項(xiàng)目一血液標(biāo)本采集和血涂片制備課件

臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)

血液一般檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)臨床生化檢驗(yàn)臨床血液學(xué)檢驗(yàn)臨床微生物檢驗(yàn)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)核心課程臨床寄生蟲檢驗(yàn)臨床檢驗(yàn)者準(zhǔn)入、獲取專業(yè)技術(shù)資格考試的必考課程之一，該考試設(shè)置“基礎(chǔ)知識”、“相關(guān)專業(yè)知識”、“專業(yè)知識”和“專業(yè)實(shí)踐能力”四個(gè)科目，其中臨檢所占題量和分值約20%，位居各檢驗(yàn)之首。自動化儀器檢查:電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、自動化檢驗(yàn)儀器取代手工法。速度快、精度高、操作易、參數(shù)多、易質(zhì)控、信息大等。感官檢查:直接觀察標(biāo)本：顏色、透明度、性狀，有無凝塊或寄生蟲臨床檢驗(yàn)的一般方法理學(xué)檢查:液體的相對密度、血液比粘度、紅細(xì)胞沉降率、紅細(xì)胞比積等病理變化化學(xué)檢查:定性或定量檢測標(biāo)本化學(xué)成分的病理變化顯微鏡檢查:觀察有形成分的數(shù)量和形態(tài)手工法自動化儀器法緒論現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)的特點(diǎn):檢驗(yàn)操作的自動化、檢驗(yàn)技術(shù)的現(xiàn)代化、檢驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化、檢驗(yàn)試劑的商品化、計(jì)量單位的國際化、質(zhì)量管理的全程化臨床檢驗(yàn)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1、為疾病診斷和鑒別診斷提供客觀的實(shí)驗(yàn)室檢查依據(jù)

發(fā)熱、出血、貧血傾向的患者：血涂片檢查到大量原幼紅細(xì)胞可診斷為急性白血病。白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）數(shù)量增多、血沉增快：支持急性心肌梗死的診斷，可與心絞痛相鑒別。顯微鏡發(fā)現(xiàn)病原體是確診感染性疾病的依據(jù)。2、為疾病療效監(jiān)測和預(yù)后判斷提供動態(tài)變化數(shù)據(jù)尿蛋白檢測：檢測腎臟疾病患者的病情變化；網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)：對貧血患者、進(jìn)行發(fā)射治療或化學(xué)治療的患者骨髓造血功能判斷具有實(shí)際可靠的指導(dǎo)作用。3、為疾病預(yù)防提供檢測依據(jù)

預(yù)防為主是基本方針，從標(biāo)本中檢測寄生蟲，可對感染人群進(jìn)行必要的治療和隔離，防止疾病的傳播和傳染。緒論學(xué)習(xí)的基本要求1.熟練掌握臨檢的基本理論。（生理學(xué)、病理學(xué)基礎(chǔ)，檢驗(yàn)基本理論）2.掌握檢驗(yàn)的基本實(shí)驗(yàn)技能。（標(biāo)本的采集、規(guī)范操作、質(zhì)量控制等）3.熟悉檢驗(yàn)方法學(xué)的評價(jià)。（評估和選擇靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢驗(yàn)方法，正確分析比較手工檢驗(yàn)方法和儀器檢驗(yàn)方法的優(yōu)缺點(diǎn)）4.熟悉檢驗(yàn)項(xiàng)目的參考值和臨床意義。(記憶常用檢驗(yàn)項(xiàng)目的參考值，以便結(jié)合臨床，對檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行有效的分析）勤學(xué)苦練重點(diǎn)：1.血標(biāo)本采集方法和血涂片制備技術(shù)2.抗凝劑的應(yīng)用難點(diǎn)：血細(xì)胞染色原理項(xiàng)目一

血液標(biāo)本采集和血涂片制備一.掌握血液標(biāo)本的采集方法及注意事項(xiàng)。

二.熟悉常用的血液抗凝劑種類及其應(yīng)用。三、掌握血涂片的制備與細(xì)胞染色原理。概述血液理化性質(zhì)1.血量：成人4～5L，占體重6%～8%2.顏色：動脈鮮紅，氧合血紅蛋白多靜脈暗紅，還原血紅蛋白多3.PH：7.35～7.45，動脈稍高，靜脈稍低4.比密和滲透濃度：血液比密取決于血細(xì)胞比容和hb量：男：1.055～1.063;女：1.050～1.060;血漿比密與其血漿蛋白質(zhì)含量有關(guān)：1.025～1.030；血細(xì)胞比密：1.090

血漿滲量（滲透壓）=290～310mOsm/kg.H2O，5.血液特性：懸浮穩(wěn)定性；粘滯性；凝固性概述血液生理功能1.運(yùn)輸功能（基本功能）2.協(xié)調(diào)功能（輸送激素、酶類到各個(gè)臟器）3.維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性（酸堿平衡、電解質(zhì)代謝、體溫恒定）4.防御功能（白細(xì)胞、抗體、補(bǔ)體等）任務(wù)一血液標(biāo)本的采集及抗凝一、采血部位毛細(xì)血管采血法成人：左手無名指或中指指端內(nèi)側(cè)(WHO)嬰幼兒：大拇趾血液標(biāo)本的采集耳垂：不宜使用手指適用于需血量少(<0.1ml)的檢查?；?/p>

內(nèi)外側(cè)緣足跟嚴(yán)重?zé)齻颊撸浩つw完整處？毛細(xì)血管采血法血液標(biāo)本的采集二、器材與試劑：無菌一次性采血針、一次性微量吸管、消毒干棉球、無菌干棉球、小試管、75%乙醇、生理鹽水等。四、注意事項(xiàng)1.采血部位不能有凍瘡、紫紺、水腫和炎癥等。2.消毒后，待酒精干后采血。3.取血時(shí)切忌用力擠壓。4.進(jìn)行多項(xiàng)檢查時(shí)，采集標(biāo)本的順序依次為:PLT計(jì)數(shù)、RBC計(jì)數(shù)、Hb測定、WBC計(jì)數(shù)及分類、血型鑒定等。毛細(xì)血管采血法血液標(biāo)本的采集毛細(xì)血管采血法血液標(biāo)本的采集五、方法學(xué)評價(jià)1.操作方便；2.每人的皮膚厚度不同，無法控制采血刺入的深度；3.常需擠壓誘導(dǎo)，導(dǎo)致組織液混入，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；4.標(biāo)本不能重復(fù)應(yīng)用；5.取血量少(<0.1ml)。1.毛細(xì)血管采血時(shí)應(yīng)注意些什么？2.選擇題：1）新生兒做血細(xì)胞計(jì)數(shù)，多用下列哪個(gè)部位采血A.手背B.耳垂C.足跟D.左手無名指2）關(guān)于毛細(xì)血管采血法，下列正確的是

A.耳垂血的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血細(xì)胞比容結(jié)果均比靜脈血低10%左右B.手指采血時(shí)流出的第一滴血即可用于檢查C.嬰兒宜用耳垂或手指采血D.成人推薦用手指采血，因其檢查結(jié)果比較恒定復(fù)習(xí)思考題一、采血部位常用肘部靜脈,也可手背或外踝靜脈等。二、器材與試劑注射器、壓脈帶、墊枕、75%酒精、碘酒、無菌棉簽(球)等。靜脈采血法血液標(biāo)本的采集用于需血量較多或全自動血液分析儀測定。四、注意事項(xiàng)1.防止標(biāo)本溶血。2.壓脈帶壓迫時(shí)間不能過長。3.切忌將注射器往靜脈內(nèi)推。三、采血步驟靜脈采血法血液標(biāo)本的采集毛細(xì)血管采血靜脈采血缺點(diǎn)限制了重復(fù)實(shí)驗(yàn)和追加實(shí)驗(yàn)，標(biāo)本量少，局部炎癥可得假結(jié)果，可混入組織液。不同抗凝劑的使用，改變血液性質(zhì)，影響有形成分的形態(tài)優(yōu)點(diǎn)價(jià)廉、快速、操作簡便，標(biāo)本可直接測定標(biāo)本代表性大，無組織液影響，適用于臨床研究，可重復(fù)實(shí)驗(yàn)和追加其他實(shí)驗(yàn)。毛細(xì)血管采血與靜脈采血優(yōu)缺點(diǎn)比較血液標(biāo)本的采集一次性使用靜脈采血針

瓶塞穿刺針套（防止血液泄漏）抗凝：用物理或化學(xué)的方法，去除或抑制某些凝血因子，阻止血液凝固。概念血液標(biāo)本的抗凝物理方法抗凝：脫纖維蛋白將血液注入到有玻璃珠的器皿中，轉(zhuǎn)動，纖維蛋白纏繞凝固在玻璃球上，從而防止血液凝固成塊。適用于免疫學(xué)檢驗(yàn)、紅斑性狼瘡細(xì)胞和細(xì)菌培養(yǎng)血培養(yǎng)基的制備。一.枸櫞酸鈉（檸檬酸鈉）適用項(xiàng)目：凝血象檢查、紅細(xì)胞沉降率、血液保養(yǎng)液常用的抗凝劑血液標(biāo)本的抗凝抗凝原理：與血中鈣離子結(jié)合形成螯合物二.草酸鈉三.雙草酸鹽抗凝劑抗凝原理：與鈣離子形成草酸鈣沉淀。適用項(xiàng)目：血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞(計(jì)數(shù)）草酸鉀(鈉)使RBC皺縮，草酸銨使RBC脹大。常用的抗凝劑血液標(biāo)本的抗凝不適于血小板計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)五.肝素適用項(xiàng)目：紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、血細(xì)胞比容測定血液流變學(xué)檢查、多種生化分析抗凝原理：加強(qiáng)抗凝血酶Ⅲ滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成、抑制血小板聚集。不適于白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)常用的抗凝劑血液標(biāo)本的抗凝1.毛細(xì)血管采血時(shí)應(yīng)注意些什么？2.常用的血液抗凝劑有哪些？3.選擇題：1）新生兒做血細(xì)胞計(jì)數(shù)，多用下列哪個(gè)部位采血A.手背B.耳垂C.足跟D.左手無名指2）關(guān)于毛細(xì)血管采血法，下列正確的是

A.耳垂血的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血細(xì)胞比容結(jié)果均比靜脈血低10%左右B.手指采血時(shí)流出的第一滴血即可用于檢查C.嬰兒宜用耳垂或手指采血

復(fù)習(xí)思考題

3）不與Ca2+作用,但能阻止血液凝固的抗凝劑是A.草酸鹽B.EDTA-K2

C.肝素D.枸櫞酸鈉4）下列幾種抗凝劑，哪種最適宜用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)

A.

乙二胺四乙酸二鉀(EDTA－K2)B.枸櫞酸鈉C.草酸鈉D.草酸鉀

5）肝素作為抗凝劑,下列敘述錯(cuò)誤的是A.具有較強(qiáng)的抗凝能力B.不影響血細(xì)胞體積C.過量使用可引起白細(xì)胞聚集

D.適用于做白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價(jià)值，近年來血細(xì)胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。血涂片的用途：血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、網(wǎng)織紅、寄生蟲檢驗(yàn)。

任務(wù)二血涂片制備和細(xì)胞染色一、手工推片法將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動。圖1-3血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀）

血涂片制備推片載玻片血液將推片勻速向前，勿停頓。涂片的厚薄取決于速度和角度：快、大(厚)。慢、?。ū。┮粡垵M意的血涂片應(yīng)厚薄均勻頭體尾鮮明涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫上姓名和編號李四B123血涂片的觀察低倍鏡觀察1.染色情況(滿意、偏酸、偏堿）2.細(xì)胞分布情況油鏡下分類計(jì)數(shù)：體尾交界處。油鏡分類時(shí)應(yīng)按一定走向，不要重復(fù)計(jì)數(shù)。李四123適宜不適宜不適宜

二、血液涂片染色

對細(xì)胞核著色較好對細(xì)胞質(zhì)著色較好瑞氏染料的組成：由酸性染料伊紅和堿性染料亞甲藍(lán)組成的復(fù)合染料溶于甲醇制備而成。堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，細(xì)胞核的染料。如亞甲藍(lán)、天青。能結(jié)合酸性物質(zhì)并染色，如淋巴細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞染成藍(lán)色酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。如伊紅。能結(jié)合細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分等染成紅色。（一）瑞氏染色法固定著色合并進(jìn)行，簡便，染色時(shí)間短，WBC特異性顆粒著色較好，細(xì)胞核著色較差。細(xì)胞染色原理：

一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué)現(xiàn)象為依物理作用：毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學(xué)作用：a.染料的化學(xué)成分：助色基團(tuán)的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。b.蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時(shí)還有其它活性基團(tuán)。在游離狀態(tài)時(shí)，-NH2獲得一個(gè)H+變成帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個(gè)H+變成帶負(fù)電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。c.周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pH＜pI，則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之，pH＞pI，則結(jié)合堿性染料。細(xì)胞染色法的類型

普通染色法：經(jīng)物理和/或化學(xué)作用的吸附、結(jié)合熒光染色法：熒光染料，熒光顯微鏡細(xì)胞活體染色法：活體染料如燦爛甲酚藍(lán)等細(xì)胞化學(xué)染色法：用化學(xué)反應(yīng)顯示細(xì)胞內(nèi)某種成分細(xì)胞免疫化學(xué)染色法（應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)）

瑞氏染色法

[瑞氏染料]由酸性染料伊紅（eosin,E-）和堿性染料亞甲藍(lán)(methyleneblue,M+)組成的有機(jī)復(fù)合染料。亞甲藍(lán)為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)。通常為氯鹽，即氯化美藍(lán)。美藍(lán)容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料。市售美藍(lán)中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。將伊紅和美藍(lán)溶解在甲醇中，即瑞氏染料。[染色原理]

細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，

例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性蛋白質(zhì)，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。

M+Cl+Na+E→ME+NaCl美藍(lán)伊紅伊紅化美藍(lán)（瑞氏染料）

圖1-4瑞氏染色原理示意圖

嗜堿性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞嗜多色性紅細(xì)胞中性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞[試劑]

Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)，并使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對染料的吸附作用，增強(qiáng)染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g,蒸餾水加到1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。

[染色方法]1.用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。2.加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。3.滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。4.用清水沖洗，待干后鏡檢。

【質(zhì)量控制】血膜要干透后才能染色，否則染色時(shí)易脫落.染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時(shí)間長些效果好。染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時(shí)間也不能長。染色過淡，可復(fù)染。染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色.中性桿狀核粒細(xì)胞

嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞姬姆薩染色法

[原理]

吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。但本法對細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復(fù)合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液，按瑞特染色法染10min?；蛳扔萌鹛厝旧ㄈ旧?，再用稀釋吉姆薩復(fù)染。吉姆薩染料1.0g甘油66.0ml甲醇（AR）66.0ml[染色方法]