T-CVMA 180-2024 貓免疫缺陷病毒核酸檢測(cè)方法

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I1貓免疫缺陷病毒核酸檢測(cè)方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范4縮略語(yǔ)FIV：貓免疫缺陷病毒（Felineimmunodeficiencyvirus）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReversetranscriptionpolymeraseTBE緩沖液：三羥甲基氨基甲烷_硼酸_Taq酶：耐熱DNA聚合酶（ThermusAquaticusPolyme5.4生物安全柜。25.5微波爐。5.11凝膠成像儀。脈采集200~300μL血液。樣品編號(hào)并填寫相應(yīng)檢測(cè)的樣本置于-70℃或以下保存，如無-70取7.1.1采集的含EDTA的抗凝血2003取7.4.1步驟反轉(zhuǎn)錄的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及參數(shù)見附均勻，加入核酸凝膠樣品孔，核酸凝膠配置電泳：5V/cm恒壓下電泳30min，將凝膠置于凝膠陰性對(duì)照：PCR產(chǎn)物無和在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，被檢樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在32），4到20μL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品編合的檢測(cè)通道讀取熒光信號(hào)值，淬滅基團(tuán)選擇none。推薦的熒5試劑配方稱量Tris24.2g，Na2EDTA·2H2O3.72g于1L燒杯中。向燒杯中加入約600mL無菌蒸餾水，充分?jǐn)嚪Q量Tris54.0g，EDTA2.9mg于1L燒杯中。向燒杯加入硼酸27.5g，充分?jǐn)嚢?；加無菌蒸餾水定容至1L后，室溫保存。使用時(shí)稀釋5倍即1×TBE。A.3核酸凝膠制備6引物序列5’-3’體積(μL）\\2\7\117FAM-CATGGCCACATTAATAATGGCCGCA-T工作液終濃度(μmol/L）加樣體積(μL）\酶\\2\\118D.1FIVPCR陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒參考序列（GenBankAccessionNo.NC_5’-CTACTGCTGCTGCAGCTGAAAATATGTATTCTCAAATGGGATTAGACAGAAAGAAGCAGGTGGAAAAGAGGAAGGCCCTCCACAGGCATATCCTATTCAAACAGTAAAGTACCACAATATGTAGCACTTGACCCAAAAATGGTGTCCATTTTTATGGAAAAGGCAAGAGGACTAGGAGGTGAGGAAGTTCAACTATGGTTTACTGCCTTCTCTGCAAATTTAACACCTACATGGCCACATTAATAATGGCCGCACCAGGGTGCGCTGCAGATAAAGAAATATTGGATGAAAGCTTAAAGCAAC-3'D.2FIV熒光PCR陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒參考序列（GenBankAccessionNo.MK558085’-GCCTTCTCTGCAAATTTAACACCTACTGACATGGCCACATTAATAATGGCCGCCGCTGCAGACAAAGAAATATTAGATGAAAGCTTAAAGCAATTGACAGCAGAATATGATC濃度（ng/μL）×10-9]/（DNA堿基數(shù)×660）），即為FIVPCR和熒光