細(xì)胞電生理學(xué)與膜片鉗技術(shù)

細(xì)胞電生理學(xué)與膜片鉗技術(shù)1991Nobel基金會得頒獎評語:膜片鉗技術(shù)點(diǎn)燃了細(xì)胞和分子水平得生理學(xué)研究得革命之火,為細(xì)胞生理學(xué)得研究帶來了一場革命性得變化,她和基因克隆技術(shù)并駕齊驅(qū),給生命科學(xué)研究帶來了巨大得前進(jìn)動力。2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用3、離子通道藥理學(xué)1、細(xì)胞電生理學(xué)OUTLINE

細(xì)胞電生理學(xué)Electrophysiology細(xì)胞生理學(xué):揭示細(xì)胞得生理過程,用電生理方法記錄生物電活動測量離子、離子通道細(xì)胞興奮生物電信號細(xì)胞生理學(xué)膜的“流動鑲嵌模型”細(xì)胞膜和離子學(xué)說建立(Hodgkin,etal、1946年)磷脂雙層得屏蔽作用Na-K泵

[K+]o<<[K+]i [Na+]o>>[Na+]i離子的跨膜分布離子通道

(ionchannels)

離子通道就是細(xì)胞膜上得一種特殊整合蛋白,對某些離子(K+、Na+、Ca2+等)能選擇通透,其功能就是細(xì)胞生物電活動得基礎(chǔ)。

特性:通透性(permeation)選擇性(selectivity)門控性(gating)

研究技術(shù):膜片鉗技術(shù)和分子克隆技術(shù)配體門控通道陽離子通道:乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體陰離子通道:甘氨酸和γ－氨基丁酸受體

通道蛋白——離子通道乙酰膽堿受體

12大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流電壓門控通道:鉀、鈉、鈣離子通道

通道蛋白——離子通道電壓門控鉀離子通道

環(huán)核苷酸門控通道

氣味分子與G蛋白偶聯(lián)型受體結(jié)合,激活腺苷酸環(huán)化酶,產(chǎn)生cAMP,開啟cAMP門控陽離子通道(cAMP-gatedcationchannel),引起鈉離子內(nèi)流,膜去極化,產(chǎn)生神經(jīng)沖動,最終形成嗅覺或味覺。

機(jī)械門控通道一類就是牽拉活化或失活得離子通道,另一類就是剪切力敏感得離子通道,前者幾乎存在于所有得細(xì)胞膜,研究較多得有血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及內(nèi)耳中得毛細(xì)胞等,后者僅發(fā)現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞

水通道2003年諾貝爾化學(xué)獎:PeteAgre、RoderickMacKinnon

通道蛋白——離子通道2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用3、離子通道藥理學(xué)1、細(xì)胞電生理學(xué)OUTLINE電生理學(xué)研究簡史:

二千年前,觀察到電鰩魚放電現(xiàn)象。1825年,Nobili發(fā)明了電流計(jì),用其證實(shí)了肌肉有電流存在。1912年,Bridge確定了AP得“全或無”現(xiàn)象。同年,Oxford提出了突觸得概念及反射弧得生理學(xué)研究,獲1932年Nobel獎。1937年,Hodgkin和Huxley在槍烏賊巨大神經(jīng)軸突細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)電記錄,獲1963年Nobel獎。1946年,凌寧和Gerard創(chuàng)造拉制出尖端直徑小于1μm得玻璃微電極,并記錄了骨骼肌得電活動。玻璃微電極得應(yīng)用使得電生理研究進(jìn)行了革命性得變化。Voltageclamp(電壓鉗技術(shù))由Cole和Marmont發(fā)明,并很快由Hodgkin和Huxley完善,真正開始了定量研究,建立了H－H模型(膜離子學(xué)說),就是近代興奮學(xué)說得基石。1948年,Katz利用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)記錄到了終板電位;1969年,又證實(shí)N－M接觸后得Ach以“量子式”釋放,獲1976年Nobel獎。1976年,德國得Neher和Sakmann發(fā)明PatchClamp(膜片鉗)。并在蛙橫紋肌終板部位記錄到乙酰膽堿引起得通道電流。1980年,Sigworth、Hamill、Neher等在記錄電極內(nèi)施加負(fù)壓吸引,得到了10~100GΩ得高阻封接(gigaseal),大大降低記錄噪聲,實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜電位又記錄單通道電流。獲1991年Nobel獎。

HistoryofIonChannelStudy1955年,Hodgkin和Keens應(yīng)用電壓鉗(Voltageclamp)在研究神經(jīng)軸突膜對鉀離子通透性時(shí)發(fā)現(xiàn),放射性鉀跨軸突膜得運(yùn)動很像就是通過許多狹窄空洞得運(yùn)動,并提出了“通道”得概念。1963年,描述電壓門控動力學(xué)得Hodgkin-Huxley模型(簡稱H-H模型),榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎。1976年,Neher和Sakmann建立膜片鉗(Patchclamp)技術(shù)。1983年10月,《Single-ChannelRecording》一書問世,奠定了膜片鉗技術(shù)得里程碑。1991年,Neher和Sakmann得膜片鉗技術(shù)榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎。1963年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎

發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞膜得周邊和中央部分與興奮和抑制有關(guān)得離子機(jī)制艾克爾斯SirJohnCarewEccles澳大利亞澳大利亞國家大學(xué)1903年--1997年霍奇金AlanLloydHodgkin英國英國劍橋大學(xué)1914年--1998年赫克斯利AndrewFieldingHuxley英國英國倫敦大學(xué)1917年--TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine(1991)

ErwinNeherBertSakmann

1/2oftheprize

1/2oftheprizeFederalRepublicofGermanyFederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürBiophysikalischeChemie,Goettingen,FederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürmedizinischeForschung,Heidelberg,FederalRepublicofGermanyb、1944b、1942膜片鉗技術(shù)膜片鉗技術(shù):從一小片(約幾平方微米)膜獲取電子學(xué)方面信息得技術(shù),即保持跨膜電壓恒定——電壓鉗位,從而測量通過膜離子電流大小得技術(shù)。通過研究離子通道得離子流,從而了解離子運(yùn)輸、信號傳遞等信息。基本原理利用負(fù)反饋電子線路,將微電極尖端所吸附得一個(gè)至幾個(gè)平方微米得細(xì)胞膜得電位固定在一定水平上,對通過通道得微小離子電流作動態(tài)或靜態(tài)觀察,從而研究其功能。膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)膜電位固定得關(guān)鍵就是在玻璃微電極尖端邊緣與細(xì)胞膜之間形成高阻(10ＧΩ)密封,使電極尖端開口處相接得細(xì)胞膜片與周圍環(huán)境在電學(xué)上隔離,并通過外加命令電壓鉗制膜電位。由于玻璃微電極尖端管徑很小,其下膜面積僅約1μｍ2,離子通道數(shù)量很少,一般只有一個(gè)或幾個(gè)通道,經(jīng)這一個(gè)或幾個(gè)通道流出得離子數(shù)量相對于整個(gè)細(xì)胞來講很少,可以忽略,也就就是說電極下得離子電流對整個(gè)細(xì)胞得靜息電位得影響可以忽略,那么,只要保持電極內(nèi)電位不變,則電極下得一小片細(xì)胞膜兩側(cè)得電位差就不變,從而實(shí)現(xiàn)電位固定。膜片鉗技術(shù)得優(yōu)點(diǎn)膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)了小片膜得孤立和高阻封接得形成,由于高阻封接使背景噪聲水平大大降低,相對地增寬了記錄頻帶范圍,提高了分辨率。另外,她還具有良好得機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)絕緣性。而小片膜得孤立使對單個(gè)離子通道進(jìn)行研究成為可能。膜片鉗記錄得各種模式根據(jù)膜片與電極之間得關(guān)系,可將膜片記錄主要分為４種模式。首先建立得單通道記錄法(Singlechannelrecording)就是細(xì)胞吸附式,其后又建立了膜內(nèi)面向外和膜外面向外得模式;還有一種就是全細(xì)胞記錄法(Ｗholecellrecording)得全細(xì)胞式?，F(xiàn)在又發(fā)展了開放得細(xì)胞吸附式膜內(nèi)面向外和穿孔囊泡膜外面向外得模式,以及穿孔膜片得模式。Patchclamp-wholecell細(xì)胞吸附膜片

(cell-attachedpatchmode)一種將微電極吸附在細(xì)胞膜上對單離子通道電流進(jìn)行記錄得模式。優(yōu)點(diǎn)就是不破壞細(xì)胞得完整性,內(nèi)環(huán)境保持正常。缺點(diǎn)就是不能人為直接地控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件,不能確切判明細(xì)胞內(nèi)電位。即使在浴液中加入刺激物質(zhì),也不能到達(dá)與電極內(nèi)液接觸得膜片得細(xì)胞外面。但就是,如果膜片離子通道對浴液中得刺激物有反應(yīng),則可以說明這種刺激物就是經(jīng)過某些細(xì)胞內(nèi)第二信使得介導(dǎo)間接地起作用。內(nèi)面向外膜片

(inside-outpatch)在細(xì)胞吸附模式高阻封接形成后,將微管電極提起,使吸附得膜片從胞體上被切割下來,就得到“內(nèi)面向外”膜片。此種模式,可直接且自由地經(jīng)浴液介導(dǎo)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液得條件,并可在和細(xì)胞活動無關(guān)得形式下觀察到單一離子通道得活動。但就是,由于胞質(zhì)滲漏,可能丟失某種通道調(diào)控因子,離子通道活動出現(xiàn)run-down(或run-up)現(xiàn)象。全細(xì)胞記錄式

(Ｗhole-cellrecording)在細(xì)胞吸附模式下繼續(xù)以負(fù)壓抽吸使電極管內(nèi)細(xì)胞膜破裂,電極胞內(nèi)液與胞內(nèi)液直接相通,而與浴槽液絕緣,這種形式記錄膜片以外部位得全細(xì)胞膜得離子電流。她既可記錄膜電位又可記錄膜電流。其中膜電位可在電流鉗情況下記錄,或?qū)⒉９苓B到標(biāo)準(zhǔn)高阻微電極放大器上記錄。外面向外膜片

(outside-outpatch)在全細(xì)胞模式上將微管電極向上提起,可得到切割分離得膜片,斷端游離部分自行融合成脂質(zhì)雙層,此時(shí)高阻封接仍然存在。而膜外側(cè)面接觸浴槽液。用這種模式,可自由改變細(xì)胞外液得情況下,記錄單一離子通道得電流活動。開放細(xì)胞吸附膜內(nèi)面向外模式(opencell-attachedinside-outmode)將細(xì)胞吸附式得膜片以外得某部位得胞膜進(jìn)行機(jī)械地破壞,經(jīng)破壞孔調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液,并在細(xì)胞吸附狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)面向外得單一離子通道記錄。這種方法得細(xì)胞體積越大,破壞部位離被吸附膜片越遠(yuǎn)或破壞孔越小,都可導(dǎo)致細(xì)胞因子外流變慢。穿孔膜片模式

(perforatedpatchmode)為克服全細(xì)胞模式得胞質(zhì)滲漏問題,Horn和Marty將與離子親和得制霉菌素(或二性霉素Ｂ)經(jīng)膜片微電極灌流到含類甾醇得細(xì)胞膜片上,形成只允許一價(jià)離子通過得孔,用此法在膜片上做很多導(dǎo)電性孔道借此對全細(xì)胞膜電流進(jìn)行記錄。因?yàn)榇四Ｊ降冒|(zhì)滲漏極為緩慢,局部串聯(lián)阻抗較全細(xì)胞模式高,所以鉗制速度很慢,故也稱為緩慢全細(xì)胞模式。穿孔囊泡膜外面向外模式(perforatedvesicleoutside-outmode)穿孔膜片模式將電極向上提起,便在微電極尖端處形成一個(gè)膜囊泡(膜內(nèi)面向外膜片斷端融合封閉而成)。如果條件較好,此膜囊泡內(nèi)不僅有細(xì)胞質(zhì)因子還可有線粒體等細(xì)胞器存在。所以在有比較接近正常得細(xì)胞內(nèi)信號傳遞條件和代謝條件得基礎(chǔ)上,可能記錄到膜外面向外模式得單一離子通道。過去認(rèn)為,膜片鉗只能在培養(yǎng)細(xì)胞或酶解得細(xì)胞上進(jìn)行,這樣得到得細(xì)胞膜表面比較光滑,才能夠形成高阻封接,但缺點(diǎn)就是組織得正常三維結(jié)構(gòu)被破壞,并且對神經(jīng)中樞內(nèi)突觸特有得傳遞機(jī)能得研究無法展開。