定性檢測

試驗(yàn)中至少1個(gè)樣品平行樣應(yīng)用于重組膠原蛋白在皮膚組織中分布的定性檢測。

進(jìn)行皮上部分待測物清洗后，從離體皮膚組織取下約1cm×1cm大小的組織塊，或浸沒于多聚甲醛

固定液后進(jìn)行冷凍切片，或直接包埋于OCT速凍后進(jìn)行冷凍切片。將制作好的冰凍切片進(jìn)行封片后使用

熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光成像，觀察皮膚組織中的重組膠原蛋白的熒光分布。

受試物透皮評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

受試物中重組膠原蛋白是否透皮，應(yīng)結(jié)合定量檢測數(shù)據(jù)和定性檢測結(jié)果綜合判斷。

a)若皮中待測物含量大于或等于零，而皮下待測物含量為零，（即?2≥0，?3=0），應(yīng)結(jié)合定性

檢測結(jié)果進(jìn)行判斷，觀察熒光標(biāo)記的重組膠原蛋白殘留部位。若熒光僅出現(xiàn)在角質(zhì)層、皮膚附

件（包括毛囊、汗腺和皮脂腺）、或創(chuàng)傷部位，則認(rèn)為受試物不透皮吸收。若還出現(xiàn)在了上述

皮膚組織之外的其它部位，建議進(jìn)一步參考體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

b)若?3＞0，則認(rèn)為透皮吸收。

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7試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告

數(shù)據(jù)

應(yīng)列出皮上、皮中和皮下部分各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的重組膠原蛋白濃度，累計(jì)總量，占理論上樣總量的比例。

試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包含方案中規(guī)定的需求，除包括應(yīng)用試驗(yàn)系統(tǒng)的證明外，還應(yīng)包含以下內(nèi)容：

a)受試物：

1)重組膠原蛋白分子量；

2)重組膠原蛋白標(biāo)記所選用熒光分子，標(biāo)記方法簡述；

3)重組膠原蛋白的標(biāo)記率；

4)受試物制備方法；

5)受試物穩(wěn)定性考察。

b)試驗(yàn)條件：

1)皮膚來源和位置、制備方法、使用前的儲(chǔ)藏條件、所有預(yù)處理(清洗、抗生素處理等)、皮

膚完整性測量、代謝狀況等；

2)創(chuàng)面造模的方法、使用的理由等；

3)擴(kuò)散池的設(shè)計(jì)、接收液的組分、接收液的溫度、采樣次數(shù)和規(guī)程；

4)分組設(shè)置、上樣量、上樣方法、上樣時(shí)長、檢測時(shí)長；

5)皮上部分重組膠原蛋白回收的詳細(xì)操作；

6)皮中部分重組膠原蛋白回收的詳細(xì)操作；

7)皮下部分重組膠原蛋白回收的詳細(xì)操作；

8)檢測方法、定量限確定的方法，以及分析方法的有效性；

9)組織切片過程的詳細(xì)操作。

c)結(jié)果：

1)皮上、皮中和皮下受試物檢測的方法驗(yàn)證結(jié)果；

2)皮上、皮中和皮下部分各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的重組膠原蛋白濃度，累計(jì)總量，占理論上樣總量的比

例；

3)皮上、皮中和皮下部分的每個(gè)反應(yīng)池的受試物回收率；

4)組織切片結(jié)果；

5)透皮與否的判斷。

d)結(jié)果討論：

結(jié)合方法驗(yàn)證結(jié)果，討論受試物回收率的合理性。結(jié)合受試物回收率結(jié)果及組織切片結(jié)果討論

受試物透皮吸收情況。

e)結(jié)論

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參考文獻(xiàn)

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