基因工程的基本操作程序第2課時課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

3-2基因工程的基本操作程序基因工程選擇性必修3巴甫洛夫1849.9.26—1936.2.02基因表達載體的構(gòu)建二、基因表達載體的構(gòu)建

游離的“殺蟲(基因)”直接進入棉花細(xì)胞，一般會被分解，就算能表達，也不能隨細(xì)胞分裂進行增殖，導(dǎo)致子代無該基因，若游離DNA能整合到染色體DNA上，或者能在細(xì)胞內(nèi)獨立穩(wěn)定存在，能自我復(fù)制，則該游離DNA會隨著細(xì)胞分裂傳給子代

獲取了足夠量的目的基因（Bt基因）后，下一步就是要讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發(fā)揮作用，這就需要構(gòu)建基因表達載體。這一步是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的核心工作。蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt基因直接導(dǎo)入抗蟲棉培育棉花細(xì)胞核DNA×基因表達載體二、基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體標(biāo)記基因復(fù)制原點終止子啟動子插入目的基因位于基因的上游；RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNADNA復(fù)制的起始位點人們所需要的基因位于基因的下游；終止轉(zhuǎn)錄便于重組DNA分子的篩選（將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來）組成二、基因表達載體的構(gòu)建組成啟動子位于基因上游，是RNA聚合酶識別和結(jié)合位點，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄。組成型啟動子（一直干活）組織特異性啟動子（特定組織中干活）誘導(dǎo)性啟動子（特定誘導(dǎo)物下干活）終止子位于基因下游，提供轉(zhuǎn)錄終止的信號。基因表達載體標(biāo)記基因復(fù)制原點終止子啟動子插入目的基因二、基因表達載體的構(gòu)建拓展：非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核生物基因啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)真核生物基因啟動子終止子編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子真、原核生物基因的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄和加工過程轉(zhuǎn)

錄前體mRNA加

工成熟mRNA轉(zhuǎn)

錄mRNA注意：啟動子和終止子都是DNA序列，而起始密碼子和終止密碼子則位于mRNA

上，分別是翻譯的起點和終點。二、基因表達載體的構(gòu)建構(gòu)建過程目的基因限制酶切割位點構(gòu)建程序：先用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶（同尾酶）切割載體和含有目的基因的片段，再用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體上，形成重組DNA分子標(biāo)記基因啟動子限制酶切割位點終止子復(fù)制原點限制酶限制酶DNA連接酶二、基因表達載體的構(gòu)建思考討論載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’11.使用一種DNA限制酶進行切割，共有幾種連接情況?二、基因表達載體的構(gòu)建思考討論2.構(gòu)建基因表達載體時目的基因插入的位置應(yīng)該在哪里？為什么？啟動子下游和終止子上游。因為只有插入在啟動子和終止子之間，目的基因才可以正常表達基因表達載體標(biāo)記基因復(fù)制原點終止子啟動子插入目的基因如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(1)不破壞目的基因原則：(2)保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：二、基因表達載體的構(gòu)建思考討論3.限制酶的選擇原則二、基因表達載體的構(gòu)建思考討論3.限制酶的選擇原則(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：與只使用PstⅠ相比較，使用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。對點訓(xùn)練A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質(zhì)粒，可得到2條DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割質(zhì)粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會破壞目的基因C.構(gòu)建重組DNA時，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時切割質(zhì)粒和外源DNAD.導(dǎo)入了重組DNA的細(xì)菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長1.(2023·江蘇蘇州高二期末)某科研小組利用質(zhì)粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構(gòu)建重組DNA。下列分析不正確的是（）03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法，因為受體細(xì)胞的不同而有所區(qū)別。

轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。

導(dǎo)入方法：實質(zhì)：將目的基因整合到受體細(xì)胞基因組中?；ǚ酃芡ǖ婪ǎㄎ覈茖W(xué)家獨創(chuàng)）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞顯微注射法Ca2+處理法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.花粉管通道法

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后滴加純化的表達載體，使目的基因借助____________進入受體細(xì)胞。我國的________________就是用此種方法獲得的。花粉管通道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉含目的基因的重組Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法目的基因構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)新性狀的植物轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞染色體DNA植物葉片切下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，或?qū)⒒ㄐ蚺囵B(yǎng)在農(nóng)桿菌溶液中，獲得種子，然后篩選、鑒定組培三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

把目的基因插入到農(nóng)桿菌的__________的________上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞。侵染過程中，目的基因隨著__________轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并插入到植物細(xì)胞的____________上。轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞還需要通過_________________技術(shù)才能發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植株。Ti質(zhì)粒T-DNAT-DNA染色體DNA植物組織培養(yǎng)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3.顯微注射法目的基因的表達載體提純?nèi)÷?受精卵)顯微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動物①個體大，易操作。②受精卵全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。原因顯微注射法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.導(dǎo)入微生物細(xì)胞操作方法：Ca2＋處理過程：Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子42℃,1min冰上3min原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點：繁殖周期短、體積小易于培養(yǎng)操作、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等大腸桿菌細(xì)胞Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.導(dǎo)入微生物細(xì)胞

早期的基因工程操作都用____________作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛。轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞最常用的方法是：首先用______處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為__________細(xì)胞。第二步是將重組表達載體DNA分子溶于______液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。原核生物Ca2+感受態(tài)緩沖原核生物繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等思考：為什么早期基因工程都用原核細(xì)胞作為受體細(xì)胞？Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子42℃,1min冰上3min04目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（1）檢測目的基因是否導(dǎo)入——

通過PCR等技術(shù)檢測提取DNAPCR操作是否擴增出目的基因M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；電泳操作害蟲死亡抗蟲棉PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA——

通過PCR等技術(shù)檢測M3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄提取mRNAPCR操作是否擴增出目的基因?qū)U增產(chǎn)物進行檢測害蟲死亡逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA抗蟲棉四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（3）檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交四、目的基因的檢測與鑒定2.個體生物學(xué)水平的檢測

例如，一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性，需要做____________________實驗，以確定是否具有抗性以及____________。又如，有的基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進行活性比較，以確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的__________是否與天然產(chǎn)品相同?？瓜x或抗病的接種抗性的程度功能活性四、目的基因的檢測與鑒定2.個體生物學(xué)水平的檢測轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正常常見轉(zhuǎn)基因生物在個體水平上鑒定、檢測的方法（列舉如下表）四、目的基因的檢測與鑒定【拓展】利用基因探針來檢測目的基因是否導(dǎo)入或者轉(zhuǎn)錄基因探針：是一小段單鏈的DNA或RNA，帶有放射性同位素標(biāo)記，并能與目的基因的的一條鏈發(fā)生堿基互補配對。DNA1DNA2四、目的基因的檢測與鑒定【拓展】利用基因探針來檢測目的基因是否導(dǎo)入或者轉(zhuǎn)錄基因探針：一段帶有檢測標(biāo)記（熒光或同位素標(biāo)記）且順序已知的與目的基因能互補的核酸序列（DNA

或

RNA）。檢測方法：將待測DNA或RNA與基因探針混合，如果發(fā)生了核酸雜交，則說明有目的基因。DNA分子雜交四、目的基因的檢測與鑒定【拓展】利用基因探針來檢測目的基因是否導(dǎo)入或者轉(zhuǎn)錄DNA分子雜交分子雜交教材課后習(xí)題·概念檢測1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基