親和純化-高等生物分離工程講座

親和純化高等生物別離工程一、親和層析(一)親和層析的原理(二)親和層析的特點(三)親和層析的根本概念(四)親和層析的根本操作(五)親和層析的應(yīng)用與實例二、金屬鰲合層析三、親和膜本章主要內(nèi)容酶與輔酶或酶與底物〔產(chǎn)物或競爭性抑制劑等〕抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結(jié)合蛋白，凝集素與多糖〔或糖蛋白、細(xì)胞外表受體〕核酸與互補(bǔ)鏈〔或組蛋白、核酸多聚酶、結(jié)合蛋白〕細(xì)胞與細(xì)胞外表特異蛋白〔或凝集素〕等。親和層析

AffinityChromatography許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合的特性親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待別離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物〔稱配體或配基〕連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)那么被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上別離并洗脫下來，從而到達(dá)別離提純的目的?！惨弧秤H和層析的原理配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)游離配體雜質(zhì)親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連，作為固定相吸附劑當(dāng)含有混合組份的樣品(流動相)通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出

然后改變流動組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來(一)親和層析的原理親和結(jié)合包括以下幾個方面的相互作用:

靜電作用親和作用分子對的結(jié)合部位上帶有相反電荷時,產(chǎn)生靜電引力。氫鍵如果親和作用分子對的一方分子中含有氧原子或氮原子,結(jié)合部位之間可以產(chǎn)生氫鍵作用。疏水性相互作用如果親和作用分子對的一方分子上含有芳香環(huán)或烴基鏈等疏水基,另一方的結(jié)合部位上也含有疏水區(qū),那么兩者之間可發(fā)生疏水性相互作用。配位鍵如果親和作用分子對均與同一金屬原子配位,那么兩者之間可以通過金屬配位鍵間接結(jié)合。弱共價鍵結(jié)合力較弱的可逆共價鍵。(一)親和層析的原理(二)親和層析的特點純化過程簡單、迅速，且別離效率高31純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高33必須針對某一別離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件34特別適用于別離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子32親和層析載體的選擇具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過具有良好機(jī)械性能的均勻珠狀顆粒，具有良好的流速具有惰性，盡量減少非專一性吸附具有相當(dāng)量的易活化的基團(tuán)，在溫和的條件下能與配基共價和偶聯(lián)在偶聯(lián)、吸附和洗脫時，有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性

(三)親和層析的根本概念親和層析載體的性質(zhì)與選擇常用的親和層析載體纖維素葡聚糖凝膠

瓊脂糖凝膠

多孔玻璃珠1〕纖維素：自然界中數(shù)量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于其結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分子的滲入?；罨蟪в须姾?，非特異性吸附較強(qiáng)，加上空間位阻等原因，其應(yīng)用不如凝膠載體廣泛。目前主要用于別離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。2〕瓊脂糖凝膠：用于親和層析的主要為交聯(lián)珠狀凝膠。這類載體能使吸附物質(zhì)保持活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快。常用的親和層析載體親和層析載體的性質(zhì)與選擇常用的親和層析載體親和層析載體的性質(zhì)與選擇5〕多孔玻璃珠：化學(xué)和物理穩(wěn)定性好，機(jī)械強(qiáng)度高，不但能抵御酶及微生物的作用，還能耐受高溫滅菌和較劇烈的反響條件。缺點：親水性不強(qiáng)，對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附，而且可供連接的化學(xué)活性基團(tuán)也少。改進(jìn)方法：用葡聚糖包被玻璃珠，那么可改善其親水性并增加化學(xué)活性基團(tuán)。用抗原涂布的玻璃珠已成功地別離了免疫淋巴細(xì)胞，在DNA連接的玻璃珠上純化了大腸桿菌的DNA和RNA聚合酶。常用的親和層析載體親和層析載體的性質(zhì)與選擇純化對象和配體之間必須有較強(qiáng)的親和力但親和力太高也是有害的，因為在解離配體復(fù)合物時所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使生物分子變性配體必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配體與生物分子之間特異結(jié)合，但可用于和載體相連，同時又不影響配體與生物分子之間的親和力親和層析配體的性質(zhì)與選擇親和層析配體的選擇親和層析配體的性質(zhì)與選擇配體的偶連酸酐法疊氮化作用復(fù)原性烷基化合物〔西夫堿〕的形成1,非特異性洗脫通常采用改變pH、離子強(qiáng)度、離子種類或者溫度等使與固定配體結(jié)合的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，降低其親和力，但使用較廣泛的是改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度。非專一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，而是洗脫劑中的某一組分與固定配體形成復(fù)合物，使固定化的配體對相應(yīng)的生物大分子的親和力降低。(四)親和層析的根本操作洗脫類型

(一)2,特異性洗脫使用特異的配體作為洗脫劑使用含有與親和配體或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配體或目標(biāo)產(chǎn)物的競爭性結(jié)合來洗脫目標(biāo)產(chǎn)物(四)親和層析的根本操作3,特殊性洗脫親和雙方吸附能力很強(qiáng)，可以用專一的化學(xué)方法裂解配體與載體的連接鍵，獲得的配體-蛋白絡(luò)合物后，再除去配體。實際上特殊性洗脫法也是一種非特異性洗脫方法。(四)親和層析的根本操作洗脫方式(二)1,一步洗脫屬于非選擇性洗脫方法，應(yīng)用于高度特異性吸附劑的結(jié)合，經(jīng)過一次洗脫將被吸附物質(zhì)全部洗脫下來，就可得到較純的別離物。非選擇性洗脫主要受洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、溫度和介電常數(shù)等因素的影響，有效的洗脫液既能改變被吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)象以降低蛋白質(zhì)與配基之間的親和力，又不破壞蛋白質(zhì)和親和吸附劑的穩(wěn)定性。2,分步洗脫：屬于選擇性洗脫方法，應(yīng)用于基團(tuán)特異性吸附劑，親和吸附劑上吸附有特異性不盡相同的多組分樣品，用幾種不同的洗脫條件分幾步洗脫，可以將親和力大小不同的組分分開。3,梯度洗脫：屬于選擇性洗脫方法，利用洗脫液的濃度梯度變化，即解吸附能力逐漸增強(qiáng)，對吸附性質(zhì)相同、特異性程度不同的酶和同工酶有效地洗脫。梯度洗脫比分步洗脫更有可能得到較純的別離對象。此方法需要有梯度混合儀來實現(xiàn)洗脫液的梯度變化。(四)親和層析的根本操作(四)親和層析的根本操作1溫度2抑制氫鍵形成的物質(zhì)3離子強(qiáng)度pH4影響親和層析的主要因素(三)5鰲合劑1離子強(qiáng)度如果親和作用主要源于靜電引力,那么提高離子強(qiáng)度無疑會減弱甚至完全破壞親和作用。氫鍵的形成同樣基于靜電引力,因此提高離子強(qiáng)度也會降低或消除氫鍵作用。疏水性相互作用隨離子強(qiáng)度提高而增大。許多親和吸附的目標(biāo)蛋白可用高濃度鹽溶液洗脫,說明靜電引力在親和作用中占有重要地位。由于溫度升高使得分子和原子的熱運(yùn)動加劇,結(jié)合部位的靜電作用、氫鍵以及金屬配位鍵減弱,但可使疏水性相互作用增強(qiáng)。

溫度2

抑制氫鍵形成的物質(zhì)3脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵的形成。但是,脲和鹽酸胍是蛋白質(zhì)的強(qiáng)烈變性劑,高濃度下容易引起蛋白質(zhì)的變性失活。pH4蛋白質(zhì)多為兩性電解質(zhì),含有許多解離基團(tuán),不同解離基團(tuán)的解離常數(shù)不同。如果靜電引力對親和作用的奉獻(xiàn)較大,那么pH將嚴(yán)重影響親和作用,即在適當(dāng)?shù)膒H下親和作用效果較強(qiáng),而在其他pH下親和結(jié)合作用減弱或完全消失。在親和別離操作中,溶液pH值的選擇是非常重要的。5鰲合劑1,抗原和抗體

利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進(jìn)行別離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上，就可以從血清中別離其對應(yīng)的抗體。(五)親和層析的應(yīng)用抗原、抗體間親和力一般比較強(qiáng)，其解離常數(shù)10–8-10–12M，所以洗脫時是比較困難的，通常需要較強(qiáng)烈的洗脫條件。(五)親和層析的應(yīng)用3,凝集素和糖蛋白

凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白，幾乎都是從植物中提取。它們能識別特殊的糖，因此可以用于別離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細(xì)胞。(五)親和層析的應(yīng)用用凝集素作為配體的親和層析是別離糖蛋白的主要方法。4,多核苷酸和核酸

利用poly-U作為配體可以用于別離mRNA以及各種poly-U結(jié)合蛋白。poly-A可以用于別離RNA聚合酶以及其它poly-A結(jié)合蛋白。以DNA作為配體可以用于別離各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類。(五)親和層析的應(yīng)用5,輔酶

核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子，利用它們與對應(yīng)酶的親和力可以對多種酶類進(jìn)行別離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應(yīng)用很廣泛，可以用于別離各種激酶和脫氫酶。(五)親和層析的應(yīng)用6,別離病毒、細(xì)胞

利用配體與病毒、細(xì)胞外表受體的相互作用，親和層析也可以用于病毒和細(xì)胞的別離。利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細(xì)胞的別離。

例如各種凝集素可以用于別離紅細(xì)胞以及各種淋巴細(xì)胞，胰島素可以用于別離脂肪細(xì)胞等。(五)親和層析的應(yīng)用實例1:親和層析法制備谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)GST參與芳香環(huán)氧化物、過氧化物和鹵化物的解毒作用。GST催化這些帶有親電中心的疏水化合物與復(fù)原型谷胱甘肽〔GSH〕的親核基團(tuán)GS－反響，中和它們的親電部位，使產(chǎn)物水溶性增加，經(jīng)過一系列代謝過程，最后產(chǎn)物為巰基尿酸，被排出體外，從而到達(dá)解毒目的。親和層析利用GST和其底物GSH的特異性結(jié)合來進(jìn)行GST的別離純化。緩沖液A：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L二硫蘇糖醇〔DTT〕，1mmol/LEDTA，0.2mol/LNaCl緩沖液B：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/LGSH，2mmol/LDTT注：根據(jù)酶的性質(zhì)在別離純化過程中需要參加適量的金屬鰲合劑、復(fù)原劑等，以保持酶的活性。所需試劑1.親和層析介質(zhì)Sepharose4B-GSH的制備：Sepharose4B在堿性條件下，參加環(huán)氧氯丙烷和二氧六環(huán)活化將GSH偶聯(lián)到載體上，制成專一吸附劑。2.親和層析柱的準(zhǔn)備：裝柱:柱床體積約4-6mL〔柱高約2-3cm〕，連接蛋白監(jiān)測系統(tǒng)，用BufferA平衡〔約10-20mL〕，至記錄儀基線平穩(wěn)。3.上柱樣品的準(zhǔn)備：(1)按照兩組4g兔肝，剪碎，參加約10倍組織重的BufferA，用組織搗碎機(jī)勻漿。(2)勻漿液先用低速離心機(jī)離心10min，棄沉淀，上清再次離心〔4℃，100000g，40min〕，棄沉淀，濾紙過濾上清液。實驗步驟4.親和層析柱別離GST：(1)上柱：將濾液上柱，流速約4-5秒1滴。(2)平衡：用BufferA洗去雜蛋白至柱中介質(zhì)變白，記錄儀回到基線(3)洗脫：用BufferB洗脫，流速約4-5秒1滴，收集洗脫峰(約5mL)分裝冷凍。上樣平衡洗脫親和層析分離GST示意圖

實例2:色素親和層析三嗪類色素配基的特點是化學(xué)穩(wěn)定性高,價格廉價,適用范圍廣,親和結(jié)合力適中,蛋白質(zhì)容量大。因此,色素親和層析的操作本錢低廉,有很高的實用價值?；谏氐牡鞍踪|(zhì)結(jié)合作用與鹽濃度的關(guān)系,色素親和層析的吸附操作通常在低鹽溶液中進(jìn)行。用相同的低濃度鹽溶液清洗后,通過逐次或線性提高鹽濃度的梯度洗脫法洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。色素親和層析純化脫氫酶:1)取3L菌體細(xì)胞抽提液,用低濃度鹽溶液A清洗,除去未吸附的雜蛋白。2)逐次用高濃度鹽溶液B和輔酶Ⅰ溶液C洗脫,分別獲得羥基酪酸脫氫酶(3-HDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)活性峰。3)收集3-HDH活性局部超濾濃縮到200mL后透析脫鹽。4)再參加到另一個色素親和柱,二次純化。經(jīng)過兩次純化,3-HDH比活提高213倍,第一步34.4倍,第二步6.2倍,最終收率為78%。(孫彥?生物別離工程?P209)金屬螯合層析

(MetalChelatingChromatography)金屬螯合層析技術(shù)在現(xiàn)代基因工程中常用于表達(dá)蛋白的分離

用基因工程的手段表達(dá)蛋白質(zhì)，必需經(jīng)過純化才能實現(xiàn)最終目的。不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)純化條件各不相同太難摸索，這一點和核酸相差甚遠(yuǎn)，所以將目的蛋白和一個親和純化標(biāo)簽融合表達(dá)，通過親和純化Tag蛋白來純化目的蛋白，就成為常用的迂回手段。實例2:His-Tag融合蛋白6×組氨酸與Ni-NTA的結(jié)合是不受構(gòu)象影響的,在天然或變形的條件下進(jìn)行一步純化,使用的是溫和的洗脫液環(huán)境，結(jié)合、洗滌和洗脫步驟不會對蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.6×組氨酸標(biāo)簽比普通的標(biāo)簽(Tag)要小得多，純化后蛋白可以直接進(jìn)行下游操作。6×組氨酸可以用于任何表達(dá)系統(tǒng)，包括:細(xì)菌、桿裝病毒和哺乳動物。6×組氨酸標(biāo)簽在生理溶液pH下不帶電荷，標(biāo)簽不會干預(yù)重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

6×組氨酸標(biāo)簽免疫原性差，重組蛋白可以不需要除去標(biāo)簽直接作為抗原進(jìn)行免疫。利用Xa因子蛋白酶可以方便地將6×組氨酸標(biāo)簽有效地切除,去除標(biāo)簽的蛋白可以用作晶體成像或者核磁共振研究。His-Tag的獨特優(yōu)勢Ni-NTA親和層析純化His-Tag融合蛋白NH2NH2NiHisHisHisHisprotein該通用系統(tǒng)可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。最終在2.5mL的介質(zhì)中可獲得高達(dá)20mg的目的蛋白。純化根本步驟HisTag序列〔6,8或10個連續(xù)的組氨酸殘基)與固定His.Bind樹脂上的二價陽離子Ni2+結(jié)合。并回收目標(biāo)蛋白。His結(jié)合樹脂可以