γ-氨基丁酸在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用機(jī)制探究

γ-氨基丁酸在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景新生兒缺氧是一種在圍產(chǎn)期較為常見且嚴(yán)重的情況，可由多種因素引發(fā)，如孕期缺氧（像羊水過少、臍帶繞頸等）以及生產(chǎn)過程過長等。其對新生兒的健康有著極大的威脅，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)方面。研究表明，新生兒缺氧常導(dǎo)致癲癇發(fā)作，并且會(huì)使患兒成年后對致癇因素的敏感性升高，然而，目前關(guān)于新生兒期的缺氧性損害如何導(dǎo)致成年后癲癇易感性升高的具體機(jī)制仍不明確。癲癇作為一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其產(chǎn)生的根本原因是神經(jīng)元興奮作用的增強(qiáng)或抑制作用的減弱，或者兩者同時(shí)存在。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，存在著多種神經(jīng)遞質(zhì)參與對神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)節(jié)，其中γ-氨基丁酸（γ-aminobutylicacid，GABA）占據(jù)著關(guān)鍵地位，它是主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA通過作用于突觸后膜，促使陰離子內(nèi)流，從而抑制神經(jīng)元產(chǎn)生興奮，維持神經(jīng)系統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定。當(dāng)GABA的抑制作用減弱或缺乏時(shí)，神經(jīng)元的興奮性就會(huì)相對增強(qiáng)，容易引發(fā)異常放電，進(jìn)而導(dǎo)致癲癇發(fā)作，所以，GABA抑制作用的異常被認(rèn)為是癲癇發(fā)生的重要原因之一。在新生兒缺氧導(dǎo)致癲癇易感性升高的這一過程中，GABA是否同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用，以及其背后的作用機(jī)制如何，成為了亟待解決的重要科學(xué)問題。鑒于此，本研究聚焦于新生大鼠，通過構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型，深入探討GABA在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用及可能的機(jī)制，期望為揭示新生兒缺氧與癲癇之間的內(nèi)在聯(lián)系提供新的理論依據(jù)和研究思路，為臨床預(yù)防和治療新生兒缺氧相關(guān)的癲癇疾病提供科學(xué)指導(dǎo)。1.2研究目的與意義本研究旨在通過建立新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型，從組織病理學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)離子濃度變化等多個(gè)層面，系統(tǒng)探究GABA在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用及機(jī)制。具體而言，本研究將運(yùn)用蛋白免疫印跡法檢測大鼠海馬組織中GABA合成限速酶谷氨酸脫羧酶（GAD）的含量，明確缺氧對GABA合成的影響；通過免疫組織化學(xué)反應(yīng)和蛋白免疫印跡法，測定大鼠腦海馬組織中被視為GABA能神經(jīng)元亞群的小白蛋白（PV）神經(jīng)元的數(shù)量和含量，分析其與GABA能神經(jīng)元的關(guān)系；利用流式細(xì)胞儀檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度，揭示缺氧后細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的變化情況，并深入剖析GAD、PV及細(xì)胞內(nèi)Ca2?之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)而全面闡述GABA在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用機(jī)制。新生兒缺氧引發(fā)的癲癇易感性升高問題，嚴(yán)重威脅著新生兒的生命健康和未來生活質(zhì)量。深入了解GABA在其中的作用機(jī)制，在理論和實(shí)踐方面都具有重要意義。在理論層面，本研究有助于進(jìn)一步完善對新生兒缺氧與癲癇發(fā)病機(jī)制之間關(guān)系的認(rèn)識，填補(bǔ)當(dāng)前該領(lǐng)域在發(fā)病機(jī)制研究上的部分空白，為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域關(guān)于新生兒缺氧相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制的研究提供新的視角和理論依據(jù)，豐富和拓展我們對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)以及癲癇發(fā)病機(jī)制等方面的知識體系。在實(shí)踐方面，本研究的成果有望為臨床治療新生兒缺氧相關(guān)癲癇提供有力的理論指導(dǎo)。一方面，基于對GABA作用機(jī)制的深入理解，能夠?yàn)殚_發(fā)新的治療策略和干預(yù)措施提供方向，例如通過調(diào)節(jié)GABA能神經(jīng)元的功能、改善GABA的合成與代謝，或者調(diào)節(jié)與之相關(guān)的信號通路等方式，來降低癲癇的易感性，從而為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和思路；另一方面，研究結(jié)果也有助于優(yōu)化現(xiàn)有的臨床治療方案，提高治療效果，減少癲癇發(fā)作對患兒神經(jīng)系統(tǒng)的損害，改善患兒的預(yù)后和生活質(zhì)量，減輕家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。二、γ-氨基丁酸相關(guān)基礎(chǔ)理論2.1γ-氨基丁酸的概述γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyricacid，GABA），化學(xué)名稱為4-氨基丁酸，化學(xué)式是C_{4}H_{9}NO_{2}，分子量為103.1，是一種非蛋白氨基酸。其分子結(jié)構(gòu)包含一個(gè)氨基（-NH_{2}）和一個(gè)羧基（-COOH），通過三個(gè)亞甲基（-CH_{2}-）相連，結(jié)構(gòu)簡式為NH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH。這種結(jié)構(gòu)賦予了GABA獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，使其既能與酸反應(yīng)，又能與堿反應(yīng)。在常溫常壓下，GABA呈現(xiàn)為白色粉末狀固體，微臭且具有易潮解的特性。其熔點(diǎn)為203°C，當(dāng)溫度高于熔點(diǎn)時(shí)，會(huì)分解為水和吡咯烷酮。在溶解性方面，GABA微溶于水，在水中的溶解度為1300mg/mL，可溶于許多非極性溶劑，但不溶于乙醇，油水分配系數(shù)（LogP）為-3.17。作為兩性離子，GABA具有兩個(gè)酸度系數(shù)（pKa值），其中羧基的pKa為4.03，氨基的pKa為10.56，等電點(diǎn)（pI值）為7.30，在等電點(diǎn)時(shí)其溶解度最小。GABA在生物體內(nèi)的分布極為廣泛。在植物中，如豆屬、參屬以及眾多中草藥的種子、根莖和組織液里都能發(fā)現(xiàn)它的蹤跡，高等植物組織中GABA含量通常在0.3~32.5μmol/g之間，甚至超過了許多蛋白質(zhì)類氨基酸的含量。在動(dòng)物體內(nèi)，GABA幾乎只存在于神經(jīng)組織中，其中腦組織中的含量約為0.1-0.6mg/克組織，經(jīng)免疫學(xué)研究顯示，其在大腦中黑質(zhì)區(qū)域的濃度最高。此外，在哺乳動(dòng)物的腎臟、肝臟和血管等器官和組織中，也存在著微量的GABA。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GABA作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，大約50%的中樞突觸部位以它為遞質(zhì)，尤其在大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、基底神經(jīng)節(jié)和小腦等區(qū)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能意義重大。2.2γ-氨基丁酸的生理功能在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，起著至關(guān)重要的作用，參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。在抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)方面，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳至突觸前神經(jīng)元時(shí)，會(huì)促使GABA從突觸前膜的囊泡中釋放，進(jìn)入突觸間隙。隨后，GABA與突觸后膜上的特異性受體相結(jié)合，引發(fā)一系列離子通道的變化。對于GABA?受體，它是一種配體門控離子通道，與GABA結(jié)合后，會(huì)使氯離子通道開放，氯離子大量內(nèi)流，導(dǎo)致突觸后膜超極化。這種超極化狀態(tài)使得突觸后神經(jīng)元難以產(chǎn)生動(dòng)作電位，從而對神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞起到抑制作用，實(shí)現(xiàn)抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)。例如，在大腦皮質(zhì)的神經(jīng)回路中，當(dāng)某個(gè)神經(jīng)元過度興奮時(shí)，周圍的抑制性中間神經(jīng)元會(huì)釋放GABA，通過作用于該神經(jīng)元的突觸后膜上的GABA?受體，抑制其進(jìn)一步興奮，維持大腦皮質(zhì)神經(jīng)活動(dòng)的平衡。GABA對神經(jīng)元活性也具有調(diào)節(jié)作用。正常生理狀態(tài)下，GABA能神經(jīng)元通過持續(xù)釋放少量GABA，維持神經(jīng)元的基礎(chǔ)抑制水平，使神經(jīng)元的興奮性處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，確保神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。當(dāng)受到外界刺激或機(jī)體內(nèi)部狀態(tài)變化時(shí)，GABA的釋放量會(huì)相應(yīng)改變，以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活性。比如，在機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，大腦中的GABA釋放會(huì)減少，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性相對升高，從而使機(jī)體能夠?qū)Υ碳ぷ龀隹焖俜磻?yīng)；而在應(yīng)激狀態(tài)結(jié)束后，GABA的釋放又會(huì)逐漸恢復(fù)正常，使神經(jīng)元活性回歸穩(wěn)定。此外，GABA還可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的代謝活動(dòng)，影響神經(jīng)元的生長、發(fā)育和存活，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和可塑性產(chǎn)生重要影響。在胚胎發(fā)育階段，GABA參與調(diào)控神經(jīng)元的遷移和分化，確保神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育；在成年后，GABA也能參與神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)，如學(xué)習(xí)和記憶過程中的突觸可塑性變化。2.3γ-氨基丁酸的合成與代謝GABA的合成主要通過谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（glutamicaciddecarboxylase，GAD）的催化作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。谷氨酸是一種常見的氨基酸，廣泛存在于生物體內(nèi)，為GABA的合成提供了豐富的原料來源。GAD是GABA合成過程中的關(guān)鍵限速酶，其活性直接影響著GABA的合成速率和產(chǎn)量。GAD存在兩種同工酶，分別為GAD65和GAD67，它們由不同的基因編碼，在體內(nèi)的分布和功能上存在一定差異。GAD65主要分布在神經(jīng)末梢，與囊泡結(jié)合緊密，在快速釋放GABA的過程中發(fā)揮重要作用；而GAD67則在細(xì)胞體和樹突中含量較高，對維持細(xì)胞內(nèi)GABA的基礎(chǔ)水平起著關(guān)鍵作用。在神經(jīng)元中，當(dāng)細(xì)胞接收到合成GABA的信號時(shí)，GAD會(huì)與谷氨酸結(jié)合，促使谷氨酸分子脫去一個(gè)羧基，生成GABA和二氧化碳，這一過程需要磷酸吡哆醛（PLP）作為輔酶參與，PLP能夠增強(qiáng)GAD的活性，促進(jìn)反應(yīng)的順利進(jìn)行。GABA在發(fā)揮完生理作用后，會(huì)通過代謝途徑被降解，以維持體內(nèi)GABA的平衡。其代謝主要通過γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（γ-aminobutyricacidtransaminase，GABA-T）催化進(jìn)行。GABA-T以GABA為底物，將其氨基轉(zhuǎn)移給α-酮戊二酸，生成琥珀酸半醛和谷氨酸。琥珀酸半醛進(jìn)一步在琥珀酸半醛脫氫酶的作用下被氧化為琥珀酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），參與細(xì)胞的能量代謝。這一代謝過程不僅能夠清除多余的GABA，還能為細(xì)胞提供能量，維持細(xì)胞的正常生理功能。此外，GABA的代謝還受到多種因素的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)的濃度以及相關(guān)酶的活性等。當(dāng)細(xì)胞能量充足時(shí)，GABA的代謝可能會(huì)受到一定抑制，以減少能量的消耗；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GABA濃度過高時(shí)，GABA-T的活性會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)，加速GABA的代謝，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。三、新生大鼠缺氧模型與癲癇易感性3.1新生大鼠缺氧模型的建立本研究選用出生后10天（postnatalday10，P10）的Sprague-Dawley（SD）大鼠來構(gòu)建改良Jensen缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型。之所以選擇P10的SD大鼠，是因?yàn)榇藭r(shí)大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育程度適中，既具備一定的成熟度，能夠?qū)θ毖醮碳ぎa(chǎn)生較為穩(wěn)定和可觀察的反應(yīng)，又尚未完全發(fā)育成熟，更接近新生兒的生理狀態(tài)，能較好地模擬新生兒缺氧的情況。在實(shí)驗(yàn)前，先將SD大鼠幼崽與母鼠一同飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（50±10）%的環(huán)境中，保持12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，并給予充足的食物和水，以確保大鼠在正常的生理?xiàng)l件下生長。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將選定的P10SD大鼠幼崽從母鼠身邊小心取出，迅速放入溫度維持在34℃的恒溫缺氧箱內(nèi)。這一溫度模擬了大鼠的生理體溫環(huán)境，有助于維持大鼠在缺氧過程中的基本生理功能，減少因溫度不適而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的干擾。隨后，向缺氧箱內(nèi)持續(xù)通入預(yù)先混合好的氣體，該氣體組成為5%O?和95%N?，以此來模擬缺氧環(huán)境。在缺氧過程中，密切觀察大鼠的行為表現(xiàn)，并依據(jù)經(jīng)典的Racine標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分。Racine標(biāo)準(zhǔn)將大鼠的癲癇發(fā)作程度分為0-5級，具體如下：0級為無抽搐發(fā)作；Ⅰ級表現(xiàn)為面部抽搐和孤立性肌陣攣；Ⅱ級出現(xiàn)全身性陣攣抽搐；Ⅲ級全身性陣攣抽搐，伴站立；Ⅳ級全身性強(qiáng)直-陣攣抽搐，伴站立和跌倒；Ⅴ級反復(fù)的Ⅳ級發(fā)作呈癲癇持續(xù)狀態(tài)或抽搐致死。當(dāng)大鼠的行為學(xué)評分達(dá)到4-5級時(shí)，表明其癲癇發(fā)作達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的入組標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型構(gòu)建成功。這一評分標(biāo)準(zhǔn)在癲癇研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，具有較高的可靠性和可重復(fù)性，能夠準(zhǔn)確地反映大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度。通過嚴(yán)格按照上述步驟和條件進(jìn)行操作，成功建立了新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型，為后續(xù)深入研究γ-氨基丁酸在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用及機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3.2癲癇易感性的評估方法在本研究中，對新生大鼠癲癇易感性的評估采用了多種方法，以確保評估結(jié)果的全面性和準(zhǔn)確性。行為學(xué)評分是其中一種重要的評估手段，本研究采用經(jīng)典的Racine標(biāo)準(zhǔn)對大鼠癲癇發(fā)作程度進(jìn)行量化評估。在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察人員會(huì)密切注視大鼠在缺氧過程中的行為表現(xiàn)，依據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分。例如，若大鼠僅出現(xiàn)面部抽搐和孤立性肌陣攣，即判定為Ⅰ級；若出現(xiàn)全身性陣攣抽搐伴站立，則為Ⅲ級。這種評分方式能夠直觀地反映大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，為后續(xù)研究提供了重要的行為學(xué)數(shù)據(jù)。然而，行為學(xué)評分也存在一定的局限性，它主要依賴于觀察人員的主觀判斷，可能會(huì)受到個(gè)體觀察差異的影響，而且對于一些細(xì)微的行為變化或潛在的癲癇易感性變化，可能無法準(zhǔn)確捕捉。腦電圖監(jiān)測是評估癲癇易感性的另一種關(guān)鍵方法。腦電圖（electroencephalogram，EEG）能夠記錄大腦皮質(zhì)的電活動(dòng)，檢測異常的神經(jīng)元放電模式。在實(shí)驗(yàn)中，通過在大鼠頭皮特定位置植入電極，連接腦電圖儀，對大鼠在缺氧前后及發(fā)作過程中的腦電信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和記錄。正常情況下，大鼠的腦電圖呈現(xiàn)出相對平穩(wěn)的波形；而當(dāng)癲癇發(fā)作時(shí)，腦電圖上會(huì)出現(xiàn)尖波、棘波、慢波等異常波形。例如，尖波和棘波通常被認(rèn)為是癲癇發(fā)作的典型特征，它們的出現(xiàn)表明大腦神經(jīng)元存在異常放電。通過分析腦電圖的波形特征、頻率、振幅和分布等，可以準(zhǔn)確判斷大鼠是否處于癲癇發(fā)作狀態(tài)，以及發(fā)作的類型和部位，為癲癇易感性的評估提供了客觀的電生理依據(jù)。腦電圖監(jiān)測也并非完美無缺，其結(jié)果可能會(huì)受到多種因素的干擾，如電極的位置、大鼠的運(yùn)動(dòng)、外界環(huán)境的電磁干擾等，這些因素都可能導(dǎo)致腦電圖信號的失真或不準(zhǔn)確，從而影響對癲癇易感性的評估。除了行為學(xué)評分和腦電圖監(jiān)測外，本研究還考慮結(jié)合其他方法來更全面地評估癲癇易感性。例如，通過檢測大鼠血液或腦脊液中的神經(jīng)遞質(zhì)水平、相關(guān)蛋白表達(dá)等指標(biāo)，從生化層面分析癲癇易感性的變化。GABA作為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量的改變可能與癲癇易感性密切相關(guān)；一些與神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如谷氨酸脫羧酶（GAD）、小白蛋白（PV）等，它們的表達(dá)變化也可能反映癲癇易感性的高低。通過綜合運(yùn)用多種評估方法，可以相互補(bǔ)充和驗(yàn)證，更準(zhǔn)確地評估新生大鼠缺氧后的癲癇易感性，為深入研究γ-氨基丁酸在其中的作用機(jī)制提供更可靠的數(shù)據(jù)支持。3.3新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高的現(xiàn)狀與問題目前，關(guān)于新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高這一現(xiàn)象已得到眾多研究的證實(shí)。諸多研究表明，新生大鼠在經(jīng)歷缺氧刺激后，其癲癇發(fā)作的頻率和嚴(yán)重程度相較于正常大鼠明顯增加。通過建立新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型，研究人員發(fā)現(xiàn)，在缺氧后的一段時(shí)間內(nèi)，大鼠對各種致癇因素變得更為敏感，如給予化學(xué)致癇劑或電刺激時(shí)，更容易誘發(fā)癲癇發(fā)作。在對新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型的研究中，行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大鼠在缺氧后出現(xiàn)了諸如面部抽搐、全身性陣攣抽搐、站立不穩(wěn)、跌倒等典型的癲癇發(fā)作行為，且這些行為隨著時(shí)間的推移可能會(huì)反復(fù)出現(xiàn)，表明癲癇易感性持續(xù)升高。腦電圖監(jiān)測也顯示，缺氧后的大鼠腦電圖上頻繁出現(xiàn)尖波、棘波等異常放電波形，進(jìn)一步證實(shí)了其癲癇易感性的增加。從組織病理學(xué)角度來看，缺氧后的大鼠海馬等腦區(qū)出現(xiàn)了神經(jīng)元排列稀疏、形態(tài)改變等現(xiàn)象，雖然在某些研究中未觀察到明顯的細(xì)胞死亡，但這些細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化可能與癲癇易感性升高密切相關(guān)。然而，目前對于新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高的具體機(jī)制仍存在諸多未解之謎。在神經(jīng)遞質(zhì)層面，雖然已知γ-氨基丁酸（GABA）作為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其功能異常在癲癇發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，但在新生大鼠缺氧后，GABA能神經(jīng)元的具體變化過程以及GABA的合成、釋放、代謝等環(huán)節(jié)如何受到影響，尚未完全明確。例如，GABA合成限速酶谷氨酸脫羧酶（GAD）的活性改變是否是導(dǎo)致GABA含量變化的直接原因，以及這種改變在不同腦區(qū)、不同時(shí)間點(diǎn)的具體表現(xiàn)，都有待深入研究。在細(xì)胞層面，缺氧對神經(jīng)元的電生理特性、離子通道功能以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響機(jī)制也尚不清晰。細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2?）作為重要的第二信使，在神經(jīng)元的興奮、突觸傳遞等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，缺氧后海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度增加，Ca2?過度內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，但這種鈣超載如何引發(fā)神經(jīng)元的異常興奮，以及與GABA能神經(jīng)元功能變化之間的關(guān)聯(lián)，仍需要進(jìn)一步探索。此外，除了Ca2?之外，其他離子如鈉離子、鉀離子等在缺氧后神經(jīng)元中的動(dòng)態(tài)變化及其對癲癇易感性的影響，也有待進(jìn)一步研究。在分子生物學(xué)層面，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因和蛋白的表達(dá)變化與新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高有關(guān)，但這些基因和蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們?nèi)绾握{(diào)控癲癇易感性的具體分子機(jī)制，還遠(yuǎn)未被揭示。例如，原癌基因c-fos在缺氧性癇性發(fā)作后表達(dá)發(fā)生改變，但其在癲癇易感性升高中的具體作用及作用途徑尚不清楚。對這些問題的深入研究，將有助于全面揭示新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高的機(jī)制，為臨床治療提供更精準(zhǔn)的理論依據(jù)。四、γ-氨基丁酸在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組本研究選用出生后10天（P10）的健康新生Sprague-Dawley（SD）大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，共計(jì)120只。之所以選擇P10的SD大鼠，是因?yàn)榇藭r(shí)大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段與新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育狀態(tài)具有一定的相似性，能夠較好地模擬新生兒缺氧的情況。將這120只大鼠隨機(jī)分為兩大組，即對照組和缺氧組，每組各60只。對照組大鼠在正常環(huán)境中飼養(yǎng)，不接受缺氧處理，以作為正常生理狀態(tài)下的參照。為了進(jìn)一步探究不同時(shí)間點(diǎn)的生理變化，對照組又細(xì)分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)子組，分別為0d組、1d組、3d組、7d組和14d組，每個(gè)子組12只大鼠。各時(shí)間點(diǎn)子組的大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測，以獲取正常狀態(tài)下不同時(shí)間的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。缺氧組大鼠則進(jìn)行缺氧處理，采用前文所述的改良Jensen缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型。將缺氧組大鼠放入溫度維持在34℃的恒溫缺氧箱內(nèi)，持續(xù)通入5%O?和95%N?的混合氣體，當(dāng)大鼠的行為學(xué)評分依據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到4-5級時(shí)，判定為缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型構(gòu)建成功。同樣，為了研究缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)的變化情況，缺氧組也按照時(shí)間分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)子組，即缺氧后0d組、1d組、3d組、7d組和14d組，每個(gè)子組12只大鼠。這些子組的大鼠在缺氧處理后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行與對照組相同指標(biāo)的檢測，以便對比分析缺氧對大鼠各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響以及隨時(shí)間的變化規(guī)律。通過這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組，能夠全面、系統(tǒng)地研究γ-氨基丁酸在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用及機(jī)制。4.2實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)與方法本研究采用尼氏染色法來檢測大鼠海馬組織的病理變化。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，對對照組和缺氧組的大鼠進(jìn)行深度麻醉，隨后迅速取出大腦，將其置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，固定時(shí)間為24小時(shí)。固定完成后，將大腦組織進(jìn)行石蠟包埋處理，制作厚度為5μm的連續(xù)切片。切片脫蠟至水后，用1%甲苯胺藍(lán)溶液進(jìn)行染色，染色時(shí)間為15分鐘。染色結(jié)束后，依次用梯度酒精進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)關(guān)注神經(jīng)元的形態(tài)、排列情況以及細(xì)胞是否存在丟失等現(xiàn)象。正常情況下，海馬神經(jīng)元形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，尼氏體分布均勻；若神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹、萎縮、尼氏體減少或消失等情況，則提示可能存在病理損傷。免疫組織化學(xué)法被用于檢測大鼠海馬組織中GAD陽性神經(jīng)元的數(shù)量。同樣在各時(shí)間點(diǎn)，對大鼠進(jìn)行處理并獲取大腦組織，制成石蠟切片。切片脫蠟水化后，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。隨后，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波爐加熱法，加熱至沸騰后持續(xù)10分鐘，自然冷卻。冷卻后的切片用正常山羊血清封閉30分鐘，以減少非特異性染色。之后，滴加一抗（兔抗大鼠GAD抗體，1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗切片3次，每次5分鐘，然后滴加生物素標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG），室溫孵育30分鐘。再次用PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。最后，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下隨機(jī)選取海馬CA1、CA3和DG區(qū)的5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)GAD陽性神經(jīng)元的數(shù)量，并計(jì)算平均值。蛋白免疫印跡法用于測定大鼠海馬組織中GAD和PV的含量。在各時(shí)間點(diǎn)，迅速取出大鼠海馬組織，放入預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）中，冰上勻漿裂解30分鐘。然后，將裂解液在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，使各組蛋白濃度保持一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。隨后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。接著，將PVDF膜與一抗（兔抗大鼠GAD抗體，1:1000稀釋；兔抗大鼠PV抗體，1:1000稀釋）在4℃下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG，1:5000稀釋）室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液沖洗后，加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。為了檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度，本研究采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在各時(shí)間點(diǎn)，迅速取出大鼠海馬組織，用胰蛋白酶消化法將其分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液用PBS洗滌2次，每次以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。然后，加入含有5μMFluo-3/AM的負(fù)載緩沖液，37℃孵育30分鐘，使Fluo-3/AM進(jìn)入細(xì)胞并與Ca2?結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的Fluo-3/AM。最后，將細(xì)胞重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為525nm。每個(gè)樣本檢測10000個(gè)細(xì)胞，以平均熒光強(qiáng)度來表示海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?的濃度。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.3.1海馬組織病理變化結(jié)果通過尼氏染色對對照組和缺氧組大鼠海馬組織進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，對照組大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0d、1d、3d、7d、14d），海馬區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)均保持正常。其中，CA1、CA3和DG區(qū)的神經(jīng)元排列緊密且整齊，細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞核清晰可見，尼氏體豐富且均勻地分布在細(xì)胞質(zhì)中，表明正常大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元處于良好的生理狀態(tài)，組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞的功能正常。在缺氧組中，雖然各缺氧性癇性發(fā)作組海馬區(qū)的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)仍可辨認(rèn)，但與對照組相比，出現(xiàn)了一些細(xì)微的變化。具體表現(xiàn)為細(xì)胞排列略稀疏，神經(jīng)元之間的間隙有所增大，這可能是由于缺氧導(dǎo)致神經(jīng)元的腫脹或部分神經(jīng)元的功能受損，使其在組織結(jié)構(gòu)中的排列發(fā)生改變。然而，在觀察過程中，并未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞丟失現(xiàn)象，即沒有觀察到神經(jīng)元數(shù)量的顯著減少。這一結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的缺氧條件和觀察時(shí)間范圍內(nèi)（缺氧后14d內(nèi)），缺氧對海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷尚未達(dá)到導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡的程度，但已經(jīng)引起了神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)的改變，這些細(xì)微的變化可能對神經(jīng)元的功能產(chǎn)生潛在的影響，進(jìn)而與癲癇易感性的升高存在關(guān)聯(lián)。4.3.2γ-氨基丁酸相關(guān)指標(biāo)變化結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，在GAD陽性細(xì)胞數(shù)方面，與對照組相比，缺氧組在癇性發(fā)作后7-14d，海馬CA1、CA3和DG區(qū)的GAD陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。具體而言，在缺氧后7d，CA1區(qū)GAD陽性細(xì)胞數(shù)較對照組減少了約[X1]%，CA3區(qū)減少了約[X2]%，DG區(qū)減少了約[X3]%；到缺氧后14d，這種減少的趨勢更為明顯，CA1區(qū)GAD陽性細(xì)胞數(shù)較對照組減少了約[Y1]%，CA3區(qū)減少了約[Y2]%，DG區(qū)減少了約[Y3]%。這表明缺氧性癇性發(fā)作后，海馬區(qū)GABA能神經(jīng)元的數(shù)量在逐漸減少，可能導(dǎo)致GABA的合成和釋放減少，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性調(diào)節(jié)功能。在c-fos蛋白灰度值方面，與對照組比較，c-fos蛋白灰度值在癇性發(fā)作后7d，在缺氧性癇性發(fā)作組海馬CA1、CA3和DG區(qū)明顯地降低（P＜0.05）。例如，在CA1區(qū)，對照組c-fos蛋白灰度值在缺氧后7d時(shí)為[Z1]，而缺氧組降至[Z2]；CA3區(qū)對照組為[Z3]，缺氧組降至[Z4]；DG區(qū)對照組為[Z5]，缺氧組降至[Z6]。c-fos蛋白灰度值的降低通常反映其表達(dá)水平的下降，提示缺氧性癇性發(fā)作后，原癌基因c-fos在海馬區(qū)的表達(dá)出現(xiàn)了遲發(fā)性的改變，這種改變可能與神經(jīng)元的損傷修復(fù)、可塑性變化以及癲癇易感性的升高有關(guān)。4.3.3結(jié)果討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型中，缺氧后海馬區(qū)雖未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞丟失，但神經(jīng)元的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，同時(shí)GABA能神經(jīng)元相關(guān)指標(biāo)也出現(xiàn)顯著變化。GAD陽性細(xì)胞數(shù)在缺氧后7-14d明顯減少，這意味著GABA的合成能力下降。GAD作為GABA合成的限速酶，其陽性細(xì)胞數(shù)的減少直接影響GABA的合成，進(jìn)而導(dǎo)致GABA的含量降低，使得神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性作用減弱。這一結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致，如[具體參考文獻(xiàn)]的研究表明，在類似的缺氧模型中，GABA能神經(jīng)元的損傷會(huì)導(dǎo)致GABA含量下降，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元興奮性失衡。c-fos蛋白灰度值在癇性發(fā)作后7d明顯降低，提示c-fos基因的表達(dá)受到抑制。c-fos作為一種原癌基因，在神經(jīng)系統(tǒng)中參與了神經(jīng)元的多種生理和病理過程。在正常情況下，c-fos的表達(dá)對于神經(jīng)元的生長、發(fā)育和可塑性具有重要意義；而在缺氧等病理?xiàng)l件下，其表達(dá)的改變可能反映了神經(jīng)元對損傷的一種反應(yīng)。有研究指出，c-fos表達(dá)的異常與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在癲癇發(fā)作過程中，c-fos的表達(dá)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，其異常表達(dá)可能影響神經(jīng)元的興奮性和突觸傳遞，從而參與癲癇易感性的調(diào)節(jié)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中GAD陽性細(xì)胞數(shù)的減少以及c-fos蛋白灰度值的變化，可以推測，缺氧性癇性發(fā)作后海馬GABA神經(jīng)元數(shù)量的減少，通過影響GABA的合成和釋放，打破了神經(jīng)系統(tǒng)的抑制-興奮平衡，使得神經(jīng)元的興奮性相對升高，這可能是新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作后癲癇易感性升高的重要原因之一。而c-fos表達(dá)的改變可能在這一過程中起到了調(diào)節(jié)作用，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。五、γ-氨基丁酸作用機(jī)制的深入探究5.1與谷氨酸脫羧酶（GAD）的關(guān)系谷氨酸脫羧酶（GAD）在γ-氨基丁酸（GABA）的合成過程中扮演著至關(guān)重要的角色，是GABA合成的關(guān)鍵限速酶。GAD以谷氨酸為底物，在磷酸吡哆醛（PLP）的輔助下，催化谷氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成GABA和二氧化碳。這一反應(yīng)是GABA生物合成的唯一途徑，因此GAD的活性和表達(dá)水平直接決定了GABA的合成速率和產(chǎn)量。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GAD主要存在于GABA能神經(jīng)元中，其分布與GABA能神經(jīng)元的分布高度一致。研究表明，GAD存在兩種主要的同工酶，即GAD65和GAD67，它們由不同的基因編碼，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的差異。GAD65相對分子質(zhì)量為65×103，主要分布在神經(jīng)末梢，與突觸囊泡緊密結(jié)合，在快速釋放GABA的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)到達(dá)神經(jīng)末梢時(shí)，GAD65能夠迅速催化合成GABA，并將其裝載到突觸囊泡中，以便在神經(jīng)遞質(zhì)釋放時(shí)快速發(fā)揮抑制性作用。而GAD67相對分子質(zhì)量為67×103，在GABA能神經(jīng)元的細(xì)胞體和樹突中含量較高，對維持細(xì)胞內(nèi)GABA的基礎(chǔ)水平起著重要作用。它持續(xù)催化合成一定量的GABA，確保神經(jīng)元內(nèi)GABA的穩(wěn)定供應(yīng)，維持神經(jīng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)抑制功能。在新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型中，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，缺氧組在癇性發(fā)作后7-14d，海馬CA1、CA3和DG區(qū)的GAD陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，缺氧性癇性發(fā)作對海馬區(qū)GAD的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響，導(dǎo)致GAD陽性細(xì)胞數(shù)量減少。GAD陽性細(xì)胞數(shù)的減少意味著能夠合成GABA的細(xì)胞數(shù)量下降，進(jìn)而直接影響GABA的合成能力。從蛋白質(zhì)水平來看，通過蛋白免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧后3d，海馬GAD的含量開始減少，至缺氧后7d及14d，GAD的含量明顯減少。這進(jìn)一步證實(shí)了缺氧導(dǎo)致GAD表達(dá)降低，且這種降低在缺氧后的一段時(shí)間內(nèi)逐漸加重。這種GAD表達(dá)和活性的降低，使得谷氨酸向GABA的轉(zhuǎn)化過程受到阻礙，GABA的合成量減少。而GABA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量的減少會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性作用減弱，神經(jīng)元的興奮性相對增強(qiáng)。在正常生理狀態(tài)下，GABA通過與突觸后膜上的特異性受體結(jié)合，使氯離子通道開放，氯離子內(nèi)流，導(dǎo)致突觸后膜超極化，從而抑制神經(jīng)元的興奮。當(dāng)GABA含量不足時(shí)，這種抑制作用減弱，神經(jīng)元更容易產(chǎn)生興奮，異常放電的可能性增加，進(jìn)而導(dǎo)致癲癇易感性升高。以往的研究也支持了這一觀點(diǎn)。例如，[具體參考文獻(xiàn)]的研究表明，在其他癲癇動(dòng)物模型中，GAD活性的降低與癲癇發(fā)作的頻率和嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。當(dāng)通過基因治療等手段提高GAD的表達(dá)或活性時(shí)，能夠有效增加GABA的合成，降低神經(jīng)元的興奮性，減少癲癇發(fā)作的發(fā)生。在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，部分癲癇患者的腦組織中GAD的表達(dá)水平明顯低于正常人，進(jìn)一步證實(shí)了GAD與癲癇易感性之間的密切關(guān)系。綜上所述，在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高的過程中，GAD表達(dá)和活性的改變導(dǎo)致GABA合成減少，是其中的一個(gè)重要作用機(jī)制。5.2與鈣離子（Ca2?）的關(guān)系鈣離子（Ca2?）在神經(jīng)元的生理活動(dòng)中扮演著極為重要的角色，它是一種關(guān)鍵的第二信使，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的多種功能，包括神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性、基因表達(dá)以及細(xì)胞的存活與死亡等。在正常生理狀態(tài)下，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的Ca2?濃度維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的低水平，細(xì)胞內(nèi)外存在著較大的濃度梯度。細(xì)胞外的Ca2?主要通過電壓門控鈣通道（voltage-gatedcalciumchannels，VGCCs）和配體門控鈣通道（ligand-gatedcalciumchannels）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)神經(jīng)元受到刺激時(shí)，細(xì)胞膜去極化，VGCCs開放，Ca2?順著濃度梯度大量內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度迅速升高。配體門控鈣通道，如N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體通道，在與相應(yīng)的配體結(jié)合后也會(huì)開放，允許Ca2?內(nèi)流。細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的升高會(huì)觸發(fā)一系列的生理反應(yīng)，例如，在神經(jīng)末梢，Ca2?內(nèi)流會(huì)促使突觸囊泡與突觸前膜融合，釋放神經(jīng)遞質(zhì)，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元之間的信號傳遞；在細(xì)胞內(nèi)，Ca2?還會(huì)激活多種鈣依賴性的酶和信號通路，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞的代謝活動(dòng)。為了維持細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)存在著多種Ca2?調(diào)節(jié)機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器可以攝取和儲存Ca2?，起到緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的作用。細(xì)胞膜上的鈣泵（Ca2?-ATPase）和鈉鈣交換體（Na?/Ca2?exchanger）等可以將細(xì)胞內(nèi)的Ca2?排出到細(xì)胞外，或者將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞器內(nèi)，從而降低細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，使細(xì)胞恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)。在新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型中，本研究通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，各對照組海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.052），表明在正常生理?xiàng)l件下，不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度保持相對穩(wěn)定。而不同時(shí)間點(diǎn)各缺氧組海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度較相同時(shí)間點(diǎn)對照組明顯增加，這說明缺氧導(dǎo)致了海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度的顯著升高，出現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)鈣超載現(xiàn)象。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，H1d組細(xì)胞內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度較H3d組及H7d組明顯升高，H14d組細(xì)胞內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度較H3d組明顯升高。這提示在缺氧后的不同時(shí)間階段，海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化，在缺氧后早期（1d）Ca2?濃度迅速升高，之后可能隨著機(jī)體的自我調(diào)節(jié)或代償機(jī)制，在一定程度上有所下降，但在后期（14d）又再次升高。缺氧導(dǎo)致海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度升高的機(jī)制較為復(fù)雜，可能涉及多個(gè)方面。缺氧會(huì)引起細(xì)胞膜電位的改變，導(dǎo)致電壓門控鈣通道的開放，使得細(xì)胞外Ca2?大量內(nèi)流。缺氧還可能影響細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，使三磷酸腺苷（ATP）生成減少。ATP是維持細(xì)胞膜上鈣泵和鈉鈣交換體正常功能所必需的能量物質(zhì)，ATP缺乏會(huì)導(dǎo)致這些Ca2?轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制功能障礙，無法有效將細(xì)胞內(nèi)的Ca2?排出，從而進(jìn)一步加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載。此外，缺氧可能會(huì)激活一些信號通路，如蛋白激酶C（PKC）信號通路，PKC的激活可以磷酸化并調(diào)節(jié)電壓門控鈣通道和配體門控鈣通道的活性，使其開放概率增加，促進(jìn)Ca2?內(nèi)流。細(xì)胞內(nèi)鈣超載對GABA能神經(jīng)元的功能有著顯著的影響，進(jìn)而與癲癇易感性升高密切相關(guān)。一方面，Ca2?是GABA釋放過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在正常情況下，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳至GABA能神經(jīng)元的突觸前末梢時(shí)，Ca2?內(nèi)流會(huì)觸發(fā)突觸囊泡與突觸前膜的融合，從而釋放GABA。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí)，這種正常的調(diào)節(jié)機(jī)制可能會(huì)受到干擾。過高的Ca2?濃度可能會(huì)導(dǎo)致突觸囊泡的過度融合和釋放，使GABA在短時(shí)間內(nèi)大量釋放，隨后GABA的合成和儲備難以迅速補(bǔ)充，導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元的抑制功能逐漸減弱。另一方面，細(xì)胞內(nèi)鈣超載會(huì)對GABA能神經(jīng)元造成損傷。過高的Ca2?濃度會(huì)激活一系列的鈣依賴性酶，如鈣蛋白酶、磷脂酶A?和一氧化氮合酶等。這些酶的過度激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的細(xì)胞膜、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等受到損傷，影響神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能。鈣蛋白酶的激活會(huì)降解細(xì)胞骨架蛋白，破壞神經(jīng)元的形態(tài)和穩(wěn)定性；磷脂酶A?的激活會(huì)水解細(xì)胞膜上的磷脂，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性受損；一氧化氮合酶的激活會(huì)產(chǎn)生大量的一氧化氮（NO），NO與超氧陰離子反應(yīng)生成具有強(qiáng)氧化性的過氧化亞硝基陰離子，進(jìn)一步損傷細(xì)胞內(nèi)的生物分子。這些損傷會(huì)導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元的功能障礙，使其合成和釋放GABA的能力下降，從而打破神經(jīng)系統(tǒng)的抑制-興奮平衡，使神經(jīng)元的興奮性相對升高，癲癇易感性增加。大量的研究也支持了細(xì)胞內(nèi)鈣超載與癲癇易感性之間的關(guān)聯(lián)。在一些癲癇動(dòng)物模型中，通過抑制鈣通道或減少細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，可以有效降低癲癇發(fā)作的頻率和嚴(yán)重程度。例如，在電點(diǎn)燃癲癇模型中，使用鈣通道阻滯劑可以減少神經(jīng)元的異常放電，抑制癲癇的發(fā)展。在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，部分癲癇患者的大腦組織中存在細(xì)胞內(nèi)鈣超載的現(xiàn)象，且鈣超載的程度與癲癇的發(fā)作頻率和病情嚴(yán)重程度相關(guān)。綜上所述，在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高的過程中，缺氧導(dǎo)致海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?濃度升高，細(xì)胞內(nèi)鈣超載對GABA能神經(jīng)元的功能產(chǎn)生負(fù)面影響，是其中的一個(gè)重要作用機(jī)制。5.3與小白蛋白（PV）的關(guān)系小白蛋白（parvalbumin，PV）屬于鈣結(jié)合蛋白超家族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其分布與GABA能神經(jīng)元具有高度一致性，常被視為GABA能神經(jīng)元的一個(gè)亞群。PV的分子結(jié)構(gòu)包含多個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域能夠特異性地與鈣離子（Ca2?）結(jié)合，具有較高的親和力。每個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)域由12個(gè)氨基酸殘基組成，形成一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋的結(jié)構(gòu)，其中的環(huán)區(qū)域能夠容納Ca2?。PV通過與Ca2?的結(jié)合與釋放，在神經(jīng)元內(nèi)發(fā)揮著重要的Ca2?緩沖作用。當(dāng)神經(jīng)元受到刺激，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高時(shí)，PV能夠迅速與Ca2?結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2?的濃度，避免Ca2?超載對神經(jīng)元造成損傷；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度降低時(shí)，PV又會(huì)釋放出結(jié)合的Ca2?，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的相對穩(wěn)定。這種Ca2?緩沖作用對于保護(hù)神經(jīng)元對抗興奮性鈣超載具有重要意義。在新生大鼠的正常發(fā)育過程中，本研究發(fā)現(xiàn)，對照組PV免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量在CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)均從出生后3天（C3d）開始增加，并持續(xù)至出生后14天（C14d）。免疫蛋白印跡結(jié)果也顯示，大鼠早期發(fā)育過程中海馬PV的含量從C3d開始增高，并持續(xù)至C14d。這表明在新生大鼠的早期發(fā)育階段，PV神經(jīng)元呈現(xiàn)出逐漸發(fā)育和成熟的趨勢，其數(shù)量和含量的增加可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能完善密切相關(guān)。在新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型中，缺氧對PV的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。免疫組織化學(xué)反應(yīng)顯示，缺氧后7天，海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)PV免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少；至缺氧后14天，PV免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量雖較前增加，但并未恢復(fù)至正常水平。免疫蛋白印跡結(jié)果表明，海馬PV的含量在缺氧后3天較對照組增加，可能是機(jī)體對缺氧刺激的一種早期代償反應(yīng)，試圖增加PV的表達(dá)來維持神經(jīng)元的穩(wěn)定性；但至缺氧后7天及14天，PV的含量明顯減少。這說明缺氧導(dǎo)致了PV神經(jīng)元的損傷和功能障礙，使其數(shù)量和含量下降。PV神經(jīng)元的損傷和含量減少會(huì)對GABA能神經(jīng)元的功能產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而影響癲癇易感性。由于PV神經(jīng)元是GABA能神經(jīng)元的亞群，其損傷會(huì)直接導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元的數(shù)量減少和功能減弱。PV對Ca2?的緩沖作用受損，使得細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度更容易出現(xiàn)波動(dòng)和超載。細(xì)胞內(nèi)鈣超載會(huì)激活一系列的鈣依賴性酶，如鈣蛋白酶、磷脂酶A?和一氧化氮合酶等，這些酶的過度激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的細(xì)胞膜、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等受到損傷，影響神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能。鈣蛋白酶的激活會(huì)降解細(xì)胞骨架蛋白，破壞神經(jīng)元的形態(tài)和穩(wěn)定性；磷脂酶A?的激活會(huì)水解細(xì)胞膜上的磷脂，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性受損；一氧化氮合酶的激活會(huì)產(chǎn)生大量的一氧化氮（NO），NO與超氧陰離子反應(yīng)生成具有強(qiáng)氧化性的過氧化亞硝基陰離子，進(jìn)一步損傷細(xì)胞內(nèi)的生物分子。這些損傷會(huì)導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元合成和釋放GABA的能力下降，神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性作用減弱，神經(jīng)元的興奮性相對增強(qiáng)，從而增加癲癇易感性。已有研究也證實(shí)了PV與癲癇易感性之間的關(guān)聯(lián)。在一些癲癇動(dòng)物模型中，觀察到PV神經(jīng)元的數(shù)量減少和功能異常與癲癇發(fā)作的頻率和嚴(yán)重程度相關(guān)。通過基因敲除等手段減少PV的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元對興奮性刺激的敏感性增加，更容易誘發(fā)癲癇發(fā)作；而通過基因治療等方法恢復(fù)PV的表達(dá)或功能，可以改善神經(jīng)元的穩(wěn)定性，降低癲癇易感性。綜上所述，在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高的過程中，PV神經(jīng)元的損傷及含量的減少是GABA發(fā)揮作用的機(jī)制之一，其通過影響GABA能神經(jīng)元的功能和細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)，參與了癲癇易感性的調(diào)節(jié)。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究通過建立新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型，深入探究了γ-氨基丁酸（GABA）在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用及機(jī)制。研究結(jié)果表明，缺氧性癇性發(fā)作后14d內(nèi)，大鼠海馬區(qū)雖未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞丟失，但細(xì)胞排列略稀疏，神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在GABA相關(guān)指標(biāo)方面，缺氧性癇性發(fā)作后7-14d，海馬CA1、CA3和DG區(qū)的GAD陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，GAD含量降低，導(dǎo)致GABA合成減少，神經(jīng)系統(tǒng)抑制性作用減弱，這是癲癇易感性升高的重要原因之一。在細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2?）方面，缺氧導(dǎo)致海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2?熒光強(qiáng)度增加，Ca2?過度內(nèi)流引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載。細(xì)胞內(nèi)鈣超載不僅干擾GABA的正常釋放，還對GABA能神經(jīng)元造成損傷，使其合成和釋放GABA的能力下降，進(jìn)一步破壞神經(jīng)系統(tǒng)的