DB34T 4950-2024禽白血病-通 用AJ三重PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

34DB34/T4950—2024禽白血病—通用/A/J三重PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Technicalregulationforgeneric/A/JtriplePCRdetectionforavianleukemia安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I1NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技DNA：脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicPBS：磷酸鹽緩沖鹽水（phosphatebufALV：禽白血病病毒（avianleukRT-PCR；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscription-polymerase25.7DEPC水：在100mL三蒸水中加入100μLDEPC,18℃~22℃室溫下過夜，121℃滅菌15min。也5.875%乙醇：75mL無水乙醇加25mLDEPC水，配置成75%乙醇溶液，-20℃遇冷備用。5.1150×TAE電泳緩沖液，見附錄A.2。5.121.5%瓊脂糖凝膠，見附錄A.3。5.13DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：DL2000Marker,商品化試劑5.14電泳上樣緩沖液：100mL溶液中含0.25g溴酚藍(lán)及40g蔗糖。5.16陰性對(duì)照，健康雞血液或者組織提取的DNA/RNA。6.2臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(4℃,離心速度12000r/min以上)。取待檢組織樣本于滅菌的組織研磨中，按質(zhì)量體積比1:1加入滅菌PBS,充分研磨，制備組織勻漿，4℃,3000r/min離心15min,取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL離心管中，對(duì)樣本進(jìn)行編號(hào)。8.2RNA的提取8.2.2TRIzol試劑提取待檢38.2.4加入200μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置5min,4℃12000r/min,離心15min。8.2.5吸取上層水相至一新的1.5mL無RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇(-20℃預(yù)冷),混勻，室溫放置5min,4℃12000r/min,離心15min。離心15min。8.4PCR擴(kuò)增將表1中的試劑充分混勻，4000r/min離心30s。PCR的反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性10s、95℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s、35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸8min擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。制備1.5%的瓊脂糖凝膠板(參見附錄A.3),取5.0μLPCR產(chǎn)物和1.0μL電泳上樣緩沖液混合后，分別加樣到凝膠孔中。100V恒壓下電泳15～20min,在凝膠成像系統(tǒng)上觀9.1試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照在338bp、274bp、145bp位置同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶；陰性對(duì)照無任45KH2PO4A.2.10.5mo1/L乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液（p羥基甲基氨基甲烷（Tris）242g65'-TACTTGAGCCCTTGCGACTC-3’5'-ATGGTGAACCCGGCTCTTTC-3’5'-TTACATGGGCCAACCGTACA-3’5'-GGTGGCTCATCCCACATAGA-3’5'-AGGCCCTATGTCAACCAATCA-3’5'-GCCCTGTCCCCACAAATCAA-3’7C.1pol基因（通用）特異性擴(kuò)增片段（145bp）TACTTGAGCCCTTGCGACTCAAGCACCCATCTCTGTGCATGTTGCATTATATGGACGATCTTTTACTAGCCGCCCAGGTTGGAAGCGGCAGGGGAGGAGGTTATTAGTATACTGGAAAGAGCCC.2gp85基因(A亞群)特異性擴(kuò)增片TTACATGGGCCAACCGTACAGGCCAAACGGATTTCTGCCTCTCTACACAGTCAGCCACCTCCCCTTTTCAAACATATCCCGTCCCCTATTTCCGAAGGTGATTTTAAGGGATACGTCTCTGATAATTGCACCACCTTGGGAACTGACCGGTCCAGCATTACCGGCGGCCCTGACAACAGCACCACCCTCACTTATCGAAAGGTTTCATGCTTGCTGTTAAAGCTGAATC.3gp85基因(J亞群)特異性擴(kuò)增片段(338bp)AGGCCCTATGTCAACCAATCATGGACGATGGTAAGTCCAATAAACATAGAGAGTTTTTCAATAAGTCGTAGATATTGTCCAGTAACGAGACTCGTTACTATAGAGGGGACCTTTCTAATTGGTGTGGTTCAAAAAGGGGAAAATGGTCAGCGGGGTACAACAAAATGTTCCAGCAACAC