基層培訓(xùn)免疫學(xué)技術(shù)課件

免疫檢驗分為兩個局部，一局部為利用免疫檢測原理檢測免疫活性細(xì)胞、抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)，另一局部是利用免疫檢測原理檢測體液中微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素等。這些檢測結(jié)果為臨床上確定診斷、分析病情、調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后等提供了有效的實驗依據(jù)。第一節(jié)免疫學(xué)檢驗原理、特點和方法

一、免疫學(xué)檢驗原理〔一〕抗原抗體反響是抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反響。它既可發(fā)生在體內(nèi)，也可發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反響即為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反響，根據(jù)參與反響的抗原的物理性狀〔可溶性或顆粒性〕以及參與反響的條件〔電解質(zhì)、補(bǔ)體等〕不同，表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象，如沉淀、凝集、細(xì)胞溶解、補(bǔ)體結(jié)合和毒素中和等。一般將檢查血清中病原微生物抗原和抗體的試驗稱為血清學(xué)試驗。抗原抗體反響可分為兩個階段。第一階段為特異性結(jié)合階段，此階段僅需數(shù)秒至數(shù)分鐘，但并不出現(xiàn)可見的反響；第二階段為可見反響階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)、pH、溫度和補(bǔ)體等的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)聚集，出現(xiàn)凝集、沉淀、溶解和補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反響。第二階段反響較慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時。這兩個階段不能嚴(yán)格劃分，所需的時間也受多種因素的影響?！捕晨乖贵w反響的特點：1、特異性抗原抗體反響的特異性〔specificity〕是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)結(jié)合的特異性，由這兩個分子之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。形同鑰匙與鎖一樣，所以抗原抗體的結(jié)合是有高度特異性的。例如白喉抗抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。因此，在抗原抗體反響的免疫學(xué)實驗中，可以用的抗原或抗體來檢測特定的相對應(yīng)的抗體或抗原。2、比例性比例性〔proportionality〕是指抗原與抗體特異性結(jié)合反響時，生成肉眼可見結(jié)合物的量與反響物濃度的關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時，才出現(xiàn)可見反響。抗原抗體分子比例適宜的范圍，稱為抗原抗體反響的等價帶。在此范圍抗原抗體結(jié)合充分，沉淀物形成得快而多。在等價帶的前后，由于抗體和抗原的過量，上清液中可測出游離的抗體或抗原，形成的沉淀物少。當(dāng)抗體過量時，稱為前帶，抗原過量時稱為后帶。因此，在抗原抗體反響的試驗中，如果沒有產(chǎn)生肉眼可見的抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)，一方面要考慮是否有抗原與相應(yīng)的抗體存在，另一方面還必須注意到兩者反響的比例是否適當(dāng)。3、可逆性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性稱為抗原抗體結(jié)合的可逆性〔reversibility〕。由于抗原抗體的結(jié)合是分子外表的非共價鍵結(jié)合，故形成的復(fù)合物是不牢固的，在一定的條件下可以解離，所以說抗原抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一動態(tài)平衡過程。抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素：一是抗體對相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對復(fù)合物的影響。親和力高的抗體與抗原表位在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離，反之，親和力低的抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。環(huán)境因素中的過高或過低均可破壞離子間的靜電引力，使抗原抗體的結(jié)合力下降。增加離子強(qiáng)度，也可使靜電引力消失，降低抗原抗體的結(jié)合力，促使其解離。解離后的抗原和抗體仍然保持游離抗原、抗體的生物活性?！踩秤绊懣乖贵w反響的因素影響抗原抗體反響的因素較多，主要有兩方面：一是反響物自身的因素，另一方面是反響環(huán)境的因素。1、反響物自身因素〔1〕抗原抗原的理化性狀、外表抗原決定簇的種類和數(shù)目均可影響抗原抗體反響的結(jié)果。如顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生凝集現(xiàn)象；可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象；單價抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象?！?〕抗體①來源來源于不同動物的免疫血清，其反響性有差異。家兔等大多數(shù)動物的免疫血清，由于具有較寬的等價帶，與相應(yīng)抗原結(jié)合易出現(xiàn)可見的抗原抗體復(fù)合物。馬、人的免疫血清等價帶窄，抗原缺乏或過剩，均易形成可溶性復(fù)合物。單克隆抗體一般不適合用于凝集和沉淀反響。②濃度抗體的濃度往往是與抗原相對而言，二者適宜的濃度才易出現(xiàn)可見的反響結(jié)果。③特異性和親和力特異性與親和力是影響抗原抗體反響的關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確程度。診斷試劑應(yīng)盡可能選高特異性、高親和力的抗體，才能提高試驗的可靠性。2、反響的環(huán)境條件〔1〕電解質(zhì)抗原抗體結(jié)合后，由親水性向疏水性轉(zhuǎn)換過程中必須要有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物外表失去電荷，破壞水化層，使復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊凝集、沉淀。假設(shè)無電解質(zhì)存在，那么不出現(xiàn)可見反響。在抗原抗體反響中，通常使用0.85%NaCl溶液或各種緩沖液作抗原抗體的稀釋液及反響液?！?〕酸堿度抗原抗體反響必須在適宜的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過低或過高都會影響抗原抗體的反響。抗原抗體反響中一般以pH6～9為宜。有補(bǔ)體參與的反響pH為7.2～7.4，超過這個范圍會降低補(bǔ)體的酶活性而影響反響?！?〕溫度抗原抗體反響需要適宜的溫度才有利于二者結(jié)合。一般以15～40℃為宜，最適溫度為37℃。在此范圍內(nèi)，溫度越高，抗原抗體分子運動越快，碰撞接觸時機(jī)越多，兩者結(jié)合反響速度越快。但是如果溫度高于56℃，會導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物解離，甚至分子變性。溫度越低，反響速度越緩慢，但抗原抗體結(jié)合越牢固，易于觀察?！?〕振蕩在抗原抗體反響中，適當(dāng)?shù)恼駬u可促使抗原抗體分子的接觸，加速其反響。1、直接凝集反響：細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體反響，當(dāng)二者比例適當(dāng)時，出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反響。反響中的抗原稱為凝集原，參與反響的抗體稱為凝集素。常用的凝集試驗有玻片法、試管法和微量血凝反響板法?！?〕玻片凝集試驗：多用于定性。用以知抗體診斷血清與受檢菌液在玻片上混勻，放置數(shù)分鐘后如抗體與相應(yīng)抗原反響即出現(xiàn)肉眼可見的凝集反響。如沙門菌玻片凝集試驗?！?〕試管凝集試驗：多用于半定量和定量試驗，常用一定量的抗原〔細(xì)菌、細(xì)胞等〕與一系列稀釋的病人血清混合，在保溫放置后觀察結(jié)果，判定受檢血清有無相應(yīng)抗體以及效價，如肥達(dá)反響。2、間接凝集反響：將可溶性抗原〔或抗體〕先吸附或偶聯(lián)與免疫無關(guān)大小適當(dāng)?shù)念w粒外表，使之成為致敏載體顆粒，然后與相應(yīng)抗體〔或抗原〕作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反響。其敏感度比直接凝集反響高2～8倍，亦明顯高于沉淀反響。在臨床上廣泛用于各種抗體和可溶性抗原的檢測。間接凝集反響試驗可分為：〔1〕間接凝集試驗：用抗原致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體。將可溶性抗原與載體顆粒結(jié)合，再與樣品中的抗體反響，形成肉眼可見的凝集顆?；蚰瘔K者為陽性?！?〕反向間接凝集試驗：用特異性抗體致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原。臨床上用于檢測HbsAg、AFP等?！?〕間接抑制試驗：試劑為抗原致敏的顆粒載體和相應(yīng)的抗體，用于檢測標(biāo)本中與致敏抗原相同的抗原。檢測方法是將標(biāo)本與抗體試劑混合反響，然后參加致敏載體，假設(shè)出現(xiàn)凝集，說明標(biāo)本中不存在相應(yīng)抗原，抗體試劑未被結(jié)合，仍與載體上的抗原反響；如未出現(xiàn)凝集，那么說明標(biāo)本中含有相應(yīng)抗原，凝集反響被抑制?！?〕協(xié)同凝集試驗：其原理同反向間接凝集試驗，但所用的載體是金黃色葡萄球菌，其細(xì)胞壁中有A蛋白〔SPA〕，SPA具有能與特異性抗體IgG的Fc段結(jié)合的特性。當(dāng)這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體，假設(shè)與相應(yīng)抗原接觸，就會出現(xiàn)反向間接凝集反響，常用于細(xì)菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速檢測。①間接血凝試驗：是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗?？筛鶕?jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反響的強(qiáng)弱。在臨床檢測中應(yīng)用廣泛，是經(jīng)典的抗原抗體反響之一。②膠乳凝集試驗：是以聚苯乙烯膠乳微粒為載體的間接凝集試驗。③明膠凝集試驗：即以明膠顆粒為載體的間接凝集試驗。常用于血清中抗病毒抗體的檢測。

間接凝集試驗的應(yīng)用間接凝集試驗具有敏感、快速、操作簡便和不需要特殊儀器等優(yōu)點，既可以檢測抗原，又可以檢測抗體。已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗。特別是對某些疾病的診斷治療和效果的觀察有著重要的參考價值?！?〕抗體的檢測用于檢測微生物、寄生蟲等感染所產(chǎn)生的抗體及自身抗體和藥物抗體。如檢測沙門菌抗體和類風(fēng)濕因子等?！?〕抗原的檢測用于在臨床上用反向間接凝集試驗檢測甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查。在婦產(chǎn)科常用膠乳凝集試驗檢測孕婦尿中的絨毛膜促性腺激素〔HCG〕抗原。以診斷早期妊娠?！捕吵恋矸错懗恋矸错懯强扇苄钥乖c相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。沉淀反響中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖等可溶性物質(zhì)。抗原與相應(yīng)抗體再介質(zhì)中或固相外表發(fā)生特異性結(jié)合，可分為兩個階段，第一階段為抗原抗體特異性結(jié)合反響，在幾秒或幾十秒內(nèi)就可完成，出現(xiàn)可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可見。在免疫比濁法中可以測定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率比濁法。第二階段那么形成大的可見的免疫復(fù)合物，需要幾十分鐘到數(shù)小時才能完成。如沉淀線或沉淀環(huán)。沉淀反響的常用試驗方法有：1、液體內(nèi)沉淀試驗〔1〕絮狀沉淀試驗：將抗原和抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合形成絮狀沉淀物?！?〕免疫濁度測定：是將光學(xué)測量儀器與分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反響，對各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其它小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測定的方法。其原理是：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)比例結(jié)合時，在特殊緩沖液中快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反響液出現(xiàn)濁度。采用透射比濁或散射比濁的方法，根據(jù)所測的吸光度值可推算出待測抗原的量。免疫濁度測定又可分為速率比濁法和終點比濁法。其優(yōu)點是可以準(zhǔn)確定量，校正曲線比較穩(wěn)定，簡便快捷，無污染，易于自動化，也適合于大批量標(biāo)本的檢測，在臨床檢驗中得到了廣泛應(yīng)用?！踩逞a(bǔ)體結(jié)合試驗：是經(jīng)典途徑的抗原抗體反響之一，應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞和溶血劑作指示劑，建立了檢測抗原抗體與補(bǔ)體結(jié)合的方法，如檢測梅毒的華氏試驗〔現(xiàn)已被淘汰〕。但凡能激活補(bǔ)體的IgG、IgM類抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合的反響都可以用本法檢測。目前主要用于病毒性傳染病診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及一些自身抗體、腫瘤相關(guān)抗原等的檢測。第二節(jié)

免疫膠乳試驗及應(yīng)用

一、膠乳凝集試驗原理及方法〔一〕原理：膠乳凝集試驗是以聚苯乙烯膠乳顆粒為載體的間接凝集試驗。使用抗原或抗體致敏膠乳顆粒，再用此致敏膠乳檢測相應(yīng)的抗體或抗原。膠乳凝集試驗所用的膠乳顆粒是人工合成的載體，均一性較好，性能比紅細(xì)胞穩(wěn)定，但與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此膠乳凝集試驗敏感性不如血凝試驗?！捕?/p>

試驗方法：1、膠乳凝集試驗：在反響板的一格中，先加受檢標(biāo)本一滴，再加致敏膠乳一滴，連續(xù)搖動2～3min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陽性。不凝集者為陰性。同時作陰、陽性對照。2、膠乳凝集抑制試驗：先加受檢標(biāo)本一滴，再加一滴相應(yīng)抗血清混勻，再加一滴致敏膠乳抗原，連續(xù)搖動2～3min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陰性，不凝集者為陽性。〔三〕

本卷須知：1、受檢標(biāo)本和試劑的參加順序應(yīng)遵照規(guī)定的步驟，否那么無法判定結(jié)果。2、試劑一般保存在4～6℃較為適宜，膠乳試劑不能冷凍，試驗前取出待接近室溫時的溫度再使用。3、此試驗一般作定性檢測，嚴(yán)格的操作也能到達(dá)半定量的要求。滴加標(biāo)本和試劑時，液滴大小應(yīng)均勻一致，每滴約50μl。二、抗鏈球菌溶血素“O〞的測定〔一〕試驗原理：在受檢者血清標(biāo)本中，參加適量的溶血素“O〞。如標(biāo)本中含有高單位抗體，中和后那么有多余的抗體存在，與溶血素“O〞致敏的膠乳試劑反響，可出現(xiàn)清晰而均勻的凝集顆粒。〔二〕

試驗步驟：1、將溶血素“O〞貯存液用生理鹽水稀釋到每ml含5和2.5結(jié)合單位的兩種了應(yīng)用液。2、血清標(biāo)本56℃30min滅活后用生理鹽水作1：50稀釋。3、在膠乳試驗反響板上滴入稀釋血清標(biāo)本1滴，再滴加2.5結(jié)合單位應(yīng)用液1滴，輕輕搖動3min，使其均勻。4、滴加ASO膠乳1滴，輕輕搖動8min，有清晰凝集者為陽性。5、將陽性血清用5結(jié)合單位應(yīng)用液重復(fù)試驗，有清晰凝集者為強(qiáng)陽性?！踩?/p>

臨床意義1、陰性者≤250u，陽性者ASO在330～500u，強(qiáng)陽性者ASO在625u以上。2、正常健康人ASO水平隨地區(qū)、年齡、氣候、季節(jié)、環(huán)境條件不同而異，通常成人在250u以內(nèi)，3歲以下兒童在100u以內(nèi)者均屬正常。3、A群溶血性鏈球菌感染后，80%～85%的患者ASO升高。3～5周達(dá)最高值，兩個月后開始下降，6～12個月恢復(fù)到正常水平。用于診斷急性風(fēng)濕熱和慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。〔四〕本卷須知：1、患者標(biāo)本應(yīng)新鮮，如被細(xì)菌污染或嚴(yán)重溶血者，可影響結(jié)果，引起假陽性。2、高血脂標(biāo)本，試管或試劑被膽固醇污染均可出現(xiàn)假陽性。3、所用器具應(yīng)清潔，取量要準(zhǔn)確。4、溶血素“O〞單位標(biāo)定不準(zhǔn)，常可影響結(jié)果。每次試驗應(yīng)取一個的ASO單位的標(biāo)本為對照，如出現(xiàn)偏高或偏低的結(jié)果，應(yīng)重新測定溶血素“O〞的結(jié)合量。5、鏈球菌溶血素“O〞在pH6.5時活性最強(qiáng)，偏酸或偏堿均可影響結(jié)果。6、膠乳試劑不可冰凍，放置4℃冰箱可保存一年。不同膠乳商品試劑有不同要求，操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書。三、類風(fēng)濕因子RF的檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎〔RA〕是由自身抗體-免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。多發(fā)于青壯年，女性多于男性。患者由于感染、炎癥等原因產(chǎn)生了變性IgG。變性IgG成為自身抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了各種抗變性IgG抗體，即類風(fēng)濕因子RF。變性IgG與類風(fēng)濕因子結(jié)合，形成中等大小的免疫復(fù)合物，沉積于關(guān)節(jié)等部位，激活補(bǔ)體，引起慢性漸進(jìn)性免疫炎癥性損害，嚴(yán)重時可累及心、肺和血管等，免疫學(xué)檢查血清和關(guān)節(jié)滑膜液中出現(xiàn)類風(fēng)濕因子?！惨弧吃囼炘恚耗z乳凝集法，將熱凝聚IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒外表，如待測血清中含有RF，與相應(yīng)抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反響?！捕吃囼灢襟E：按試劑盒說明書操作，待測血清預(yù)先56℃30min滅活，再用0.1mol/L，pH8.2甘氨酸緩沖液作1：20～1：80稀釋，取各稀釋度血清一滴，加于反響板上，滴加RF膠乳試劑一滴，充分混勻并輕輕搖動反響板，3min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性，〔三〕臨床意義正常人用本法檢測常為陰性。陽性主要見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。另外，枯燥綜合征、冷球蛋白血癥、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可陽性。因此RF對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者并不具有嚴(yán)格的特異性，RF陽性不能作為診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的惟一標(biāo)準(zhǔn)。盡管在多種疾病RF可陽性，但是滴度均較低，隨RF滴度增加。對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷特異性也增高。多種疾病RF測定陽性率如表2。表2多種疾病RF測定陽性率-----------------------------------------------疾病RF測定陽性率-----------------------------------------------類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎79.6%系統(tǒng)性紅斑狼瘡30%枯燥綜合征95%皮肌炎80%硬皮病80%混合性結(jié)締組織病25%-----------------------------------------------本卷須知：本法檢測出陽性主要為IgM類RF，陽性血清可連續(xù)雙倍稀釋測效價。每次試驗均應(yīng)設(shè)陰、陽性對照。其它見膠乳凝集法本卷須知。〔三〕常用的標(biāo)記酶和底物〔1〕辣根過氧化物酶〔HRP〕其分子量較小，溶解性好，易于提取，來源廣泛；酶和酶標(biāo)記物性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱、耐有機(jī)溶劑作用，易于保存，價格低廉；易于標(biāo)記，標(biāo)記后活性損失很小。因此HRP是ELISA中應(yīng)用最廣的標(biāo)記用酶。〔四〕固相載體除均相酶免疫測定外，各種酶免疫測定最后都需要別離結(jié)合的酶標(biāo)記物和游離的酶標(biāo)記物。固相抗體〔抗原〕是最有效和簡便的別離方法，因此抗體〔抗原〕固相載體是固相酶免疫測定必不可少的組成成分?！?〕塑料制品：抗體或蛋白質(zhì)抗原可通過非共價或物理吸附機(jī)制結(jié)合到塑料制品外表，材料經(jīng)濟(jì)、方法簡便，目前，聚苯乙烯微量反響板是ELISA常用的固相載體?！?〕免疫微球：由聚苯乙烯材料制成的塑料微球或顆粒，其直徑常為微米或毫米，塑料微球與抗原或抗體偶聯(lián)后，結(jié)合容量大，可以均勻地分散到整個溶液中，極大地增加了反響面積，因此反響速度快，洗滌、別離也方便。〔3〕微孔濾膜載體：是一種多孔性薄膜過濾材料，如醋酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和尼龍膜等。廣泛應(yīng)用于定性或半定量斑點ELISA、免疫金標(biāo)滲濾試驗等。〔五〕免疫吸附劑是指于固相載體結(jié)合的抗原或抗體。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。目前廣泛使用的聚苯乙烯固相載體多采用吸附方式包被抗原或抗體。二、酶聯(lián)免疫吸附試驗〔一〕原理和類型酶聯(lián)免疫吸附試驗〔ELISA〕就是以酶作為標(biāo)記物、以免疫反響為根底的固相吸附測定方法。ELISA測定試劑主要包括固相包被的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和酶反響的底物等。結(jié)合在固相載體外表的抗原或抗體保持其免疫學(xué)活性，抗原或抗體的酶結(jié)合物既保存其免疫學(xué)活性，有保存酶的活性。在測定過程中，抗原抗體結(jié)合反響在固相支持物上進(jìn)行，用洗滌的方法使固相載體形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)別離，反響結(jié)果是以酶與底物作用后顯色來判斷的。顯色的深淺與臨床標(biāo)本中待測物的濃度成正比或反比關(guān)系。所以可以根據(jù)顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，可極大地放大反響結(jié)果，從而使檢測方法到達(dá)很高的敏感度。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：1、雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：〔1〕將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合抗體及雜質(zhì)?！?〕加待測標(biāo)本，與固相抗體接觸反響一段時間，標(biāo)本讓中的抗原與固相抗體結(jié)合〔孵育〕，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其它未結(jié)合物質(zhì)。〔3〕加酶標(biāo)抗體。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合〔孵育〕。形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時，固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中待測抗原的量相關(guān)?！?〕加底物顯色。復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物根據(jù)顯色的深淺可進(jìn)行該抗原的定性或定量〔酶標(biāo)儀比色或比濁〕。在臨床檢驗中，雙抗體夾心法適用于檢測各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒外表抗原〔HbsAg〕、甲胎蛋白〔AFP〕、絨毛膜促性腺激素〔HCG〕等。不能用于半抗原等小分子的測定。2、間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體〔即酶標(biāo)二抗〕檢測已與固相抗原結(jié)合受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：〔1〕將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合抗原及雜質(zhì)〔2〕加稀釋的受檢血清。血清中的特異性抗體與固相抗原結(jié)合〔孵育〕，形成固相抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下抗原抗體復(fù)合物。其它免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去?！?〕加酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白〔酶標(biāo)抗抗體〕。它與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合〔孵育〕，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，從而使該抗體間接標(biāo)記上酶。清洗后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中待測特異性抗體的量相關(guān)?！?〕加底物顯色。顯色的深淺與標(biāo)本中待測特異性抗體的量相關(guān)〔比色或比濁〕。此法主要用于對病原體抗體的檢測來進(jìn)行傳染病的診斷。主要缺點是待測標(biāo)本需要經(jīng)過稀釋后才能進(jìn)行測定，否那么血清中高濃度的非特異性IgG和其它干擾物質(zhì)回引起陰性本底過高，造成假陽性。3、雙抗原夾心法測抗體反響模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原包被固相載體和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。此法待測標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，故其敏感度高于間接法。臨床檢驗中，抗-HBs的檢測常用此法。4、競爭法測抗體其原理為待測標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中的抗體含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體越少，因此，陽性結(jié)果顯色程度要淺于陰性結(jié)果。如抗-HBc的檢測常用此法。5、捕獲法捕獲法〔亦稱反向間接法〕ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分〔如IgM〕的測定。競爭法測抗體一般僅適用于檢測IgG型抗體，IgM型抗體的檢測用于傳染病的早期診斷，如果用競爭法，即酶標(biāo)記的抗人IgM作為酶標(biāo)二抗進(jìn)行間接ELISA測定，這樣標(biāo)本中同時存在的不同濃度的IgG型抗體將與IgM抗體競爭，使結(jié)合在固相抗原上的IgM抗體相應(yīng)減少。另外，標(biāo)本中如含有類風(fēng)濕因子，也會產(chǎn)生干擾。因此一般間接法測定IgM抗體不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。而捕獲法是用抗人IgM抗體包被固相載體，以捕獲待測血清中的IgM，然后參加抗原，此抗原只于特異性的IgM結(jié)合，繼續(xù)參加酶標(biāo)記的特異性抗體，最后與底物作用，顯色深淺與標(biāo)本中特異性的IgM成正比。捕獲法常用于病毒性感染的早期診斷，如甲型肝炎病毒〔HAV〕IgM抗體的檢測。一、膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金是氯金酸在復(fù)原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，并形成帶負(fù)電的疏水溶液，由于靜電作用而形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。二、膠體金的性狀〔一〕膠體金的穩(wěn)定性膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒均勻地、穩(wěn)定地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液，因而具有膠體的多種特性，特別是對電解質(zhì)的敏感性?！捕衬z體金呈色性不同大小的膠體金呈色有一定的差異。最小的膠體金〔2～5nm〕是橙黃色的；中等大小的膠體金〔10～20nm〕是酒紅色的；較大顆粒的膠體金〔30～80nm〕那么是紫紅色的。根據(jù)這一特點，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計金顆粒的大小。〔三〕

光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個吸收峰的波長〔λmax〕在510～550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化。2、雙抗體夾心法操作和反響步驟〔1〕將標(biāo)記有抗體濾膜片的扁平塑料小盒翻開，平放于實驗臺面上，在塑料小孔內(nèi)滴加含待測抗原在標(biāo)本1～2滴，待完全滲入盒內(nèi)?！?〕在小孔內(nèi)滴加膠體金標(biāo)記抗體試劑1～2滴，待完全滲入盒內(nèi)。〔3〕

在小孔內(nèi)滴加洗滌液2～3滴，待完全滲入盒內(nèi)?！?〕在膜中央顯示有清晰的淡紅色或紅色斑點者判為陽性反響，反之那么為陰性反響。斑點呈色的深淺可提示陽性的程度。全部試驗可有5min內(nèi)完成。3、間接法操作和反響步驟〔1〕用特異性抗原包被在微孔濾膜上，滴加待測抗體后，加2～3滴洗滌液洗滌?！?〕再滴加金標(biāo)記抗體試劑1～2滴，待完全滲入盒內(nèi)，加2～3滴洗滌淮洗