《RNA建庫(kù)流程》課件

RNA建庫(kù)流程本課件旨在介紹RNA建庫(kù)的完整流程，從樣品制備到測(cè)序數(shù)據(jù)分析，并深入探討關(guān)鍵步驟和注意事項(xiàng)。課程大綱RNA提取從生物樣本中提取總RNA。RNA純化去除樣本中的DNA和蛋白等雜質(zhì)。RNA質(zhì)量檢測(cè)評(píng)估RNA的完整性和純度。rRNA去除去除樣本中的rRNA，以富集mRNA。建庫(kù)流程示意圖展示RNA建庫(kù)的各個(gè)步驟。文庫(kù)構(gòu)建將RNA片段轉(zhuǎn)化為可測(cè)序的DNA文庫(kù)。高通量測(cè)序使用高通量測(cè)序儀對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。生物信息分析對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，解讀生物學(xué)意義。RNA提取細(xì)胞裂解使用裂解液破壞細(xì)胞膜，釋放RNA。RNA分離通過(guò)離心或磁珠分離技術(shù)，去除蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分。RNA沉淀加入異丙醇或乙醇，使RNA沉淀下來(lái)。RNA洗滌用75%乙醇洗滌RNA沉淀，去除殘留雜質(zhì)。RNA溶解用RNase-free水溶解RNA，獲得最終的RNA樣本。RNA純化1去除雜質(zhì)去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂類、多糖等雜質(zhì)，確保RNA的純度和完整性。2濃縮RNA將稀釋的RNA溶液濃縮至適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度，提高RNA的濃度和質(zhì)量。3去除DNA通過(guò)DNase消化或其他方法去除殘留的DNA，確保RNA樣品中不含有DNA污染。RNA質(zhì)量檢測(cè)1RNA完整性評(píng)估RNA完整性，確保RNA未降解2RNA純度檢測(cè)RNA純度，確保RNA不受污染3RNA濃度確定RNA濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)RNA完整性評(píng)估1RNA完整性評(píng)估RNA完整性，判斷是否適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2電泳分析使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。3RIN值使用Bioanalyzer或Agilent2100檢測(cè)RNA完整性并計(jì)算RIN值。RNA定量分析核酸濃度使用NanoDrop或Qubit等儀器測(cè)定RNA的濃度，確保樣本量足夠進(jìn)行后續(xù)操作。RNA純度通過(guò)OD260/280和OD260/230比值判斷RNA純度，避免蛋白質(zhì)或其他污染物干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。rRNA去除1目的降低rRNA比例，提高mRNA比例，提高測(cè)序效率。2方法RNaseH降解rRNA，磁珠捕獲rRNA。3重要性rRNA占總RNA的80%，去除rRNA可以提高后續(xù)mRNA測(cè)序的準(zhǔn)確性。mRNA富集1去除rRNA選擇合適的試劑盒，如Oligotex、RNaseH、磁珠等進(jìn)行富集。2純化mRNA使用oligo(dT)磁珠或柱子結(jié)合mRNA，并洗脫純化。3定量分析使用NanoDrop或Qubit儀器進(jìn)行定量分析，確保mRNA濃度足夠。建庫(kù)流程示意圖RNA提取從樣本中提取高質(zhì)量的總RNARNA質(zhì)量檢測(cè)評(píng)估RNA完整性和純度文庫(kù)構(gòu)建將RNA片段化并添加接頭高通量測(cè)序利用測(cè)序儀對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建1文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量，確保測(cè)序效率2擴(kuò)增與純化擴(kuò)增文庫(kù)以獲得足夠的測(cè)序量3接頭連接連接測(cè)序接頭，方便后續(xù)測(cè)序4碎片化與末端修復(fù)將RNA片段化，并修復(fù)末端碎片化與末端修復(fù)1RNA片段化將RNA打斷成特定長(zhǎng)度的片段，便于后續(xù)建庫(kù)步驟。2末端修復(fù)對(duì)RNA片段進(jìn)行修飾，使其具有平滑的末端，有利于下一步接頭連接。3添加A尾在RNA片段的3'端添加一個(gè)A堿基，為下一步接頭連接做準(zhǔn)備。接頭連接1連接酶使用T4DNA連接酶2溫度16℃反應(yīng)15分鐘3目的將接頭連接到DNA片段兩端擴(kuò)增與純化1擴(kuò)增PCR擴(kuò)增2純化磁珠純化文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)片段大小分布使用生物分析儀或芯片檢測(cè)文庫(kù)片段大小分布，確保文庫(kù)片段大小符合預(yù)期范圍，并排除異常片段的影響。文庫(kù)濃度使用Qubit或Nanodrop等儀器檢測(cè)文庫(kù)濃度，確保文庫(kù)濃度達(dá)到測(cè)序要求，避免出現(xiàn)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量下降的情況。文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估使用AgilentBioanalyzer或TapeStation等儀器進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估，分析文庫(kù)的完整性、純度和片段大小分布，確保文庫(kù)質(zhì)量符合測(cè)序要求。測(cè)序準(zhǔn)備1文庫(kù)質(zhì)量控制對(duì)文庫(kù)進(jìn)行必要的質(zhì)量檢測(cè)，確保文庫(kù)質(zhì)量符合測(cè)序要求。2測(cè)序平臺(tái)選擇根據(jù)研究目標(biāo)和數(shù)據(jù)需求，選擇合適的測(cè)序平臺(tái)。3測(cè)序參數(shù)設(shè)置設(shè)置測(cè)序深度、讀長(zhǎng)等參數(shù)，滿足實(shí)驗(yàn)需求。4樣品準(zhǔn)備將準(zhǔn)備好的文庫(kù)進(jìn)行稀釋和混合，按照測(cè)序平臺(tái)要求進(jìn)行樣品準(zhǔn)備。高通量測(cè)序1文庫(kù)制備將待測(cè)DNA或RNA片段制備成可用于測(cè)序的文庫(kù)。2上機(jī)測(cè)序?qū)⑽膸?kù)加載到測(cè)序儀上，進(jìn)行高通量測(cè)序。3數(shù)據(jù)分析對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得生物學(xué)信息。生物信息分析1數(shù)據(jù)質(zhì)控去除低質(zhì)量reads2序列比對(duì)與注釋將reads比對(duì)到參考基因組3差異表達(dá)分析識(shí)別不同樣本間的基因表達(dá)差異4功能富集分析分析差異表達(dá)基因的功能數(shù)據(jù)質(zhì)控測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾去除低質(zhì)量reads，提高數(shù)據(jù)可靠性。堿基質(zhì)量評(píng)估分析測(cè)序質(zhì)量，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。序列長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)reads長(zhǎng)度，評(píng)估文庫(kù)構(gòu)建效果。序列比對(duì)與注釋1比對(duì)將測(cè)序得到的RNA序列與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)2注釋根據(jù)比對(duì)結(jié)果，確定RNA序列對(duì)應(yīng)于基因組中的哪個(gè)基因或轉(zhuǎn)錄本3功能分析結(jié)合基因或轉(zhuǎn)錄本的功能信息，分析RNA序列的功能差異表達(dá)分析數(shù)據(jù)預(yù)處理對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、歸一化、過(guò)濾等處理，去除噪音和偏差。差異表達(dá)基因篩選利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，篩選出不同樣本組間表達(dá)差異顯著的基因。結(jié)果可視化以火山圖、熱圖等形式展示差異表達(dá)基因的分析結(jié)果。功能富集分析1基因集富集分析確定差異表達(dá)基因集中富集的生物學(xué)通路或功能。2GO富集分析分析差異表達(dá)基因集在基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)中富集的條目。3KEGG富集分析分析差異表達(dá)基因集在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中富集的代謝通路或信號(hào)通路。通路分析1KEGGKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes2GOGeneOntology3ReactomeAcuratedknowledgebaseofbiologicalpathwaysandreactions驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1qRT-PCR驗(yàn)證獨(dú)立樣本驗(yàn)證差異表達(dá)基因2WesternBlot驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平變化3功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因功能影響qRT-PCR驗(yàn)證1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇合適的內(nèi)參基因和目的基因。2RNA提取使用合適的試劑盒提取總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。3cDNA合成利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。4qPCR反應(yīng)使用qPCR試劑盒，設(shè)置合適的反應(yīng)體系，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。5數(shù)據(jù)分析使用合適的軟件對(duì)qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出目的基因的表達(dá)量。結(jié)果討論差異表達(dá)基因分析分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中存在顯著差異表達(dá)的基因。這些基因可能與特定生物過(guò)程或疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。功能富集分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，可以揭示這些基因所參與的生物途徑和相關(guān)功能，提供更深入的生物學(xué)見解。通路分析通路分析可以幫助我們理解差異表達(dá)基因如何相互作用，并影響特定的生物途徑，從而揭示更完整的生物學(xué)機(jī)制。注意事項(xiàng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)時(shí)間，避免RNA降解。注意試劑的質(zhì)量和儲(chǔ)存條件。做好實(shí)驗(yàn)記錄，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)設(shè)備1RNA提取儀用于快速高效地從樣品中提取RNA。2定量PCR儀用于檢測(cè)RNA的濃度和完整性。3超聲波破碎儀用于將RNA片段化成合適的長(zhǎng)度。常用試劑RNA提取試劑Trizol,TRIzolLS,RNeasyMiniKit,RNAzolRT等RNA純化試劑DNaseI,RNase-FreeDNase,GlycoBlue等文庫(kù)構(gòu)建試劑NEBNextUltraIIRNALibraryPrepKitforIllumina,TruSeqStrandedmRNALibraryPrepKit等測(cè)序試劑IlluminaSequencingKits,NovaSeq6000ReagentKits等參考文獻(xiàn)RNASequencing:APowerfulToolforTranscriptomeProfilingAComprehensiveGuidetoRNALibraryPreparationf