DB11-T 2358-2024 淡水大型底棲無脊椎動物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

DB11北京市市場監(jiān)督管理局發(fā)布 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則淡水大型底棲無脊椎動物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了淡水大型底棲無脊椎動物環(huán)境DNA監(jiān)測的監(jiān)測原則及流程、試劑、儀器設(shè)備和材料、本文件適用于河流、湖泊、水庫等淡水水體中大型底棲無脊椎動物。主要包括刺胞動物門（Cnidaria）或稱腔腸動物門（Coelenterata）、扁形動物門一段標(biāo)準(zhǔn)的、短小的、易于PCR擴增的、物種間有足夠變異且物種內(nèi)相對保守的、的基因序列。本文件選用淡水大型底棲無脊椎動物常用的后生動物線粒體基因組上的DNA序列作利用高通量測序技術(shù)獲取環(huán)境樣品（如水、沉積物等）中的目標(biāo)基因序列，根據(jù)物種間特測序數(shù)據(jù)按照一定的序列相似度閾值進行聚類，獲得的用于表征物種的分子水平的分類不含待測物種或者所有物種DNA的樣品（如滅菌超純水與待測樣品同步實驗，用于判斷待測樣淡水大型底棲無脊椎動物環(huán)境DNA監(jiān)測應(yīng)客觀、科學(xué)地反監(jiān)測結(jié)果應(yīng)能在物種及相對豐度等方面全面客觀反映監(jiān)測水域淡水大型底棲無脊椎動物群落的整監(jiān)測點位布設(shè)監(jiān)測點位布設(shè)監(jiān)測頻次和時間監(jiān)測頻次和時間DNA提取DNA提取DNADNA質(zhì)量檢測和保存生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析）；）；）；）；河流、湖庫岸邊采樣：按照HJ91.2，），條件具備時，在同一點位也可補充采集沉積物樣品，沉積物樣品采樣和前處理方式見附錄C，沉積水樣宜現(xiàn)場過濾，過濾體積推薦1L，也可根據(jù)水體濁度調(diào)整過濾體積（1期可將水樣等體積分開過濾至多張濾膜，作為子樣品。冷藏運輸，當(dāng)天返回實驗室后-20℃~-80℃保存，應(yīng)盡快完成DNA的提取。24h內(nèi)完成過濾，濾膜-20℃~-80℃保存，應(yīng)盡快完成使用市售的DNA提取試劑盒或CTAB法提份保存在-20℃用于后續(xù)實驗，另一份在-合酶、模板DNA。各組分濃度宜根據(jù)目標(biāo)基因、引物和實驗情況在目標(biāo)長度位置出現(xiàn)條帶；若3個PCR重復(fù)樣品中出現(xiàn)2個PC將3個PCR重復(fù)產(chǎn)物混合，使用市售的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化目的片段，說明書。用DNA濃度分光光度計檢測純化后的PCR產(chǎn)物質(zhì)量和濃度。PCR產(chǎn)物在-20℃~-80℃溫度條件期序列數(shù)不宜低于30000條，可根據(jù)監(jiān)測首先根據(jù)擴增引物前添加的索引將序列分配到不同的樣品中。通過檢查索引序列和引物序列的匹例應(yīng)≥90%。再進行序列長度過濾，刪除序列長度過短的序列，按照序列長度測序預(yù)期長度的70%）將序列相似值高于或等于閾值（序列相似度閾值一般為0.97）的序列合并成法和物種鑒定閾值的設(shè)定應(yīng)綜合考慮選用的DNA條形碼片段、參考數(shù)注釋得到的物種信息應(yīng)與歷史監(jiān)測結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進行人工校驗，篩選保留淡水大型底棲建議保留3個現(xiàn)場平行樣品中出現(xiàn)在2個現(xiàn)場平行樣品以上的物種注釋信息，取平行樣品間共有的根據(jù)監(jiān)測目標(biāo)調(diào)整應(yīng)保留的物種相對序列豐度，物種相對序列豐度宜取平行樣品間物種相對序列同一批實驗生物信息學(xué)分析流程及關(guān)鍵參數(shù)應(yīng)詳細(xì)記錄并保持一致。某個監(jiān)測點位的淡水大型底棲無脊椎動物監(jiān)測結(jié)果記錄表由OTU編號、代表性序列、序列條數(shù)、相對序列豐度、物種分現(xiàn)場，經(jīng)采水器（見6.1）盛裝的陰性對照移入采樣瓶，按7.4相同的步使用陽性對照樣品控制假陰性率。重復(fù)測定6次，計算標(biāo)準(zhǔn)樣品中含有但測量結(jié)果中未檢出的物種使用陽性對照樣品控制假陽性率。重復(fù)測定6次，計算測量結(jié)果中檢出但標(biāo)準(zhǔn)樣品中不存在的物種椎動物~313~313~421~155采樣點位及周邊生境描述（照片應(yīng)作為附件保存至少包含上下游和采樣點位）:水溫(℃):生物殘體，收集至無菌離心管中（一般為50mL），野外干冰或-20℃保存，實驗室-20℃~-80