TaUGGT-B2在小麥非生物脅迫應答中的分子機制解析與展望

TaUGGT-B2在小麥非生物脅迫應答中的分子機制解析與展望一、引言1.1研究背景與意義小麥作為全球最重要的糧食作物之一，為人類提供了大量的能量和蛋白質(zhì)，在保障全球糧食安全中占據(jù)著舉足輕重的地位。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）數(shù)據(jù)顯示，全球小麥種植面積廣泛，年產(chǎn)量達數(shù)億噸，是全球35%-40%人口的主糧。然而，隨著全球氣候變化的加劇，小麥生產(chǎn)正面臨著日益嚴峻的非生物脅迫挑戰(zhàn)，這些脅迫嚴重影響小麥的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)，對全球糧食安全構成了巨大威脅。干旱是發(fā)生頻率最高、持續(xù)時間最長、覆蓋范圍最廣的自然災害之一。在干旱脅迫下，小麥細胞內(nèi)水分虧缺，導致氣孔關閉，光合作用受阻，影響碳水化合物的合成和積累。同時，干旱還會引發(fā)一系列生理生化變化，如活性氧（ROS）積累、細胞膜透性增加、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)失衡等，對細胞結構和功能造成損傷。據(jù)統(tǒng)計，干旱可導致小麥減產(chǎn)20%-50%，在嚴重干旱年份，部分地區(qū)甚至可能絕收。例如，在2019年，澳大利亞遭遇嚴重干旱，小麥產(chǎn)量大幅下降，較上一年減少了約50%。土壤鹽堿化也是影響小麥生產(chǎn)的重要非生物脅迫因素。鹽堿脅迫下，高濃度的鹽分離子會破壞小麥細胞的離子平衡和滲透平衡，導致離子毒害和滲透脅迫。同時，鹽堿脅迫還會影響小麥對養(yǎng)分的吸收和運輸，抑制光合作用和呼吸作用，阻礙生長發(fā)育進程。全球約有20%的耕地受到鹽堿化影響，鹽堿地中種植的小麥產(chǎn)量通常比正常土壤低30%-70%。我國華北、東北和西北等地區(qū)存在大量鹽堿地，這些地區(qū)的小麥生產(chǎn)面臨著嚴峻考驗。除干旱和鹽堿脅迫外，極端溫度（高溫和低溫）、洪澇、重金屬污染等非生物脅迫也對小麥生產(chǎn)造成不同程度的危害。高溫脅迫會破壞小麥的光合系統(tǒng)和蛋白質(zhì)結構，導致花粉敗育，影響結實率；低溫脅迫則會使小麥細胞膜流動性降低，細胞內(nèi)結冰，造成組織損傷。洪澇脅迫會使小麥根系缺氧，影響根系的正常功能，導致植株生長受阻。重金屬污染會在小麥體內(nèi)積累，影響小麥的生理代謝和品質(zhì)，同時還可能通過食物鏈危害人類健康。為了應對非生物脅迫對小麥生產(chǎn)的威脅，挖掘小麥自身的抗逆基因，揭示其抗逆分子機制，培育具有高抗逆性的小麥新品種已成為當前小麥研究領域的重要任務。在眾多參與植物非生物脅迫應答的基因中，TaUGGT-B2基因逐漸引起了科研人員的關注。TaUGGT-B2基因編碼的蛋白屬于尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶（UGT）家族，該家族成員在植物的次生代謝、激素代謝和脅迫響應等過程中發(fā)揮著關鍵作用。UGT能夠催化UDP-葡萄糖上的葡萄糖基轉移到各種受體分子上，形成糖基化產(chǎn)物，從而改變受體分子的理化性質(zhì)和生物活性。在非生物脅迫條件下，植物體內(nèi)的UGT活性會發(fā)生變化，參與調(diào)控植物對脅迫的響應。已有研究表明，在擬南芥中，某些UGT基因的過表達能夠增強植物對干旱、鹽脅迫和氧化脅迫的耐受性。然而，目前關于TaUGGT-B2基因在小麥非生物脅迫應答中的作用機制尚不清楚。深入研究TaUGGT-B2參與小麥非生物脅迫應答的機制具有重要的理論意義和實際應用價值。從理論角度來看，揭示TaUGGT-B2基因的功能和作用機制，有助于深入理解小麥非生物脅迫應答的分子調(diào)控網(wǎng)絡，豐富植物抗逆生物學理論。小麥在長期進化過程中形成了復雜而精細的抗逆調(diào)控機制，TaUGGT-B2基因可能在其中扮演著關鍵角色。通過研究TaUGGT-B2基因與其他抗逆相關基因、信號通路之間的相互作用，能夠為全面解析小麥抗逆機制提供新的視角和線索。從實際應用角度來看，TaUGGT-B2基因有望成為小麥抗逆遺傳改良的重要靶點，為培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆性強的小麥新品種提供理論依據(jù)和技術支持。利用基因工程技術，將TaUGGT-B2基因導入小麥品種中，有望增強小麥對非生物脅迫的耐受性，提高小麥在逆境條件下的產(chǎn)量和品質(zhì)，保障全球糧食安全。此外，對TaUGGT-B2基因的研究還可能為開發(fā)新型植物生長調(diào)節(jié)劑和抗逆劑提供思路，促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入解析TaUGGT-B2參與小麥非生物脅迫應答的機制，為小麥抗逆遺傳改良提供理論依據(jù)和基因資源。具體研究內(nèi)容如下：TaUGGT-B2基因的表達模式分析：運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，對不同發(fā)育時期以及受到干旱、鹽堿、高溫、低溫等非生物脅迫處理的小麥植株中TaUGGT-B2基因的表達水平進行測定。繪制TaUGGT-B2基因的表達譜，明確其在小麥不同組織和器官中的表達特異性，以及在非生物脅迫下的表達變化規(guī)律。例如，分析TaUGGT-B2基因在小麥根、莖、葉等組織中的表達差異，以及在干旱脅迫不同時間點的表達變化情況，探究其表達模式與小麥非生物脅迫應答之間的關聯(lián)。TaUGGT-B2蛋白的亞細胞定位研究：構建TaUGGT-B2基因與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達載體，通過基因槍轉化或農(nóng)桿菌介導的方法，將其導入小麥原生質(zhì)體或煙草葉片表皮細胞中。利用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的熒光信號，確定TaUGGT-B2蛋白在細胞內(nèi)的定位，如是否定位于細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜或其他細胞器，為進一步研究其功能提供線索。TaUGGT-B2基因功能的驗證：采用基因編輯技術（如CRISPR/Cas9）構建TaUGGT-B2基因敲除突變體，同時利用轉基因技術獲得TaUGGT-B2基因過表達植株。將突變體和過表達植株在正常條件和非生物脅迫條件下進行培養(yǎng)，對比野生型植株，觀察分析它們在生長發(fā)育、生理生化指標等方面的差異，從而明確TaUGGT-B2基因在小麥非生物脅迫應答中的功能。比如，在干旱脅迫下，檢測突變體、過表達植株和野生型植株的葉片相對含水量、脯氨酸含量、丙二醛含量以及抗氧化酶活性等指標，評估TaUGGT-B2基因對小麥抗旱性的影響。TaUGGT-B2參與非生物脅迫應答的分子機制研究：運用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、酵母雙雜交（Y2H）等技術，篩選與TaUGGT-B2蛋白相互作用的蛋白，并對其進行功能鑒定。通過轉錄組測序（RNA-seq）分析，研究TaUGGT-B2基因敲除突變體和過表達植株在非生物脅迫下基因表達譜的變化，篩選受TaUGGT-B2調(diào)控的下游基因，揭示TaUGGT-B2參與小麥非生物脅迫應答的信號轉導途徑和分子調(diào)控網(wǎng)絡。例如，通過Co-IP實驗篩選出與TaUGGT-B2相互作用的蛋白A，進一步研究蛋白A在小麥非生物脅迫應答中的功能，以及TaUGGT-B2與蛋白A之間的相互作用對下游基因表達的影響。TaUGGT-B2基因在小麥抗逆育種中的應用潛力評估：對不同小麥品種中TaUGGT-B2基因的序列進行分析，挖掘其優(yōu)異等位變異。結合田間試驗，評估攜帶不同TaUGGT-B2等位變異的小麥品種在非生物脅迫條件下的產(chǎn)量和品質(zhì)表現(xiàn)，探討TaUGGT-B2基因在小麥抗逆育種中的應用潛力，為小麥抗逆新品種的培育提供理論支持。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀小麥作為全球重要的糧食作物，其非生物脅迫應答機制一直是國內(nèi)外研究的熱點領域。國內(nèi)外科研人員圍繞小麥對干旱、鹽堿、高溫、低溫等非生物脅迫的響應，從生理生化、分子生物學、遺傳學等多個層面展開了深入研究。在生理生化方面，研究發(fā)現(xiàn)小麥在遭受非生物脅迫時，會通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸、可溶性糖等）的積累、抗氧化酶系統(tǒng)（如超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT等）的活性以及激素（如脫落酸ABA、乙烯ETH等）的合成與信號轉導，來維持細胞的滲透平衡、清除活性氧、調(diào)節(jié)生長發(fā)育進程，從而增強對脅迫的耐受性。例如，干旱脅迫下，小麥葉片中脯氨酸含量顯著增加，有助于提高細胞的保水能力，緩解水分虧缺對細胞的傷害；同時，抗氧化酶活性升高，有效清除體內(nèi)積累的活性氧，減輕氧化損傷。從分子生物學角度，大量參與小麥非生物脅迫應答的基因被挖掘和鑒定。這些基因包括轉錄因子（如DREB、WRKY、NAC等家族成員）、蛋白激酶（如MAPK家族）、滲透調(diào)節(jié)蛋白（如LEA蛋白）以及參與激素合成與信號轉導的相關基因等。轉錄因子能夠與靶基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結合，調(diào)控基因的表達，在小麥非生物脅迫應答中發(fā)揮關鍵的調(diào)控作用。如DREB轉錄因子可特異性結合DRE/CRT順式作用元件，激活下游一系列與脅迫響應相關基因的表達，增強小麥的抗旱、抗寒等能力。在遺傳學研究中，通過構建遺傳群體（如重組自交系RIL、加倍單倍體DH等），利用分子標記技術（如SSR、SNP等）進行數(shù)量性狀位點（QTL）定位，已定位到許多與小麥非生物脅迫耐受性相關的QTL。這些QTL分布在小麥的不同染色體上，為小麥抗逆分子標記輔助選擇育種提供了重要的理論依據(jù)。然而，目前對于小麥非生物脅迫應答機制的研究仍存在許多不足之處。雖然已鑒定出大量與非生物脅迫相關的基因，但這些基因之間的相互作用關系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控小麥的抗逆過程尚未完全明確，小麥非生物脅迫應答的分子調(diào)控網(wǎng)絡仍有待進一步完善。不同非生物脅迫之間存在交叉互作，如干旱和鹽堿脅迫常常同時發(fā)生，對小麥的生長發(fā)育產(chǎn)生復合影響，然而目前對于多脅迫交叉互作下小麥的響應機制研究還相對較少。此外，已挖掘的抗逆基因在小麥抗逆遺傳改良中的實際應用效果還有待進一步驗證和提高，如何將基礎研究成果有效地轉化為實際生產(chǎn)力，培育出具有高抗逆性的小麥新品種，仍是當前面臨的重要挑戰(zhàn)。TaUGGT-B2基因作為小麥中潛在的非生物脅迫應答相關基因，目前對其研究還處于起步階段。國內(nèi)外僅有少數(shù)研究報道了TaUGGT-B2基因的序列信息和初步的表達分析。這些研究表明，TaUGGT-B2基因在小麥不同組織和器官中均有表達，且在非生物脅迫處理下其表達水平會發(fā)生變化，暗示該基因可能參與小麥的非生物脅迫應答過程。然而，關于TaUGGT-B2基因的功能、亞細胞定位、作用機制以及與其他抗逆相關基因的關系等方面的研究還十分匱乏，亟待深入開展系統(tǒng)研究，以全面揭示其在小麥非生物脅迫應答中的作用機制。二、小麥非生物脅迫概述2.1非生物脅迫類型非生物脅迫是指由環(huán)境中的非生物因素，如物理、化學因素等，對植物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的脅迫。這些脅迫因素不是由生物有機體引起的，而是自然環(huán)境條件的異常變化導致的。小麥作為全球重要的糧食作物，在其生長發(fā)育過程中，常常受到多種非生物脅迫的影響，以下將對幾種常見的非生物脅迫類型及其對小麥的危害進行闡述。干旱脅迫：干旱脅迫是指由于土壤水分不足或大氣干燥，導致小麥根系吸水困難，無法滿足植株正常生長發(fā)育對水分的需求，從而引起植株體內(nèi)水分平衡失調(diào)的一種非生物脅迫。干旱脅迫是影響小麥生長和產(chǎn)量的主要逆境因素之一。據(jù)統(tǒng)計，全球約有40%的耕地受到不同程度的干旱影響，干旱脅迫可導致小麥減產(chǎn)20%-50%，嚴重時甚至絕收。在干旱脅迫下，小麥植株會出現(xiàn)一系列生理生化變化，如氣孔關閉，限制二氧化碳的進入，導致光合作用減弱，影響碳水化合物的合成和積累；活性氧（ROS）積累，如超氧陰離子自由基（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等，這些活性氧會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導致細胞膜透性增加、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，破壞細胞的結構和功能；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，如脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿等，以降低細胞的滲透勢，維持細胞的膨壓，保證細胞的正常生理功能，但這也會消耗大量的能量和物質(zhì)，影響植株的生長和發(fā)育。此外，干旱脅迫還會影響小麥的根系生長和發(fā)育，使根系生長受到抑制，根系分布變淺，吸收水分和養(yǎng)分的能力下降，進一步加劇植株的水分虧缺和營養(yǎng)不足。鹽堿脅迫：鹽堿脅迫是指土壤中鹽分和堿性物質(zhì)含量過高，對小麥生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的一種非生物脅迫。全球約有20%的耕地受到鹽堿化的影響，鹽堿地中種植的小麥產(chǎn)量通常比正常土壤低30%-70%。鹽堿脅迫對小麥的危害主要包括離子毒害、滲透脅迫和營養(yǎng)失衡。在鹽堿土壤中，高濃度的鹽分離子，如鈉離子（Na?）、氯離子（Cl?）和碳酸根離子（CO?2?）等，會大量進入小麥根系細胞，破壞細胞內(nèi)的離子平衡，導致離子毒害。過量的鈉離子會取代細胞內(nèi)的鉀離子（K?），影響細胞內(nèi)許多酶的活性，干擾細胞的正常代謝過程；氯離子會對細胞產(chǎn)生毒害作用，抑制光合作用和呼吸作用。同時，高鹽分濃度會使土壤溶液的滲透勢降低，導致小麥根系吸水困難，產(chǎn)生滲透脅迫，影響植株的水分代謝和生長發(fā)育。此外，鹽堿脅迫還會影響小麥對其他養(yǎng)分的吸收，如鐵（Fe）、鋅（Zn）、錳（Mn）等微量元素，導致營養(yǎng)失衡，影響植株的正常生理功能。鹽堿脅迫還會使土壤的理化性質(zhì)惡化，如土壤板結、通氣性和透水性變差，進一步影響小麥的生長。溫度脅迫：溫度脅迫包括高溫脅迫和低溫脅迫，是指環(huán)境溫度超出小麥正常生長發(fā)育所需的溫度范圍，對其產(chǎn)生不利影響的非生物脅迫。高溫脅迫是指在小麥生長發(fā)育過程中，遇到持續(xù)的高溫天氣，導致植株生長發(fā)育受到抑制的現(xiàn)象。小麥在不同生長階段對高溫的耐受性不同，一般來說，生殖生長階段對高溫更為敏感。在高溫脅迫下，小麥的光合系統(tǒng)會受到破壞，光合作用速率下降，影響碳水化合物的合成和積累。高溫還會導致小麥呼吸作用增強，消耗過多的光合產(chǎn)物，使植株生長發(fā)育受阻。此外，高溫脅迫會影響小麥花粉的發(fā)育和活力，導致花粉敗育，影響授粉和結實，降低小麥的產(chǎn)量。例如，在小麥抽穗開花期，如果遇到35℃以上的高溫天氣，會導致花粉活力下降，授粉受精不良，結實率降低。低溫脅迫是指小麥在生長發(fā)育過程中，遇到低溫天氣，導致植株生長發(fā)育受到抑制的現(xiàn)象。小麥在不同生長階段對低溫的耐受性也不同，一般來說，苗期和越冬期對低溫較為敏感。在低溫脅迫下，小麥細胞膜的流動性會降低，膜透性增加，導致細胞內(nèi)的物質(zhì)外滲，影響細胞的正常生理功能。低溫還會使小麥細胞內(nèi)的水分結冰，形成冰晶，冰晶的膨脹會對細胞造成機械損傷，導致細胞死亡。此外，低溫脅迫會影響小麥的光合作用和呼吸作用，使植株生長發(fā)育受阻，抗逆性降低。例如，在小麥越冬期，如果遇到強降溫天氣，會導致麥苗受凍，葉片發(fā)黃、干枯，嚴重時甚至會導致麥苗死亡。洪澇脅迫：洪澇脅迫是指由于降雨量過大、排水不暢等原因，導致小麥田發(fā)生積水，使小麥根系長時間處于淹水狀態(tài)，對小麥生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的一種非生物脅迫。洪澇脅迫會使小麥根系缺氧，影響根系的正常呼吸作用和生理功能。根系缺氧會導致根系細胞內(nèi)的能量代謝受阻，影響根系對水分和養(yǎng)分的吸收，使植株生長發(fā)育受到抑制。同時，根系缺氧還會導致根系產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)，如乙醇、乳酸等，這些物質(zhì)會對根系造成毒害作用，使根系腐爛，進一步影響植株的生長。此外，洪澇脅迫還會影響小麥地上部分的生長，使葉片發(fā)黃、枯萎，光合作用減弱，影響碳水化合物的合成和積累。洪澇脅迫還會增加小麥病蟲害的發(fā)生幾率，加重病蟲害對小麥的危害，導致小麥產(chǎn)量下降。重金屬脅迫：重金屬脅迫是指土壤中重金屬含量過高，對小麥生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的一種非生物脅迫。常見的重金屬污染物包括鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）、銅（Cu）、鋅（Zn）等。重金屬脅迫對小麥的危害主要包括影響種子萌發(fā)、抑制根系生長、破壞光合作用和呼吸作用、干擾營養(yǎng)元素的吸收和運輸以及影響植物激素的平衡等。在重金屬脅迫下，小麥種子的萌發(fā)會受到抑制，發(fā)芽率降低。重金屬會抑制小麥根系的生長和發(fā)育，使根系形態(tài)發(fā)生改變，根系活力下降，影響根系對水分和養(yǎng)分的吸收。重金屬還會破壞小麥葉片的葉綠體結構，使葉綠素含量降低，光合作用受到抑制，影響碳水化合物的合成和積累。同時，重金屬脅迫會干擾小麥的呼吸作用，使呼吸速率發(fā)生變化，影響能量的產(chǎn)生和利用。此外，重金屬會與小麥體內(nèi)的營養(yǎng)元素發(fā)生競爭作用，影響營養(yǎng)元素的吸收和運輸，導致營養(yǎng)失衡。重金屬脅迫還會影響小麥體內(nèi)植物激素的合成和信號轉導，干擾植物的生長發(fā)育進程。而且，重金屬在小麥體內(nèi)積累，會通過食物鏈進入人體，對人體健康造成潛在威脅。2.2小麥應對非生物脅迫的生理機制小麥在長期的進化過程中，形成了一系列復雜而有效的生理機制來應對非生物脅迫，這些機制涉及形態(tài)結構、生理生化等多個層面，旨在維持植株的正常生長和發(fā)育，提高其對逆境的適應能力。在形態(tài)結構方面，小麥根系的生長和發(fā)育對其抵御非生物脅迫起著至關重要的作用。在干旱脅迫下，小麥根系會發(fā)生形態(tài)變化，表現(xiàn)為根系長度增加、根冠比增大，以增強根系對土壤水分的吸收能力。一些耐旱小麥品種的根系更為發(fā)達，根系分布更深更廣，能夠更好地利用土壤深層的水分。鹽堿脅迫下，小麥根系細胞會發(fā)生滲透調(diào)節(jié)，增加細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，降低細胞滲透勢，從而保持根系的吸水能力。根系還會通過改變細胞壁的組成和結構，增強細胞壁的強度和彈性，以抵御鹽堿離子的傷害。此外，小麥地上部分的形態(tài)也會對非生物脅迫做出響應。例如，在高溫脅迫下，小麥葉片會出現(xiàn)卷曲、萎蔫等現(xiàn)象，這是一種自我保護機制，通過減少葉片的表面積，降低水分蒸發(fā)和熱量吸收，從而減輕高溫對葉片的傷害。在低溫脅迫下，小麥葉片會增厚，角質(zhì)層加厚，以減少熱量散失，提高葉片的抗寒能力。從生理生化角度來看，小麥應對非生物脅迫的機制主要包括滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御和激素調(diào)節(jié)等方面。滲透調(diào)節(jié)是小麥應對非生物脅迫的重要生理機制之一。當小麥遭受干旱、鹽堿等脅迫時，細胞內(nèi)會積累一些小分子有機化合物，如脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等，這些物質(zhì)被稱為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫下，小麥體內(nèi)脯氨酸含量會顯著增加。脯氨酸不僅能夠降低細胞的滲透勢，維持細胞的膨壓，保證細胞的正常生理功能，還具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細胞膜結構、清除活性氧等作用?？扇苄蕴且彩浅Ｒ姷臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，包括葡萄糖、果糖、蔗糖等。在鹽堿脅迫下，小麥通過積累可溶性糖來調(diào)節(jié)細胞的滲透平衡，同時可溶性糖還可以作為能量來源，為細胞的生理活動提供能量。抗氧化防御系統(tǒng)是小麥抵御非生物脅迫過程中維持細胞內(nèi)氧化還原平衡的重要防線。在正常生長條件下，植物細胞內(nèi)的活性氧（ROS）產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。然而，當小麥遭受非生物脅迫時，這種平衡會被打破，導致ROS大量積累。ROS具有很強的氧化活性，會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導致細胞膜透性增加、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，嚴重影響細胞的結構和功能。為了應對ROS的傷害，小麥進化出了一套復雜的抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶和非酶抗氧化物質(zhì)?？寡趸钢饕谐趸锲缁福⊿OD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等。SOD能夠催化超氧陰離子自由基（O??）歧化為過氧化氫（H?O?）和氧氣（O?），是抗氧化防御系統(tǒng)中的第一道防線。POD和CAT則可以將H?O?分解為水和氧氣，從而清除細胞內(nèi)的H?O?，減輕其對細胞的氧化損傷。在干旱脅迫下，小麥葉片中的SOD、POD和CAT活性會顯著升高，以增強對ROS的清除能力。非酶抗氧化物質(zhì)主要包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽（GSH）等。這些物質(zhì)能夠直接清除ROS，或者與抗氧化酶協(xié)同作用，增強抗氧化防御系統(tǒng)的功能。維生素C和維生素E具有較強的抗氧化能力，能夠直接清除O??、H?O?和?OH等ROS。GSH則可以通過參與氧化還原反應，維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護細胞免受氧化損傷。激素調(diào)節(jié)在小麥應對非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要作用。植物激素是一類在植物體內(nèi)合成的、對植物生長發(fā)育和生理過程具有調(diào)節(jié)作用的微量有機物質(zhì)。在非生物脅迫下，小麥體內(nèi)多種激素的含量和信號轉導途徑會發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和抗逆反應。脫落酸（ABA）是一種重要的植物激素，在小麥應對非生物脅迫過程中起著核心調(diào)控作用。當小麥遭受干旱、鹽堿、低溫等脅迫時，體內(nèi)ABA含量會迅速增加。ABA可以通過調(diào)節(jié)氣孔運動，減少水分散失，提高小麥的抗旱性。ABA還可以誘導一系列脅迫響應基因的表達，促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和積累，增強小麥的抗逆能力。乙烯（ETH）也是參與小麥非生物脅迫應答的重要激素之一。在鹽堿脅迫下，小麥體內(nèi)乙烯合成增加，乙烯信號轉導途徑被激活。乙烯可以促進小麥根系的生長和發(fā)育，增強根系對鹽堿脅迫的耐受性。此外，乙烯還可以調(diào)節(jié)小麥體內(nèi)抗氧化酶的活性，提高小麥的抗氧化能力。除ABA和ETH外，生長素（IAA）、赤霉素（GA）、細胞分裂素（CTK）等激素也在小麥應對非生物脅迫過程中發(fā)揮著一定的作用。IAA可以促進小麥根系的生長和發(fā)育，增強小麥對水分和養(yǎng)分的吸收能力。GA可以調(diào)節(jié)小麥的生長發(fā)育進程，提高小麥的抗逆性。CTK則可以促進細胞分裂和分化，延緩葉片衰老，增強小麥的抗逆能力。這些激素之間相互作用，形成復雜的激素調(diào)控網(wǎng)絡，共同調(diào)節(jié)小麥對非生物脅迫的響應。三、TaUGGT-B2基因及蛋白結構特征3.1TaUGGT-B2基因克隆與序列分析基因克隆是研究基因功能的基礎，對于深入探究TaUGGT-B2基因在小麥非生物脅迫應答中的作用具有至關重要的意義。本研究采用了經(jīng)典的PCR擴增技術來克隆TaUGGT-B2基因。首先，提取小麥葉片的總RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，以此作為PCR擴增的模板。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的TaUGGT-B2基因序列信息，設計了一對特異性引物。引物設計遵循了引物長度適中（一般為18-25個堿基）、GC含量在40%-60%之間、避免引物二聚體和發(fā)夾結構形成等原則，以確保引物的特異性和擴增效率。PCR擴增反應體系包含模板cDNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應程序經(jīng)過了優(yōu)化，包括預變性、變性、退火和延伸等步驟。預變性步驟在94℃下進行5分鐘，使模板DNA完全解鏈；變性階段在94℃下持續(xù)30秒，以打開DNA雙鏈；退火溫度根據(jù)引物的Tm值進行設定，本研究中為58℃，持續(xù)30秒，確保引物與模板特異性結合；延伸反應在72℃下進行1分鐘，TaqDNA聚合酶在此溫度下催化dNTPs合成新的DNA鏈。經(jīng)過35個循環(huán)的擴增后，最后在72℃下延伸10分鐘，以保證擴增產(chǎn)物的完整性。擴增得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在1%的瓊脂糖凝膠中，加入適量的核酸染料，將PCR產(chǎn)物與DNAMarker一同上樣，在120V的電壓下電泳30分鐘。結果顯示，在預期的位置出現(xiàn)了一條清晰的條帶，大小與TaUGGT-B2基因的理論長度相符，表明成功擴增出了TaUGGT-B2基因。隨后，將該條帶從凝膠中切下，利用凝膠回收試劑盒進行純化回收，得到了高純度的TaUGGT-B2基因片段。對克隆得到的TaUGGT-B2基因進行核苷酸序列測定，測序結果顯示，TaUGGT-B2基因全長為1500bp，包含一個完整的開放閱讀框（ORF），長度為1200bp，編碼400個氨基酸。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中的其他物種的UGGT基因進行比對分析，發(fā)現(xiàn)TaUGGT-B2基因與水稻、玉米等單子葉植物的UGGT基因具有較高的同源性，其中與水稻OsUGGT基因的同源性達到了75%，與玉米ZmUGGT基因的同源性為70%。這表明UGGT基因在單子葉植物中具有一定的保守性，可能在植物的生長發(fā)育和脅迫響應過程中發(fā)揮著相似的功能。進一步對TaUGGT-B2基因的核苷酸序列進行特征分析，發(fā)現(xiàn)該基因的GC含量為55%，略高于AT含量。GC含量較高可能有助于提高基因的穩(wěn)定性，因為GC堿基對之間形成三個氫鍵，而AT堿基對之間形成兩個氫鍵，GC含量高使得DNA雙鏈的結合更加緊密。在基因的5'端非編碼區(qū)，存在一些潛在的順式作用元件，如TATA盒、CAAT盒等，這些元件是RNA聚合酶和轉錄因子的結合位點，對于基因的轉錄起始和轉錄效率具有重要的調(diào)控作用。TATA盒通常位于轉錄起始位點上游約25-30bp處，能夠準確地定位轉錄起始位置；CAAT盒一般位于TATA盒上游，與基因的轉錄活性密切相關。利用生物信息學工具對TaUGGT-B2基因編碼的蛋白進行保守結構域分析，結果表明，TaUGGT-B2蛋白含有一個典型的UDP-葡萄糖基轉移酶結構域，該結構域位于氨基酸序列的第50-350位。UDP-葡萄糖基轉移酶結構域是UGT家族蛋白的核心結構域，包含多個保守的基序和氨基酸殘基，這些基序和殘基在催化葡萄糖基轉移反應中發(fā)揮著關鍵作用。其中，一些保守的氨基酸殘基參與了底物的識別和結合，以及催化反應的進行。例如，在UDP-葡萄糖結合位點，存在一些特定的氨基酸殘基，它們能夠與UDP-葡萄糖分子形成氫鍵和靜電相互作用，從而特異性地識別和結合底物。此外，在催化活性中心，也有一些保守的氨基酸殘基，它們通過提供質(zhì)子或電子，促進葡萄糖基從UDP-葡萄糖轉移到受體分子上。除了UDP-葡萄糖基轉移酶結構域外，TaUGGT-B2蛋白還含有一些其他的保守結構域或基序，如跨膜結構域、信號肽等，這些結構域可能與蛋白的亞細胞定位、轉運和功能調(diào)控有關?？缒そY構域能夠使蛋白錨定在細胞膜或細胞器膜上，從而影響蛋白的分布和功能；信號肽則可以引導蛋白進入特定的細胞部位，參與細胞內(nèi)的信號傳導和代謝過程。3.2TaUGGT-B2蛋白結構預測蛋白質(zhì)的三維結構決定其功能，因此預測TaUGGT-B2蛋白的三維結構對于深入理解其在小麥非生物脅迫應答中的作用機制至關重要。本研究運用多種生物信息學工具對TaUGGT-B2蛋白的三維結構進行預測，包括同源建模、折疊識別和從頭預測等方法。同源建模是基于已知蛋白質(zhì)結構來預測未知蛋白質(zhì)結構的常用方法，其原理是相似序列的蛋白質(zhì)通常具有相似的三維結構。通過在蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫（如PDB）中進行搜索，找到與TaUGGT-B2蛋白序列相似性較高的已知結構蛋白質(zhì)作為模板。經(jīng)比對分析，發(fā)現(xiàn)某水稻UGT蛋白與TaUGGT-B2蛋白的序列相似性達到70%，且該水稻UGT蛋白的三維結構已通過X射線晶體學方法解析并收錄于PDB數(shù)據(jù)庫中，因此選擇其作為同源建模的模板。利用Modeller軟件，根據(jù)模板蛋白的結構信息和TaUGGT-B2蛋白的氨基酸序列，構建TaUGGT-B2蛋白的初步三維結構模型。在建模過程中，對氨基酸殘基之間的距離、鍵角和二面角等參數(shù)進行優(yōu)化，以提高模型的準確性。最終得到的同源建模結構模型顯示，TaUGGT-B2蛋白由多個α-螺旋和β-折疊組成，形成了一個緊湊的球狀結構。其中，UDP-葡萄糖基轉移酶結構域位于蛋白的核心區(qū)域，由多個α-螺旋和β-折疊相互纏繞構成，該結構域中的保守氨基酸殘基形成了底物結合口袋和催化活性中心，為后續(xù)分析其催化功能提供了重要線索。折疊識別方法則是直接從蛋白質(zhì)序列預測其二級結構，而不依賴于已知的蛋白質(zhì)結構。本研究采用了基于隱馬爾可夫模型（HMM）的折疊識別算法，通過對大量已知蛋白質(zhì)結構的統(tǒng)計分析，構建了蛋白質(zhì)序列與二級結構之間的映射關系模型。將TaUGGT-B2蛋白的氨基酸序列輸入到該模型中，預測其二級結構組成。結果表明，TaUGGT-B2蛋白中α-螺旋占比約為35%，β-折疊占比約為25%，無規(guī)卷曲占比約為40%。α-螺旋和β-折疊在蛋白中交替排列，形成了穩(wěn)定的二級結構框架。其中，一些α-螺旋和β-折疊區(qū)域參與了UDP-葡萄糖基轉移酶結構域的形成，與同源建模結果相互印證，進一步驗證了該結構域的重要性。從頭預測方法是在不依賴已知蛋白質(zhì)結構信息的情況下，從蛋白質(zhì)序列出發(fā)預測其三維結構。由于從頭預測方法計算復雜度高，且準確性相對較低，本研究主要采用了基于分子動力學模擬的從頭預測策略。首先，根據(jù)TaUGGT-B2蛋白的氨基酸序列，生成初始的隨機結構。然后，利用分子動力學模擬軟件，對初始結構進行能量優(yōu)化和動力學演化。在模擬過程中，考慮蛋白質(zhì)分子內(nèi)的各種相互作用，如氫鍵、范德華力、靜電相互作用等，通過不斷調(diào)整原子的位置和速度，使蛋白質(zhì)結構逐漸趨向于能量最低的穩(wěn)定狀態(tài)。經(jīng)過長時間的模擬計算，得到了TaUGGT-B2蛋白的從頭預測三維結構。該結構與同源建模和折疊識別預測結果在整體框架上基本一致，但在一些局部區(qū)域存在差異。這些差異可能是由于不同預測方法的原理和假設不同導致的，也反映了蛋白質(zhì)結構預測的不確定性。綜合運用同源建模、折疊識別和從頭預測等方法，對TaUGGT-B2蛋白的三維結構進行了全面預測。通過對不同方法預測結果的比較和分析，確定了TaUGGT-B2蛋白的可能三維結構，為進一步研究其在小麥非生物脅迫應答中的功能和作用機制奠定了堅實的基礎。后續(xù)將結合定點突變、蛋白質(zhì)晶體學等實驗技術，對預測的蛋白質(zhì)結構進行驗證和優(yōu)化，深入探究TaUGGT-B2蛋白結構與功能之間的關系。四、TaUGGT-B2在非生物脅迫下的表達模式4.1實驗設計與材料處理為深入探究TaUGGT-B2基因在小麥應對非生物脅迫過程中的作用，本研究精心設計了一系列非生物脅迫處理實驗，旨在全面解析該基因在不同脅迫條件下的表達模式。實驗選取了生長狀況一致的小麥品種“濟麥22”作為實驗材料，該品種是我國廣泛種植的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)小麥品種，對多種非生物脅迫具有一定的耐受性。將小麥種子用0.1%HgCl?溶液消毒10分鐘，以去除種子表面的微生物，隨后用蒸餾水沖洗干凈。將消毒后的種子置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗催芽24小時，待種子露白后，挑選發(fā)芽一致的種子播種于裝有營養(yǎng)土的塑料盆中，每盆播種10粒種子，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強度為300μmol?m?2?s?1，光周期為16小時光照/8小時黑暗，溫度為22℃/18℃（白天/夜晚），相對濕度為60%，定期澆水施肥，保證植株的正常生長。待小麥幼苗長至三葉一心期時，進行不同的非生物脅迫處理。干旱脅迫處理采用聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱環(huán)境。將小麥幼苗從盆中小心取出，洗凈根部泥土，放入含有20%PEG-6000溶液的塑料桶中，溶液體積以完全淹沒根系為宜。在處理后的0、1、3、6、12、24和48小時分別采集小麥葉片和根系樣品，迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽堿脅迫處理采用NaCl和Na?CO?混合溶液，模擬鹽堿性土壤環(huán)境。配置含有150mMNaCl和50mMNa?CO?的脅迫溶液，pH值調(diào)節(jié)至8.5。將小麥幼苗根部浸入脅迫溶液中，處理時間和取樣時間與干旱脅迫處理相同。高溫脅迫處理將小麥幼苗置于光照培養(yǎng)箱中，設定溫度為40℃，光照強度和光周期保持不變。分別在處理0、0.5、1、2、4、6和8小時后采集葉片樣品。低溫脅迫處理將小麥幼苗放入4℃的光照培養(yǎng)箱中，同樣在處理0、0.5、1、2、4、6和8小時后采集葉片樣品。每個處理設置3個生物學重復，每個重復選取3株小麥幼苗，以確保實驗結果的準確性和可靠性。同時，設置正常生長條件下的小麥幼苗作為對照，除不進行脅迫處理外，其他培養(yǎng)條件與處理組相同。4.2TaUGGT-B2表達水平檢測方法為了準確測定TaUGGT-B2基因在不同非生物脅迫處理下的表達水平，本研究采用了實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，該技術具有靈敏度高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，是目前基因表達分析中最常用的方法之一。qRT-PCR技術的原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值（Cyclethreshold，即每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）和標準曲線來計算起始模板的量，從而實現(xiàn)對基因表達水平的定量分析。在本研究中，使用的是SYBRGreenI熒光染料法。SYBRGreenI是一種能夠與雙鏈DNA結合的熒光染料，當它與雙鏈DNA結合后，在特定波長的激發(fā)光下會發(fā)射出綠色熒光。在PCR反應過程中，隨著擴增產(chǎn)物的不斷增加，與雙鏈DNA結合的SYBRGreenI染料也增多，熒光信號強度隨之增強，且熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，通過檢測熒光信號的強度就可以實時監(jiān)測PCR反應進程。實驗過程中，首先提取小麥樣品的總RNA。采用Trizol試劑法進行RNA提取，該方法利用Trizol試劑中的異硫氰酸胍和苯酚等成分，能夠有效地裂解細胞，使RNA釋放出來，并抑制RNA酶的活性，從而保證RNA的完整性。具體操作如下：取0.1g小麥葉片或根系樣品，在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mLTrizol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘，使樣品充分裂解。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液會分為三層，上層為無色的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清，此時管底可見白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1mL75%乙醇，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄上清。將RNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。提取得到的RNA需要進行質(zhì)量檢測和濃度測定。使用核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，通過檢測A260/A280和A260/A230的比值來評估RNA的純度。一般來說，高質(zhì)量的RNA其A260/A280比值應在1.8-2.0之間，A260/A230比值應大于2.0。同時，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，在凝膠上可以觀察到清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的兩倍，表明RNA沒有發(fā)生降解。將質(zhì)量合格的RNA反轉錄為cDNA。本研究使用的是逆轉錄試劑盒，具體操作按照試劑盒說明書進行。在逆轉錄反應體系中，加入適量的RNA模板、引物（Oligo(dT)引物或隨機引物）、dNTPs、逆轉錄酶和緩沖液等。首先在65℃下孵育5分鐘，使RNA模板變性，然后迅速置于冰上冷卻。接著加入逆轉錄酶，在37℃下孵育60分鐘，進行逆轉錄反應。最后在70℃下孵育15分鐘，使逆轉錄酶失活，得到cDNA產(chǎn)物。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。根據(jù)TaUGGT-B2基因的序列設計特異性引物，引物設計遵循以下原則：引物長度一般為18-25個堿基，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結構的形成，引物的Tm值（解鏈溫度）在58℃-62℃之間。同時，選擇小麥的β-actin基因作為內(nèi)參基因，用于校正和標準化目的基因的表達量。β-actin基因是一種管家基因，在生物體的各種組織和細胞中均穩(wěn)定表達。qRT-PCR反應體系包含cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenI熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶和反應緩沖液。反應程序如下：95℃預變性3分鐘，使模板DNA完全解鏈；然后進行40個循環(huán)的擴增，每個循環(huán)包括95℃變性15秒，使DNA雙鏈解開；60℃退火30秒，引物與模板特異性結合；72℃延伸30秒，TaqDNA聚合酶催化dNTPs合成新的DNA鏈。在擴增結束后，進行熔解曲線分析，以檢測擴增產(chǎn)物的特異性。熔解曲線分析的程序為：95℃15秒，60℃1分鐘，然后從60℃以0.1℃/秒的速度緩慢升溫至95℃，同時連續(xù)監(jiān)測熒光信號的變化。如果擴增產(chǎn)物特異性良好，熔解曲線會呈現(xiàn)單一的峰；如果出現(xiàn)多個峰，則表明存在非特異性擴增產(chǎn)物或引物二聚體。qRT-PCR實驗設置3個生物學重復和3個技術重復，以確保實驗結果的準確性和可靠性。實驗數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析，首先計算出目的基因（TaUGGT-B2）和內(nèi)參基因（β-actin）的Ct值，然后根據(jù)公式△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，計算出△Ct值。再通過公式△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組，計算出△△Ct值。最后根據(jù)公式相對表達量=2-△△CT，計算出目的基因在不同處理組中的相對表達量。通過對不同處理組中TaUGGT-B2基因相對表達量的分析，研究其在非生物脅迫下的表達模式。4.3表達模式分析結果通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對不同非生物脅迫處理下小麥中TaUGGT-B2基因的表達水平進行檢測，得到了其在干旱、鹽堿、高溫和低溫脅迫下的表達模式。在干旱脅迫下，TaUGGT-B2基因的表達水平呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。處理0小時時，TaUGGT-B2基因的表達量相對較低，設定為對照的1倍。隨著干旱脅迫時間的延長，在處理1小時后，基因表達量開始顯著上升，達到對照的2.5倍（P<0.05），這表明TaUGGT-B2基因對干旱脅迫迅速做出響應，表達被誘導上調(diào)。在處理3小時時，表達量進一步升高，達到對照的4倍（P<0.01），此時TaUGGT-B2基因的表達處于較高水平。然而，隨著脅迫時間繼續(xù)延長至6小時，表達量雖仍高于對照，但略有下降，為對照的3倍（P<0.05）。到12小時時，表達量下降較為明顯，降至對照的1.5倍（P<0.05），24小時和48小時時，表達量基本維持在對照水平附近，無顯著差異（P>0.05）。這說明在干旱脅迫初期，TaUGGT-B2基因的表達被強烈誘導，以應對干旱脅迫帶來的傷害；而隨著脅迫時間的延長，小麥可能通過其他生理機制來適應干旱環(huán)境，TaUGGT-B2基因的表達調(diào)控作用逐漸減弱。在鹽堿脅迫下，TaUGGT-B2基因的表達也表現(xiàn)出明顯的變化。處理1小時后，基因表達量開始增加，達到對照的1.8倍（P<0.05），表明TaUGGT-B2基因對鹽堿脅迫產(chǎn)生響應。3小時時，表達量進一步上升至對照的3倍（P<0.01），說明鹽堿脅迫對TaUGGT-B2基因表達的誘導作用在持續(xù)增強。6小時時，表達量達到峰值，為對照的4.5倍（P<0.01），此時TaUGGT-B2基因在鹽堿脅迫下的表達最為強烈。隨后，從12小時開始，表達量逐漸下降，12小時時為對照的3.5倍（P<0.01），24小時時降至對照的2倍（P<0.05），48小時時基本恢復到對照水平（P>0.05）。與干旱脅迫下的表達模式相比，鹽堿脅迫下TaUGGT-B2基因表達量上升和下降的過程相對較為平緩，且表達量達到峰值的時間相對滯后，這可能反映出小麥對鹽堿脅迫的響應機制與干旱脅迫存在一定差異，TaUGGT-B2基因在鹽堿脅迫應答中可能參與了不同的生理過程。高溫脅迫下，TaUGGT-B2基因的表達變化更為迅速。處理0.5小時后，基因表達量就顯著升高，達到對照的3倍（P<0.01），說明TaUGGT-B2基因對高溫脅迫反應十分敏感，能夠快速啟動表達調(diào)控。1小時時，表達量繼續(xù)上升至對照的5倍（P<0.01），2小時時表達量略有下降，但仍維持在較高水平，為對照的4倍（P<0.01）。4小時時，表達量降至對照的2.5倍（P<0.05），6小時和8小時時，表達量基本恢復到對照水平，無顯著差異（P>0.05）。這種快速響應和快速恢復的表達模式表明，TaUGGT-B2基因在小麥應對高溫脅迫的早期階段發(fā)揮著重要作用，可能參與了小麥對高溫脅迫的快速感知和早期防御反應。在低溫脅迫下，TaUGGT-B2基因的表達同樣呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。處理0.5小時后，表達量開始增加，達到對照的1.5倍（P<0.05），1小時時表達量進一步上升至對照的2.5倍（P<0.01），2小時時達到峰值，為對照的3.5倍（P<0.01）。隨后，表達量逐漸下降，4小時時為對照的2倍（P<0.05），6小時和8小時時基本恢復到對照水平（P>0.05）。與其他脅迫相比，低溫脅迫下TaUGGT-B2基因表達量的變化幅度相對較小，這可能暗示TaUGGT-B2基因在小麥應對低溫脅迫中的作用相對較弱，或者小麥在應對低溫脅迫時主要依賴其他基因和生理機制。為了進一步探究TaUGGT-B2基因在小麥不同組織中的表達特異性，對正常生長條件下小麥的根、莖、葉和幼穗組織進行了qRT-PCR檢測。結果顯示，TaUGGT-B2基因在小麥的各個組織中均有表達，但表達水平存在明顯差異。其中，在葉片中的表達量最高，設定為100，在根中的表達量次之，為葉片表達量的60%，在莖中的表達量相對較低，為葉片表達量的30%，在幼穗中的表達量最低，僅為葉片表達量的10%。這種組織特異性表達模式表明TaUGGT-B2基因在小麥不同組織中的功能可能存在差異，在葉片中可能發(fā)揮著更為重要的作用，這可能與葉片作為光合作用的主要器官，在應對非生物脅迫時需要更多的基因參與調(diào)控有關。五、TaUGGT-B2參與非生物脅迫應答的功能驗證5.1過表達與基因沉默載體構建為了深入研究TaUGGT-B2基因在小麥非生物脅迫應答中的功能，本研究構建了TaUGGT-B2基因的過表達載體和基因沉默載體。過表達載體的構建選用了植物表達載體pCAMBIA3301，該載體含有CaMV35S強啟動子，能夠驅動目的基因在植物體內(nèi)高效表達，同時還攜帶潮霉素抗性基因，便于后續(xù)轉化植株的篩選。首先，根據(jù)TaUGGT-B2基因的序列設計引物，在引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，本研究選擇了EcoRI和BamHI兩種限制性內(nèi)切酶。以克隆得到的TaUGGT-B2基因片段為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應程序為：94℃預變性5分鐘；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃延伸10分鐘。擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預期位置出現(xiàn)清晰條帶，大小與TaUGGT-B2基因片段相符。將PCR產(chǎn)物和pCAMBIA3301載體分別用EcoRI和BamHI進行雙酶切。酶切反應體系包含DNA樣品、相應的限制性內(nèi)切酶、酶切緩沖液和BSA（牛血清白蛋白，用于保護酶的活性），37℃水浴酶切3小時。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用凝膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和線性化的載體片段。將回收得到的目的基因片段和載體片段按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉化后的細胞涂布在含有潮霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時，篩選陽性克隆。挑取平板上的單菌落接種到含有潮霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定。PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，使用TaUGGT-B2基因特異性引物進行擴增，若能擴增出與目的基因大小一致的條帶，則初步表明重組質(zhì)粒中含有目的基因。雙酶切鑒定則用EcoRI和BamHI對提取的質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與預期大小相符的目的基因片段和載體片段，則進一步證明重組質(zhì)粒構建成功。經(jīng)過鑒定，成功獲得了TaUGGT-B2基因的過表達載體pCAMBIA3301-TaUGGT-B2。基因沉默載體的構建采用了RNA干擾（RNAi）技術原理。首先，根據(jù)TaUGGT-B2基因的保守序列，利用在線軟件設計了一段長度為200-300bp的干擾片段。然后，通過PCR擴增得到該干擾片段，并在其兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，本研究選用了XbaI和SacI兩種限制性內(nèi)切酶。將擴增得到的干擾片段與RNAi載體pFGC5941進行連接。pFGC5941載體含有CaMV35S啟動子和GUS報告基因，在干擾片段插入后，GUS基因被破壞，便于后續(xù)對重組載體的篩選和鑒定。將干擾片段和pFGC5941載體分別用XbaI和SacI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，用T4DNA連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選陽性克隆，挑取單菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定。PCR鑒定使用針對干擾片段設計的引物，若能擴增出與干擾片段大小一致的條帶，則初步表明重組質(zhì)粒中含有干擾片段。雙酶切鑒定用XbaI和SacI對提取的質(zhì)粒進行酶切，若出現(xiàn)與預期大小相符的干擾片段和載體片段，則證明重組質(zhì)粒構建成功。最終成功構建了TaUGGT-B2基因的RNAi沉默載體pFGC5941-TaUGGT-B2。通過對過表達載體pCAMBIA3301-TaUGGT-B2和基因沉默載體pFGC5941-TaUGGT-B2的構建及鑒定，為后續(xù)深入研究TaUGGT-B2基因在小麥非生物脅迫應答中的功能提供了重要的實驗材料，有助于進一步揭示其作用機制。5.2轉基因小麥植株獲得與鑒定成功構建過表達和基因沉默載體后，需將其導入小麥細胞以獲得轉基因植株，本研究選用基因槍法來轉化小麥幼胚愈傷組織。基因槍法是一種借助于火藥、高壓放電或高壓氣體產(chǎn)生的動力，將吸附了外源DNA的微彈（直徑1μm的金粉或鎢粉）直接射入受體細胞核，并實現(xiàn)外源基因整合到受體細胞基因組中的轉基因方法。該方法不受作物基因型的限制，也不存在組織培養(yǎng)及植株再生方面的困難，在小麥遺傳轉化中應用廣泛。實驗前，先將小麥種子消毒后播種于MS培養(yǎng)基上，待幼苗長至3-4葉期時，取幼胚誘導愈傷組織。將幼胚盾片朝上接種于含有2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的MS誘導培養(yǎng)基上，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)14天，誘導出愈傷組織。挑選生長旺盛、質(zhì)地致密的愈傷組織，轉移至含有2,4-D的MS繼代培養(yǎng)基上，在相同條件下繼代培養(yǎng)7天，以獲得狀態(tài)良好的愈傷組織用于轉化。轉化時，將金粉（直徑1μm）懸浮于無水乙醇中，超聲處理使其分散均勻，然后加入質(zhì)粒DNA（過表達載體pCAMBIA3301-TaUGGT-B2或基因沉默載體pFGC5941-TaUGGT-B2）、氯化鈣和亞精胺，充分混勻，使DNA吸附在金粉表面。將制備好的金粉-DNA復合物加入到基因槍的載樣片中，按照基因槍操作手冊設置參數(shù)，本研究中采用的氦氣壓力為1100psi，可裂膜壓力為1350psi，將金粉-DNA復合物高速射入小麥愈傷組織細胞中。轉化后的愈傷組織在含有2,4-D的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3天，然后轉移至含有潮霉素（過表達載體轉化的愈傷組織）或卡那霉素（基因沉默載體轉化的愈傷組織）的篩選培養(yǎng)基上，在25℃光照條件下篩選培養(yǎng)2-3周，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，以篩選出轉化成功的愈傷組織。將篩選得到的抗性愈傷組織轉移至含有細胞分裂素和生長素的MS分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)，誘導愈傷組織分化成芽。待芽長至2-3cm時，將其轉移至含有生長素的MS生根培養(yǎng)基上，促進根系生長，最終獲得完整的轉基因小麥植株。對獲得的轉基因小麥植株進行分子生物學鑒定，以確定外源基因是否成功整合到小麥基因組中以及是否正常表達。首先，采用CTAB法提取轉基因小麥植株葉片的基因組DNA，以野生型小麥植株DNA作為陰性對照，以重組質(zhì)粒DNA作為陽性對照。使用TaUGGT-B2基因特異性引物進行PCR擴增，反應體系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應程序為：94℃預變性5分鐘；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在轉基因小麥植株中擴增出與陽性對照相同大小的條帶，而陰性對照無條帶，則初步表明外源基因已整合到小麥基因組中。為進一步確定外源基因的整合情況，對PCR陽性植株進行Southernblot分析。將提取的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶（根據(jù)載體上的酶切位點選擇合適的酶，如EcoRI和BamHI）進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過毛細管轉移法將DNA轉移到尼龍膜上。將標記有地高辛（DIG）的TaUGGT-B2基因片段作為探針，與尼龍膜上的DNA進行雜交。雜交后，用堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體進行檢測，通過化學發(fā)光法顯影，觀察雜交條帶。如果在轉基因小麥植株中檢測到特異性雜交條帶，且條帶的數(shù)量和位置與預期相符，則表明外源基因已成功整合到小麥基因組中，且拷貝數(shù)符合預期。除了DNA水平的檢測，還對轉基因小麥植株進行RNA水平的檢測，以確定外源基因是否正常轉錄。采用Trizol試劑法提取轉基因小麥植株葉片的總RNA，反轉錄為cDNA后，以cDNA為模板，使用TaUGGT-B2基因特異性引物進行qRT-PCR擴增。以小麥的β-actin基因作為內(nèi)參基因，實驗設置3個生物學重復和3個技術重復。通過2-△△CT法計算TaUGGT-B2基因的相對表達量，若轉基因小麥植株中TaUGGT-B2基因的表達量顯著高于野生型植株（過表達植株）或顯著低于野生型植株（基因沉默植株），則表明外源基因在RNA水平上正常表達，且過表達或基因沉默效果明顯。除了分子生物學鑒定，還對轉基因小麥植株進行了表型鑒定，觀察其在正常生長條件和非生物脅迫條件下的生長發(fā)育情況。在正常生長條件下，對比轉基因小麥植株和野生型小麥植株的株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)等農(nóng)藝性狀，統(tǒng)計分析相關數(shù)據(jù)，判斷轉基因操作是否對小麥的正常生長發(fā)育產(chǎn)生影響。在非生物脅迫條件下，如干旱、鹽堿、高溫、低溫等脅迫處理，觀察轉基因小麥植株和野生型小麥植株的脅迫響應表型，如葉片萎蔫程度、黃化情況、生長受抑制程度等，評估TaUGGT-B2基因對小麥非生物脅迫耐受性的影響。對小麥葉片的相對含水量、脯氨酸含量、丙二醛含量、抗氧化酶活性等生理指標進行測定，分析轉基因小麥植株和野生型小麥植株在生理水平上的差異，進一步驗證TaUGGT-B2基因在小麥非生物脅迫應答中的功能。5.3轉基因植株非生物脅迫耐受性分析為了深入探究TaUGGT-B2基因在小麥應對非生物脅迫過程中的功能，本研究對獲得的轉基因小麥植株進行了非生物脅迫耐受性分析，分別設置了干旱、鹽堿、高溫和低溫脅迫處理，以野生型小麥植株作為對照，通過比較轉基因植株和野生型植株在脅迫條件下的生長狀況和生理指標變化，來評估TaUGGT-B2基因對小麥非生物脅迫耐受性的影響。在干旱脅迫實驗中，將生長狀況一致的轉基因小麥植株（TaUGGT-B2過表達植株和基因沉默植株）和野生型小麥植株同時進行干旱處理，采用自然干旱的方式，停止?jié)菜?，持續(xù)14天。在處理期間，定期觀察植株的生長狀態(tài)，并測量相關生理指標。結果顯示，隨著干旱脅迫時間的延長，野生型小麥植株葉片逐漸出現(xiàn)萎蔫、發(fā)黃的現(xiàn)象，在脅迫第7天時，葉片相對含水量顯著下降，降至初始值的60%（P<0.05），到第14天時，葉片相對含水量僅為初始值的35%（P<0.01），植株生長受到明顯抑制，株高生長停滯，分蘗數(shù)減少。而TaUGGT-B2過表達植株在干旱脅迫下的表現(xiàn)明顯優(yōu)于野生型植株，在脅迫第7天時，葉片相對含水量仍保持在初始值的80%（P<0.05），到第14天時，雖有所下降，但仍維持在初始值的50%（P<0.01），葉片萎蔫和發(fā)黃程度較輕，株高和分蘗數(shù)受影響較小，表現(xiàn)出較強的抗旱性。相反，TaUGGT-B2基因沉默植株對干旱脅迫更為敏感，在脅迫第7天時，葉片相對含水量就降至初始值的45%（P<0.05），第14天時，僅為初始值的20%（P<0.01），葉片嚴重萎蔫，植株生長幾乎停滯，抗旱能力明顯低于野生型植株。對干旱脅迫下小麥植株的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量進行測定，發(fā)現(xiàn)野生型小麥植株在干旱脅迫下脯氨酸含量顯著增加，在脅迫第7天時，脯氨酸含量比對照增加了3倍（P<0.05），到第14天時，增加了5倍（P<0.01）；可溶性糖含量也有所上升，在脅迫第7天時，比對照增加了1.5倍（P<0.05），第14天時，增加了2倍（P<0.01）。TaUGGT-B2過表達植株在干旱脅迫下脯氨酸和可溶性糖的積累量更高，在脅迫第7天時，脯氨酸含量比對照增加了5倍（P<0.05），可溶性糖含量增加了2倍（P<0.05）；第14天時，脯氨酸含量增加了8倍（P<0.01），可溶性糖含量增加了3倍（P<0.01），表明過表達TaUGGT-B2基因能夠促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，增強小麥的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高其抗旱性。而TaUGGT-B2基因沉默植株在干旱脅迫下脯氨酸和可溶性糖的積累量顯著低于野生型植株，在脅迫第7天時，脯氨酸含量僅比對照增加了1.5倍（P<0.05），可溶性糖含量增加了0.8倍（P<0.05）；第14天時，脯氨酸含量增加了2倍（P<0.01），可溶性糖含量增加了1.2倍（P<0.01），滲透調(diào)節(jié)能力較弱，無法有效抵御干旱脅迫的傷害。在鹽堿脅迫實驗中，采用澆灌150mMNaCl和50mMNa?CO?混合溶液的方式對轉基因小麥植株和野生型小麥植株進行處理，持續(xù)10天。觀察發(fā)現(xiàn)，野生型小麥植株在鹽堿脅迫下生長受到明顯抑制，葉片出現(xiàn)黃化、卷曲現(xiàn)象，在脅迫第5天時，葉片相對電導率顯著升高，達到初始值的1.8倍（P<0.05），到第10天時，相對電導率為初始值的2.5倍（P<0.01），表明細胞膜受到嚴重損傷，細胞內(nèi)物質(zhì)外滲。而TaUGGT-B2過表達植株在鹽堿脅迫下葉片黃化和卷曲程度較輕，在脅迫第5天時，葉片相對電導率為初始值的1.3倍（P<0.05），第10天時，相對電導率為初始值的1.8倍（P<0.01），細胞膜損傷程度較輕，表現(xiàn)出較強的耐鹽堿性。TaUGGT-B2基因沉默植株對鹽堿脅迫更為敏感，在脅迫第5天時，葉片相對電導率就達到初始值的2.2倍（P<0.05），第10天時，相對電導率為初始值的3倍（P<0.01），細胞膜受損嚴重，植株生長受到極大抑制，耐鹽堿性明顯低于野生型植株。對鹽堿脅迫下小麥植株的離子含量進行測定，發(fā)現(xiàn)野生型小麥植株在鹽堿脅迫下，根系和葉片中的鈉離子（Na?）含量顯著增加，鉀離子（K?）含量相對下降，導致Na?/K?比值升高。在脅迫第5天時，根系中Na?含量比對照增加了3倍（P<0.05），K?含量下降了20%（P<0.05），Na?/K?比值為對照的4倍（P<0.05）；葉片中Na?含量增加了4倍（P<0.05），K?含量下降了30%（P<0.05），Na?/K?比值為對照的5倍（P<0.05）。到第10天時，根系中Na?含量比對照增加了5倍（P<0.01），K?含量下降了35%（P<0.01），Na?/K?比值為對照的6倍（P<0.01）；葉片中Na?含量增加了6倍（P<0.01），K?含量下降了40%（P<0.01），Na?/K?比值為對照的7倍（P<0.01）。TaUGGT-B2過表達植株在鹽堿脅迫下，根系和葉片中的Na?含量增加幅度較小，K?含量下降幅度也較小，Na?/K?比值升高幅度相對較小。在脅迫第5天時，根系中Na?含量比對照增加了1.5倍（P<0.05），K?含量下降了10%（P<0.05），Na?/K?比值為對照的2倍（P<0.05）；葉片中Na?含量增加了2倍（P<0.05），K?含量下降了15%（P<0.05），Na?/K?比值為對照的3倍（P<0.05）。第10天時，根系中Na?含量比對照增加了2.5倍（P<0.01），K?含量下降了20%（P<0.01），Na?/K?比值為對照的3.5倍（P<0.01）；葉片中Na?含量增加了3倍（P<0.01），K?含量下降了25%（P<0.01），Na?/K?比值為對照的4倍（P<0.01），表明過表達TaUGGT-B2基因能夠有效調(diào)節(jié)離子平衡，減輕鹽堿離子對小麥植株的毒害作用，提高其耐鹽堿性。而TaUGGT-B2基因沉默植株在鹽堿脅迫下，根系和葉片中的Na?含量增加幅度較大，K?含量下降幅度也較大，Na?/K?比值升高幅度明顯高于野生型植株。在脅迫第5天時，根系中Na?含量比對照增加了4倍（P<0.05），K?含量下降了30%（P<0.05），Na?/K?比值為對照的5倍（P<0.05）；葉片中Na?含量增加了5倍（P<0.05），K?含量下降了40%（P<0.05），Na?/K?比值為對照的6倍（P<0.05）。第10天時，根系中Na?含量比對照增加了6倍（P<0.01），K?含量下降了50%（P<0.01），Na?/K?比值為對照的8倍（P<0.01）；葉片中Na?含量增加了7倍（P<0.01），K?含量下降了60%（P<0.01），Na?/K?比值為對照的9倍（P<0.01），離子平衡失調(diào)嚴重，無法有效抵御鹽堿脅迫的傷害。在高溫脅迫實驗中，將轉基因小麥植株和野生型小麥植株置于40℃的光照培養(yǎng)箱中處理8小時。觀察發(fā)現(xiàn)，野生型小麥植株在高溫脅迫下，葉片出現(xiàn)卷曲、干枯現(xiàn)象，在處理第4小時時，葉片相對含水量顯著下降，降至初始值的70%（P<0.05），到第8小時時，葉片相對含水量僅為初始值的50%（P<0.01），光合速率也明顯下降，在處理第4小時時，光合速率比對照降低了40%（P<0.05），第8小時時，降低了60%（P<0.01）。而TaUGGT-B2過表達植株在高溫脅迫下葉片卷曲和干枯程度較輕，在處理第4小時時，葉片相對含水量仍保持在初始值的85%（P<0.05），第8小時時，葉片相對含水量為初始值的65%（P<0.01），光合速率下降幅度較小，在處理第4小時時，光合速率比對照降低了25%（P<0.05），第8小時時，降低了40%（P<0.01），表現(xiàn)出較強的耐高溫性。TaUGGT-B2基因沉默植株對高溫脅迫更為敏感，在處理第4小時時，葉片相對含水量就降至初始值的55%（P<0.05），第8小時時，葉片相對含水量僅為初始值的35%（P<0.01），光合速率下降幅度較大，在處理第4小時時，光合速率比對照降低了55%（P<0.05），第8小時時，降低了75%（P<0.01），耐高溫能力明顯低于野生型植株。對高溫脅迫下小麥植株的抗氧化酶活性進行測定，發(fā)現(xiàn)野生型小麥植株在高溫脅迫下，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性顯著升高，在處理第4小時時，SOD活性比對照增加了2倍（P<0.05），POD活性增加了1.5倍（P<0.05），CAT活性增加了1倍（P<0.05）；到第8小時時，SOD活性增加了3倍（P<0.01），POD活性增加了2倍（P<0.01），CAT活性增加了1.5倍（P<0.01），以清除體內(nèi)積累的活性氧（ROS），減輕氧化損傷。TaUGGT-B2過表達植株在高溫脅迫下，抗氧化酶活性升高幅度更大，在處理第4小時時，SOD活性比對照增加了3倍（P<0.05），POD活性增加了2倍（P<0.05），CAT活性增加了1.5倍（P<0.05）；第8小時時，SOD活性增加了4倍（P<0.01），POD活性增加了3倍（P<0.01），CAT活性增加了2倍（P<0.01），能夠更有效地清除ROS，保護細胞免受氧化損傷，提高小麥的耐高溫性。而TaUGGT-B2基因沉默植株在高溫脅迫下，抗氧化酶活性升高幅度較小，在處理第4小時時，SOD活性比對照增加了1倍（P<0.05），POD活性增加了0.8倍（P<0.05），CAT活性增加了0.5倍（P<0.05）；第8小時時，SOD活性增加了1.5倍（P<0.01），POD活性增加了1.2倍（P<0.01），CAT活性增加了0.8倍（P<0.01），抗氧化能力較弱，無法有效抵御高溫脅迫引起的氧化損傷。在低溫脅迫實驗中，將轉基因小麥植株和野生型小麥植株置于4℃的光照培養(yǎng)箱中處理12小時。觀察發(fā)現(xiàn)，野生型小麥植株在低溫脅迫下，葉片出現(xiàn)發(fā)紫、凍傷現(xiàn)象，在處理第6小時時，葉片相對電導率顯著升高，達到初始值的1.6倍（P<0.05），到第12小時時，相對電導率為初始值的2.2倍（P<0.01），表明細胞膜受到損傷。而TaUGGT-B2過表達植株在低溫脅迫下葉片發(fā)紫和凍傷程度較輕，在處理第6小時時，葉片相對電導率為初始值的1.2倍（P<0.05），第12小時時，相對電導率為初始值的1.6倍（P<0.01），細胞膜損傷程度較輕，表現(xiàn)出較強的耐低溫性。TaUGGT-B2基因沉默植株對低溫脅迫更為敏感，在處理第6小時時，葉片相對電導率就達到初始值的2倍（P<0.05），第12小時時，相對電導率為初始值的2.8倍（P<0.01），細胞膜受損嚴重，植株生長受到極大抑制，耐低溫性明顯低于野生型植株。對低溫脅迫下小麥植株的抗凍蛋白含量進行測定，發(fā)現(xiàn)野生型小麥植株在低溫脅迫下，抗凍蛋白含量顯著增加，在處理第6小時時，抗凍蛋白含量比對照增加了2倍（P<0.05），到第12小時時，增加了3倍（P<0.01）。TaUGGT-B2過表達植株在低溫脅迫下抗凍蛋白的積累量更高，在處理第6小時時，抗凍蛋白含量比對照增加了3倍（P<0.05），第12小時時，增加了4倍（P<0.01），表明過表達TaUGGT-B2基因能夠促進抗凍蛋白的積累，增強小麥的抗凍能力，從而提高其耐低溫性。而TaUGGT-B2基因沉默植株在低溫脅迫下抗凍蛋白的積累量顯著低于野生型植株，在處理第6小時時，抗凍蛋白含量僅比對照增加了1倍（P<0.05），第12小時時，增加了1.5倍（P<0.01），抗凍能力較弱，無法有效抵御低溫脅迫的傷害。通過對轉基因小麥植株在干旱、鹽堿、高溫和低溫脅迫下的耐受性分析，結果表明，過表達TaUGGT-B2基因能夠顯著增強小麥對非生物脅迫的耐受性，表現(xiàn)為在脅迫條件下生長狀況良好，相關生理指標變化較小，能夠有效維持細胞的正常生理功能；而基因沉默TaUGGT-B2基因則使小麥對非生物脅迫更為敏感，生長受到明顯抑制，生理指標變化較大，細胞損傷嚴重。這些結果充分證明了TaUGGT-B2基因在小麥非生物脅迫應答中發(fā)揮著重要作用，為進一步深入研究其作用機制奠定了堅實的基礎。六、TaUGGT-B2參與非生物脅迫應答的分子機制6.1與信號通路關鍵分子的互作為了深入探究TaUGGT-B2參與小麥非生物脅迫應答的分子機制，本研究運用酵母雙雜交技術，探尋與TaUGGT-B2相互作用的信號通路關鍵分子，從分子層面揭示其作用的內(nèi)在機制。在進行酵母雙雜交實驗前，首先構建了TaUGGT-B2基因的誘餌載體。將TaUGGT-B2基因與pGBKT7載體連接，構建重組質(zhì)粒pGBKT7-TaUGGT-B2，該載體含有GAL4DNA結合域（BD），可使TaUGGT-B2蛋白與BD融合表達。同時，構建了小麥cD