基因檢測(cè)數(shù)據(jù)分析要點(diǎn)

基因檢測(cè)數(shù)據(jù)分析要點(diǎn)ATCG二代測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)分析流程ATCG基因捕獲及高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介基因檢測(cè)數(shù)據(jù)分析要點(diǎn)及案例ATCG基因捕獲及高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介ATCG測(cè)序技術(shù)的發(fā)展ATCG測(cè)序技術(shù)的發(fā)展高通量測(cè)序:一次性對(duì)幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，又稱為下一代測(cè)序技術(shù)，其使得可對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌的分析，所以又被稱為深度測(cè)序。ATCG文庫(kù)擴(kuò)增低通量ASanger測(cè)序B高通量測(cè)序并行測(cè)序

高通量無需建立文庫(kù)，

兩端加測(cè)序接頭PCR擴(kuò)增高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序深度全基因組測(cè)序WGS30X全外顯子測(cè)序WES100X靶向測(cè)序TS300-1000X

…AAGCTTGCGACTTCAGTTAGCGCTAAG…ATCG人基因組所有區(qū)域,30億對(duì)個(gè)堿基對(duì)人基因組所有編碼區(qū)域，5000萬個(gè)堿基對(duì)感興趣的目標(biāo)區(qū)域，30-300個(gè)基因點(diǎn)突變CNV缺失1或0拷貝正常2拷貝重復(fù)>2拷貝常見的高通量測(cè)序方案ATCG目標(biāo)基因測(cè)序片段覆蓋片段GAP覆蓋度=覆蓋片段/目標(biāo)基因平均測(cè)序深度=測(cè)序片段/目標(biāo)基因測(cè)序深度：該位點(diǎn)被測(cè)到的次數(shù)A位點(diǎn)為4，B位點(diǎn)為3AB常見的高通量測(cè)序參數(shù)介紹ATCG198020082016一代測(cè)序技術(shù)常見突變熱點(diǎn)少數(shù)幾個(gè)基因1-100個(gè)位點(diǎn)某種疾病相關(guān)所有基因10-300個(gè)基因50萬個(gè)位點(diǎn)全外顯子測(cè)序22000多個(gè)基因30億個(gè)位點(diǎn)一代測(cè)序技術(shù)疾病PANEL全外顯子測(cè)序二代測(cè)序技術(shù)一代測(cè)序技術(shù)每一個(gè)人都有大約2萬多個(gè)變異位點(diǎn)，其中絕大部分都是良性變異，那么如何從2萬多個(gè)變異位點(diǎn)中找到患者真正的致病性變異位點(diǎn)？高通量測(cè)序數(shù)據(jù)解讀面臨的問題二代測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)分析流程ATCGDNA全基因組文庫(kù)制備目標(biāo)基因區(qū)域的捕獲新一代基因測(cè)序基因序列的生物信息學(xué)分析基因突變信息（SNP,InDel等）基因組打斷連接接頭文庫(kù)與捕獲探針雜交目標(biāo)區(qū)域富集高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析ATCG基因捕獲高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程ATCGRawdataCleanDataAlignmentSNP,InDelSVCNVAnnotation原始數(shù)據(jù)過濾:RawData—CleanData1）去除帶接頭2）去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)常用軟件：1.BWA2.Samtools3.Picard二代測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)分析流程ATCG測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分布圖

GC含量分布檢查1）去除帶接頭（adapter）的reads2）去除N的比例大于10%的reads3）去除低質(zhì)量reads（小于10）堿基數(shù)超過reads長(zhǎng)度比例的50%的reads原始數(shù)據(jù)過濾ATCG常用軟件：1.BWA2.Samtools3.PicardAlignment比對(duì)ATCGGATKbestPracticesandBroadpipelinesSNV和Indel注釋基因注釋突變/基因與疾病關(guān)系的注釋突變頻率注釋突變預(yù)測(cè)注釋篩選正常人頻率突變類型有無文獻(xiàn)報(bào)道可疑突變位點(diǎn)質(zhì)量控制ACMG指南臨床癥狀致病突變位點(diǎn)ATCG注釋正常數(shù)據(jù)庫(kù)1000genomeInhouseESP6500EXACDGVdbSNP……疾病相關(guān)HGMDprofessionalCOSMICDecipherClinvarOMIM……突變功能預(yù)測(cè)SIFTPolyPhen_2MutationTasterGERP++FATHMMMetaSVMCLINSIG……基本注釋CytoBand;gene;

RepeatRegionGene_region(exonic;5’UTR;3’UTR;splicing;intronic;intergenic)Effect（synonymous,nonsynonymous,splicing,stopgain,nonframeshift）OD2:NM_022162:exon8:c.G2722C:p.G908RATCG相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)功能篩選千人數(shù)據(jù)庫(kù)等OMIM家系驗(yàn)證HGMDACMG指南ACMG評(píng)判：該位點(diǎn)父母驗(yàn)證結(jié)果是新生突變；(PS)相關(guān)基因已報(bào)道，與臨床癥狀相符；(PS)正常人群中頻率低，不出現(xiàn)；(PM)ATCG二代測(cè)序報(bào)告模板ATCG基因檢測(cè)數(shù)據(jù)分析要點(diǎn)及案例臨床過濾—以臨床表型為依據(jù)進(jìn)行突變過濾

Clinicalfilter—phenotype-drivingvariantanalysis技術(shù)過濾—系統(tǒng)誤差,批次間誤差,批次控制和內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù).Technicalfilter—systematicerrors,batcherrors,batchcontrolsandinternaldatabase.流行病學(xué)過濾–人群頻率(1000G,EVS,ExAC)

Epidemiologicalfilter–populationfrequency(1000G,EVS,ExAC)突變功能過濾–非編碼區(qū),同義突變. Functionalannotations:VEP(VariantEffectPredictor)scoreorANNOVARorSnpEff遺傳過濾—遺傳模式

Geneticfilter-inheritancepattern.ATCG突變位點(diǎn)篩選方案ATCGOMIM:在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)基因遺傳和疾病表型信息基因和突變的文字描述病例記錄分子診斷參考文獻(xiàn)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)ATCGHGMD:人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)突變類型列表相應(yīng)的參考文獻(xiàn)對(duì)應(yīng)的疾病列表致病突變（DM）疑似致病突變（DM？）疾病相關(guān)的多態(tài)性變異（DP）有功能證據(jù)支持的疾病相關(guān)多態(tài)性變異（DFP）體外/實(shí)驗(yàn)室或體內(nèi)功能的多態(tài)性變異（FP）HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)ATCGClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)1.生物學(xué)意義分析突變是否會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能有無文獻(xiàn)報(bào)道突變類型正常人頻率突變位點(diǎn)的保守性2.遺傳學(xué)意義分析是否存在共分離現(xiàn)象是否存在外顯不全報(bào)道3.臨床特征分析（最重要）突變基因相關(guān)疾病是否和患者臨床特征吻合如何篩選單基因有害突變位點(diǎn)分析順序文獻(xiàn)報(bào)告過的位點(diǎn)危害性很高的突變類型（移碼突變，終止突變，剪切位點(diǎn)突變）正常人群中的頻率很低（AR：5%，AD：1%）符合該基因致病遺傳方式AD/XD顯性遺傳，het雜合突變AR/XR隱性遺傳，hom純合突變ATCG生物學(xué)遺傳學(xué)臨床學(xué)致病性分析：ACMG指南

檢測(cè)到了可以解釋臨床的基因變異，但是否真的就是患者的致病原因呢？ACMG（AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics）美國(guó)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)正常人頻率太高的多態(tài)性位點(diǎn)家族特有的良性變異真正的致病原因可能會(huì)是此基因其他更嚴(yán)重的變異（缺失重復(fù)）或其他基因的變異ATCG變異等級(jí)證據(jù)

EvidenceofpathogenicityPVS（VeryStrong）大突變：無義、移碼、起始密碼子、剪接（第1、2位）、外顯子缺失PS（Strong）文獻(xiàn)報(bào)道（HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)）自發(fā)突變－親子關(guān)系確定（家系驗(yàn)證）已有功能驗(yàn)證高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)（OR值>5;幾例病人均有）PM（Moderate）位于功能域人群數(shù)據(jù)庫(kù)不出現(xiàn)（AR，頻率低）（千人基因組、EXAC等）AR：與已知致病位點(diǎn)組成復(fù)合雜合整碼插入缺失與文獻(xiàn)報(bào)道同一位置，不同氨基酸自發(fā)突變－不確定親子關(guān)系PP（Supporting）遺傳共分離該基因很少有良性變異軟件預(yù)測(cè)均致?。⊿IFT／PolyPhen）單基因病因其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)表明致病致病性突變位點(diǎn)分級(jí)ATCG變異等級(jí)證據(jù)

EvidenceofBenignBA(Standalone)MAF>5%（任何一個(gè)正常人數(shù)據(jù)庫(kù)）BS(Strong)

大于發(fā)病率正常人也有該位點(diǎn)（前提100%外顯率）功能驗(yàn)證不致病遺傳不分離BP

（Supporting）已報(bào)道的都是大突變，發(fā)現(xiàn)的是小突變和致病位點(diǎn)位于一等位基因上Inframe插入缺失（重復(fù)區(qū)域）軟件預(yù)測(cè)均不致病不是該病致病基因其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)顯示不致病同義突變且軟件預(yù)測(cè)不影響剪接致病性突變位點(diǎn)分級(jí)ATCG致?。╬athogenic）可能致病（90%）（likelypathogenic）良性（benign）可能良性（likelybenign）致病性不明確（uncertainsignificance）I.1個(gè)PVS證據(jù)加上≥1個(gè)PS證據(jù)或≥2個(gè)PM證據(jù)或1個(gè)PM證據(jù)加上1個(gè)PP證據(jù)或≥2個(gè)PP證據(jù)

II.≥2個(gè)PS證據(jù)或

III.1個(gè)PS證據(jù)加上≥3個(gè)PM證據(jù)或2個(gè)PM加上≥2個(gè)PP證據(jù)或1個(gè)PM加上≥4個(gè)PP證據(jù)

I.1個(gè)PVS證據(jù)加上1個(gè)PM證據(jù)或

II.1個(gè)PS證據(jù)或加上1-2個(gè)PM證據(jù)或III.1個(gè)PS證據(jù)加上≥2個(gè)PP證據(jù)或IV.≥3個(gè)PM證據(jù)或V.2個(gè)PM證據(jù)加上≥2個(gè)PP證據(jù)或VI.1個(gè)PM證據(jù)加上≥4個(gè)PP證據(jù)

I.1個(gè)BA證據(jù)或

II.≥2個(gè)BS證據(jù)

I.1個(gè)BS證據(jù)加上1個(gè)BP證據(jù)或

II.≥2個(gè)BP證據(jù)

I.未滿足上述的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)或

II.良性證據(jù)與致病證據(jù)相互矛盾

ACMG致病性判定標(biāo)準(zhǔn)ATCG功能篩選千人數(shù)據(jù)庫(kù)等OMIM家系驗(yàn)證HGMDACMG指南ACMG評(píng)判：該位點(diǎn)父母驗(yàn)證結(jié)果是新生突變；(PS)相關(guān)基因已報(bào)道，與臨床癥狀相符；(PS)正常人群中頻率低，不出現(xiàn)；(PM)ATCG二代測(cè)序報(bào)告模板ATCG案例1-新生兒代謝V3檢測(cè)臨床癥狀：7歲男孩，智能低下，驚厥發(fā)作和色素減少。疾?。簯岩蔀镻KUATP7Bp.R827Q位點(diǎn)無文獻(xiàn)報(bào)道，ACMG指南評(píng)估為uncertain。且臨床癥狀與PKU相符。ATCG案例2-甲基丙二酸尿癥ATCG判斷致病性：正常人群中頻率低，不出現(xiàn)；(PM)終止突變，蛋白被截?cái)?，功能喪失?PVS)相關(guān)基因被報(bào)道與甲基丙二酸血癥相關(guān)，與臨床癥狀相符；(PS)外顯子缺失；(PVS)該位點(diǎn)被報(bào)道過與疾病相關(guān)，為致病位點(diǎn)；案例2-甲基丙二酸血癥ATCG179個(gè)基因，2844個(gè)外顯子157個(gè)變異：非同義變異43個(gè)；同義變異101個(gè)；終止突變1個(gè)；

氨基酸插入缺失2個(gè)；剪切位點(diǎn)變異10個(gè)人群中頻率<5%，且排除同義變異：剩下3個(gè)考慮隱性遺傳，臨床癥狀：剩下1個(gè)案例3-癲癇檢測(cè)特殊案例ATCG判斷致病性：正常人群中頻率低，不出現(xiàn)；(PM)終止突變，蛋白被截?cái)?，功能喪失?PVS)相關(guān)基因被報(bào)道與癲癇性腦病相關(guān)，與臨床癥狀相符；(PS)該位點(diǎn)父母驗(yàn)證結(jié)果是新發(fā)突變；(PS)該位點(diǎn)被報(bào)道過與疾病相關(guān)，為致病位點(diǎn)；案例3-癲癇檢測(cè)特殊案例判斷致病性：正常人群中頻率低，不出現(xiàn)；(PM)終止突變，蛋白被截?cái)?，功能喪失?PVS)相關(guān)基因被報(bào)道與癲癇性腦病相關(guān)，與臨床癥狀相符；(PS)該位點(diǎn)父母驗(yàn)證結(jié)果是新發(fā)突變；(PS)該位點(diǎn)被報(bào)道過與疾病相關(guān)，為致病位點(diǎn)；（PS）母親無突變，孩子有突變：新生突變；患者是男孩，X染色體上是雜合突變？

嵌合？XXY？X染色體上的片段重復(fù)？ATCG案例3-癲癇檢測(cè)特殊案例通過CNV分析，排除XXY123.……………X對(duì)CDKL5分析，排除單個(gè)外顯子的擴(kuò)增通過CDKL5：R559X測(cè)序深度分析突變頻率：112/（112+56）=65%明確為：每3個(gè)細(xì)胞中有2個(gè)細(xì)胞突變的嵌合體ATCG案例3-癲癇檢測(cè)特殊案例ATCG12已報(bào)道過的AD雜合位點(diǎn)來源于父母一方突變基因?qū)?yīng)多種疾病類型父母雙方是否有相應(yīng)的癥狀無有有明確癥狀輕微癥狀致病位點(diǎn)高度懷疑有外顯不全報(bào)道無外顯不全報(bào)道致病位點(diǎn)非致病位點(diǎn)突變位點(diǎn)是否有文獻(xiàn)報(bào)道無有對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)報(bào)道的疾病類型HGMD突變譜突變類型預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)疾病類型相關(guān)文獻(xiàn)研究突變區(qū)域檢測(cè)結(jié)果解讀相關(guān)問題ATCG第X代公司平臺(tái)名稱測(cè)序方法檢測(cè)方法大約讀長(zhǎng)優(yōu)點(diǎn)相對(duì)局限性第一代ABI/生命技術(shù)公司3130xL-3730xL桑格-毛細(xì)管電泳測(cè)序法熒光/光學(xué)600-1000高讀長(zhǎng)，準(zhǔn)確度一次性達(dá)標(biāo)率高，能很好處理重復(fù)序列和多聚序列通量低；樣品制備成本高，使之難以做大量的平行測(cè)序第二代Roche/454基因組測(cè)序儀FLX系統(tǒng)焦磷酸測(cè)序法光學(xué)230-400在第二代中最高讀長(zhǎng)；比第一代的測(cè)序通量大樣品制備較難；難于處理重復(fù)和同種堿基多聚區(qū)域；試劑沖洗帶來錯(cuò)誤累積；儀器昂貴第二代IlluminaHiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq可逆鏈終止物和合成測(cè)序法熒光/光學(xué)2x150很高測(cè)序通量?jī)x器昂貴；用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分析的費(fèi)用很高第二代ABI/Solid5500xlSolid系統(tǒng)連接測(cè)序法熒光/光學(xué)25-35很高測(cè)序通量；在廣為接受的幾種第二代平臺(tái)中，所要拼接出人類基因組的試劑成本最低測(cè)序運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)；讀長(zhǎng)短，造成成本高，數(shù)據(jù)分析困難和基因組拼接困難；儀器昂貴常見的一代、二代測(cè)序平臺(tái)ATCG橋式PCR邊合成邊測(cè)序可逆終止物Illumina測(cè)序平臺(tái)ATCG橋式PCR實(shí)驗(yàn)原理ATCG多重PCR靶向擴(kuò)增多重PCR擴(kuò)增效率的一致性一直是一大難題，同一個(gè)反應(yīng)體系中，引物越多，引物間相互干擾的問題就越嚴(yán)重，從而造成擴(kuò)增子無法被擴(kuò)增或擴(kuò)增子間擴(kuò)增不均一的問題。液相芯片捕獲法液相芯片捕獲產(chǎn)品TargetSeq可根據(jù)需求捕獲基因組序列上任意片段、任意大小的區(qū)域，可能夠檢測(cè)到已知基因的未知突變位點(diǎn)及較大區(qū)域的插入/缺失和基因融合現(xiàn)象。高通量測(cè)序關(guān)鍵技術(shù)——基因捕獲ATCGCNV檢測(cè)結(jié)果的解讀考慮因素具體意見熟悉已知的相鄰基因綜合征對(duì)經(jīng)常出現(xiàn)的和臨床典型的缺失/重復(fù)綜合征、一些低拷貝重復(fù)序列以及關(guān)鍵區(qū)域，進(jìn)行仔細(xì)的比對(duì)確認(rèn)。CNV大小CNV越大致病性的可能性越大，但是并無直接關(guān)聯(lián)，需具體分析?？紤]CNV涉及區(qū)域內(nèi)的基因1.有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道致病突變的基因2.無文獻(xiàn)報(bào)道的致病突變基因3.相關(guān)區(qū)域內(nèi)無基因本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)及外部公用數(shù)據(jù)庫(kù)CNV數(shù)據(jù)比較1.普通人群中的CNV劑量不平衡2.非致病性CNV和可疑致病CNV的大小3.注意患者性別和數(shù)據(jù)庫(kù)資料的個(gè)體性別

4.出現(xiàn)在普通人群的CNV的有效性5.“正常”個(gè)體的臨床特征ATCGCNV檢測(cè)結(jié)果的解讀考慮因素具體意見致病性變異CNV在以往的文獻(xiàn)中明確了致病的臨床意義。注：檢測(cè)到的CNV區(qū)域包括已報(bào)到過的明確致病區(qū)域。不確定臨床意義的CNV1.不確定臨床意義可能致病

a.個(gè)案報(bào)告，但具有明確的斷裂點(diǎn)和表型且和患者臨床特征相關(guān)。b.在CNV區(qū)域內(nèi)有明顯的功能和患者病因有關(guān)的基因。2.不確定臨床意義可能非致病性變異a.因CNV大小超過了實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo)準(zhǔn)而被報(bào)告，但該CNV區(qū)域內(nèi)沒有基因。b.該CNV在數(shù)據(jù)庫(kù)的少數(shù)病例中有描述，但亦非多態(tài)性。3.不確定臨床意義a.CNV區(qū)域內(nèi)包含基因，但基因是否是劑量敏感型未知。b.CNV在多個(gè)文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)的報(bào)道結(jié)果矛盾，其確切的臨床意義尚無結(jié)論。非致病性變異CNV在多個(gè)已有的文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)資料均報(bào)道為良性變異注：在定義非致病性變異時(shí)還應(yīng)注意CNV的種類。例如，某些區(qū)域的重復(fù)變異可能是非致病性的CNV，而在同一區(qū)域內(nèi)的缺失變異可能有臨床意義。

ATCG檢測(cè)結(jié)果：

1.CNV類型：缺失

2.染色體與基因組位置：[hg19]22q11.21（chr22:18856356-21739888）*13.CNV大小：2.88MbCNV檢測(cè)案例1-胎兒胎兒右位主動(dòng)脈弓，胎兒雙側(cè)腎孟分離微缺失綜合征最主要臨床表現(xiàn)有：心臟缺陷、胸腺發(fā)育不全、咽腭閉鎖不全伴腭裂、甲狀旁腺發(fā)育不全版低鈣血癥、異常面容等。ATCG該異常在正常人數(shù)據(jù)庫(kù)不出現(xiàn)，在Decipher疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道與22q11deletionsyndrome(Velocardiofacial/DiGeorgesyndrome)相關(guān)CNV檢測(cè)案例1-胎兒ATCG父親檢測(cè)結(jié)果：未檢測(cè)到22q11.21區(qū)缺失母親檢測(cè)結(jié)果：未檢測(cè)到22q11.21區(qū)缺失CNV檢測(cè)案例1-父母CNV在以往的文獻(xiàn)中明確了致病的臨床意義。致病性變異：ATCG檢測(cè)結(jié)果：1.CNV類型：重復(fù)和缺失2.染色體與基因組位置：[hg19]1p36.31（chr1：6706500-6865265）*3[hg19]13q21.1（chr13：57701609-57918855）*13.CNV大小：158.77K和217.25KCNV檢測(cè)案例2-胎兒不確定臨床意義的CNVATCGCNV檢測(cè)案例1-胎兒Thisgeneisoneoffiveidenticallociinaclusteronchromosome13q21.1.Thepredictedproteinisproline-richandcontainsseveraldopamineD4receptorsignaturesandPRINTSdomains.[providedbyRefSeq,Oct2008]ATCG檢測(cè)結(jié)果：1.CNV類型：缺失和重復(fù)2.染色體與基因組位置：[hg1