小鼠BTLA慢病毒載體構(gòu)建及其于結(jié)腸癌細胞的表達與鑒定研究

小鼠BTLA慢病毒載體構(gòu)建及其于結(jié)腸癌細胞的表達與鑒定研究一、引言1.1研究背景與意義B、T淋巴細胞弱化因子（BandTlymphocyteattenuator，BTLA）作為CD28家族的共抑制受體，在免疫系統(tǒng)中扮演著舉足輕重的角色。2003年，華盛頓大學醫(yī)學院免疫生物學KennethMurphy教授首次克隆發(fā)現(xiàn)BTLA，此后對其研究不斷深入。BTLA主要表達于T細胞、B細胞和NK細胞等免疫細胞表面，在活化的腫瘤特異性T細胞上，BTLA還會與PD-1共表達。從分子功能結(jié)構(gòu)來看，BTLA與PD-1和CTLA-4相近且同源，同屬免疫球蛋白受體家族。其獨特的結(jié)構(gòu)包含細胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）以及免疫受體基于酪氨酸的開關(guān)基序（ITSM）。當BTLA與配體皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM）結(jié)合后，BTLA信號轉(zhuǎn)導通路被激活，ITIMs發(fā)生磷酸化，進而與含有SH2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶1（SHP-1）/SHP-2結(jié)合，最終抑制T細胞增殖和細胞因子的產(chǎn)生，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的負向調(diào)節(jié)作用。在免疫穩(wěn)態(tài)的維持中，BTLA發(fā)揮著不可或缺的作用。健康人中，外周血的幼稚CD4+和TCD8+T細胞具有較高的BTLA表達。在CD4+分化期間，BTLA的表達持續(xù)保持在較高水平；而在CD8+T細胞分化期間，BTLA的表達則會下調(diào)，γδ-T細胞也呈現(xiàn)類似規(guī)律，靜止的Vγ9Vδ2細胞高表達BTLA，分化過程中表達下調(diào)。體外實驗表明，BTLA阻斷能夠增強CD8+T細胞增殖，并且BTLA陽性DC細胞參與外周Treg誘導，這些都充分凸顯了BTLA在免疫穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵意義。然而，一旦BTLA調(diào)控出現(xiàn)異常，機體就容易受到多種疾病的侵襲，自身免疫性疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展都與BTLA的異常調(diào)控緊密相關(guān)。腫瘤疾病嚴重威脅人類健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新發(fā)癌癥病例1929萬例，死亡病例996萬例。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，BTLA與HVEM的相互作用尤為關(guān)鍵。腫瘤細胞常常通過上調(diào)HVEM的表達，與BTLA結(jié)合，抑制T細胞的功能，從而實現(xiàn)免疫逃逸。研究表明，HVEM在多種腫瘤如非小細胞肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌和淋巴瘤中均有表達上調(diào)的現(xiàn)象，并且其高表達與腫瘤的不良預后密切相關(guān)。例如在一項對136例胃癌活檢的研究中，HVEM表達增加與疾病進展和總體生存率降低顯著相關(guān)；在膠質(zhì)母細胞瘤研究中，通過對34個膠質(zhì)瘤組織進行免疫組化（IHC）評估，發(fā)現(xiàn)HVEM表達定位于周圍壞死區(qū)域和微血管增生區(qū)域，轉(zhuǎn)錄組學分析也表明HVEM表達與免疫細胞浸潤和微環(huán)境中的基質(zhì)細胞有關(guān)，且與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3和VISTA的表達相關(guān)。BTLA在腫瘤組織中的表達也顯著高于正常組織，并且高表達的BTLA與高表達的HVEM呈正相關(guān)，同時影響患者預后。低BTLA表達組的5年總生存率（OS）可達48.3%，而當BTLA高表達時，5年總生存率則下降到17.9%，較高的BTLA表達還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在晚期黑色素瘤中，42%的NY-ESO-1特異性CD8+T淋巴細胞共同表達BTLA和PD-1，這些細胞呈現(xiàn)部分功能失調(diào)表型?？笲TLA抗體阻斷BTLA后，可增強NY-ESO-1特異性CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNFα和IL-2，并且當抗BTLA與抗PD-1聯(lián)合使用時，在功能分析中能夠觀察到協(xié)同效應。在肺癌研究中，皮下肺腫瘤植入的小鼠模型顯示，CD4+和CD8+T細胞上的BTLA以及其他共同抑制標記物如PD-1和2B4表達增加。對非小細胞肺癌（NSCLC）活檢中的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）進行詳細免疫分型發(fā)現(xiàn)，晚期腫瘤浸潤性CD8+T細胞亞群中PD-1和Tim-3表達增加，BTLA陽性細胞百分比雖低，但變化模式與PD-1和TIM-3一致，且BTLA+CD8+T細胞也高度表達其他共抑制受體，表明BTLA在T細胞耗竭后期上調(diào)。目前，針對BTLA的研究為腫瘤免疫治療開辟了新的方向。君實生物自主研發(fā)的抗BTLA單抗icatolimab（TAB004/JS004）已進入臨床階段，在2022年美國臨床腫瘤學會（ASCO）年會上首次展示了用于淋巴瘤與實體瘤治療的早期臨床成果。在一項單臂、開放標簽、多中心、劑量遞增I期研究（NCT04477772）中，icatolimab單藥或聯(lián)合特瑞普利單抗治療復發(fā)或難治性（R/R）淋巴瘤患者表現(xiàn)出良好的耐受性和初步臨床療效；在另一項I期研究（NCT04137900）中，icatolimab單藥治療晚期實體瘤也顯示出良好的耐受性和初步臨床療效。在這樣的研究背景下，構(gòu)建小鼠BTLA慢病毒載體并深入研究其在結(jié)腸癌細胞中的表達具有極其重要的意義。慢病毒載體是以HIV-1為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，具有可感染非分裂細胞、目的基因整合至靶細胞基因組長期表達、感染率高、免疫反應小等優(yōu)點。通過構(gòu)建小鼠BTLA慢病毒載體，能夠?qū)TLA基因高效導入結(jié)腸癌細胞，穩(wěn)定表達BTLA，為進一步探究BTLA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供有力工具。這不僅有助于深入理解腫瘤免疫逃逸的分子機制，還可能為結(jié)腸癌的免疫治療提供新的靶點和策略，為開發(fā)更有效的治療方法奠定基礎(chǔ)，從而在腫瘤治療領(lǐng)域具有廣闊的應用前景和潛在的臨床價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀自2003年BTLA被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外學者圍繞其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制展開了廣泛而深入的研究。國外方面，華盛頓大學醫(yī)學院免疫生物學KennethMurphy教授團隊首次克隆發(fā)現(xiàn)BTLA，此后眾多研究聚焦于BTLA的生物學功能。在腫瘤研究領(lǐng)域，國外學者通過大量實驗揭示了BTLA與腫瘤免疫逃逸的密切關(guān)系。例如，對多種腫瘤組織的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞高表達HVEM，與免疫細胞表面的BTLA結(jié)合，抑制T細胞功能，從而使腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。在黑色素瘤研究中，發(fā)現(xiàn)42%的NY-ESO-1特異性CD8+T淋巴細胞共同表達BTLA和PD-1，呈現(xiàn)部分功能失調(diào)表型，抗BTLA抗體阻斷BTLA后，可增強NY-ESO-1特異性CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNFα和IL-2，當抗BTLA與抗PD-1聯(lián)合使用時，觀察到協(xié)同效應。在肺癌研究中，皮下肺腫瘤植入的小鼠模型顯示CD4+和CD8+T細胞上的BTLA以及其他共同抑制標記物表達增加。對非小細胞肺癌活檢中的腫瘤浸潤淋巴細胞進行詳細免疫分型發(fā)現(xiàn)，晚期腫瘤浸潤性CD8+T細胞亞群中PD-1和Tim-3表達增加，BTLA陽性細胞百分比雖低，但變化模式與PD-1和TIM-3一致，且BTLA+CD8+T細胞也高度表達其他共抑制受體，表明BTLA在T細胞耗竭后期上調(diào)。國內(nèi)研究也取得了顯著進展。君實生物自主研發(fā)的抗BTLA單抗icatolimab（TAB004/JS004）已進入臨床階段，在2022年美國臨床腫瘤學會年會上首次展示了用于淋巴瘤與實體瘤治療的早期臨床成果。在一項單臂、開放標簽、多中心、劑量遞增I期研究中，icatolimab單藥或聯(lián)合特瑞普利單抗治療復發(fā)或難治性淋巴瘤患者表現(xiàn)出良好的耐受性和初步臨床療效；在另一項I期研究中，icatolimab單藥治療晚期實體瘤也顯示出良好的耐受性和初步臨床療效。在慢病毒載體構(gòu)建及應用于癌細胞研究方面，國外學者對慢病毒載體的優(yōu)化和改造進行了大量探索。通過對病毒基因結(jié)構(gòu)的調(diào)整，如開發(fā)自我滅活的慢病毒載體（SIN），降低了插入突變的風險，提高了載體的安全性。利用慢病毒載體轉(zhuǎn)導免疫細胞和腫瘤細胞，開展癌癥免疫基因療法的研究，取得了一定的成果。國內(nèi)研究人員在慢病毒載體構(gòu)建技術(shù)上不斷創(chuàng)新，提高了載體的滴度和穩(wěn)定性。在腫瘤治療研究中，運用慢病毒載體將目的基因?qū)肽[瘤細胞，探索基因治療的新方法。然而，當前研究仍存在一些不足之處。在BTLA與腫瘤關(guān)系的研究中，雖然明確了BTLA在腫瘤免疫逃逸中的作用，但BTLA在不同腫瘤微環(huán)境中的具體調(diào)控機制仍有待深入探究，BTLA與其他免疫檢查點分子之間的協(xié)同作用機制也尚未完全闡明。在慢病毒載體應用于癌細胞研究方面，雖然取得了一定進展，但載體的靶向性和轉(zhuǎn)導效率仍需進一步提高，以減少對正常細胞的影響，提高治療效果。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在構(gòu)建小鼠BTLA慢病毒載體，并實現(xiàn)其在結(jié)腸癌細胞中的穩(wěn)定表達與準確鑒定，為深入探究BTLA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定堅實基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：小鼠BTLA基因的獲取與克?。阂詐ET-28a-mBTLA質(zhì)粒為模板，通過高保真PCR技術(shù)擴增小鼠BTLA全長片段。將擴增得到的片段進行酶切處理后，連接至pMD18-T克隆載體。隨后對重組質(zhì)粒進行基因測序，確保插入序列與Genebank中登錄序列完全一致，從而成功獲取正確的小鼠BTLA基因克隆。慢病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建：使用XhoI和XbaI對pMD18-T-mBTLA和慢病毒骨架專用質(zhì)粒pSL6進行雙酶切。酶切后的片段經(jīng)膠回收純化后，利用DNA連接酶進行連接，構(gòu)建pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體。將該轉(zhuǎn)移載體與pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV三個包裝載體共同轉(zhuǎn)染293T細胞，借助細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯機制，包裝產(chǎn)生表達小鼠BTLA的慢病毒Lenti-mBTLA。同時，以pSL6為轉(zhuǎn)移載體，按照相同流程獲得表達綠色熒光蛋白的對照慢病毒Lenti-EGFP。重組慢病毒的鑒定與滴度測定：通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后293T細胞中GFP蛋白的表達情況，初步判斷慢病毒的感染效率。采用TCID50法（50％組織培養(yǎng)感染劑量法）測定慢病毒滴度，該方法通過將慢病毒進行梯度稀釋后感染細胞，統(tǒng)計不同稀釋度下細胞的感染情況，從而計算出慢病毒的滴度，為后續(xù)實驗提供準確的病毒濃度數(shù)據(jù)。結(jié)腸癌細胞的感染與陽性細胞篩選：將構(gòu)建好的Lenti-mBTLA慢病毒感染小鼠結(jié)腸癌CT26細胞。感染后的細胞經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，利用RT-PCR和WesternBlotting技術(shù)對小鼠BTLA的表達進行鑒定，檢測細胞中是否成功表達BTLAmRNA和蛋白質(zhì)。進一步通過流式分選技術(shù)，根據(jù)細胞表面標志物或熒光信號強度，篩選出高表達BTLA的結(jié)腸癌細胞株CT26-BTLA。細胞表型分析：對篩選得到的CT26-BTLA細胞株進行形態(tài)學觀察，借助顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、大小、形狀等特征變化。采用流式細胞術(shù)檢測BTLA過表達對CT26細胞周期和凋亡的影響，通過分析細胞周期各階段的比例以及凋亡細胞的數(shù)量，深入探究BTLA在結(jié)腸癌細胞生物學行為中的作用。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞株與載體人胚腎293T細胞、小鼠結(jié)腸癌細胞株CT26均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。293T細胞具有易于轉(zhuǎn)染、生長迅速等優(yōu)點，常被用于病毒包裝。小鼠結(jié)腸癌細胞株CT26則是研究結(jié)腸癌相關(guān)機制的常用細胞模型。慢病毒載體pSL6（即pRRL-cPPT-CMV-X-PRE-SIN質(zhì)粒，其中X代表酶切插入位點）由本實驗室保存，該載體具有可感染非分裂細胞、目的基因整合至靶細胞基因組長期表達等優(yōu)勢。輔助包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV購自Addgene公司，這些質(zhì)粒在慢病毒包裝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，pCMV-VSVG編碼水皰性口炎病毒G蛋白（VSV-G），可使病毒具有廣泛的宿主范圍；pMDLg/pRRE提供病毒包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白；pRSV-REV則參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復制過程。pET-28a-mBTLA質(zhì)粒由本實驗室前期構(gòu)建保存，其中包含小鼠BTLA基因，為后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建提供了模板。pMD18-T克隆載體購自TaKaRa公司，該載體常用于PCR產(chǎn)物的克隆，具有操作簡便、克隆效率高等特點。2.1.2主要試劑與儀器高保真PrimeSTARHSDNAPolymerase、限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI、T4DNA連接酶、DNAMarker、DL2000DNAMarker均購自TaKaRa公司。高保真PrimeSTARHSDNAPolymerase具有高保真度和擴增效率，能夠準確擴增小鼠BTLA基因。限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI用于切割質(zhì)粒，以便進行基因克隆和載體構(gòu)建。T4DNA連接酶則用于連接目的基因和載體。DNAMarker和DL2000DNAMarker用于電泳時判斷DNA片段的大小。質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，這些試劑盒能夠高效地提取和回收質(zhì)粒及DNA片段，保證實驗的順利進行。Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，是一種常用的高效轉(zhuǎn)染試劑，可將質(zhì)粒等核酸物質(zhì)導入細胞。RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，用于細胞的培養(yǎng)，為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司，用于測定蛋白質(zhì)濃度，以便進行后續(xù)的WesternBlotting實驗。鼠抗小鼠BTLA單克隆抗體購自Abcam公司，作為檢測小鼠BTLA蛋白表達的一抗，具有高特異性和親和力。HRP標記的羊抗鼠IgG二抗購自JacksonImmunoResearch公司，與一抗結(jié)合后，可通過化學發(fā)光法檢測目的蛋白。PCR儀（型號：AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler）購自ThermoFisherScientific公司，用于進行PCR擴增反應。高速冷凍離心機（型號：Eppendorf5424R）購自Eppendorf公司，可用于細胞離心、質(zhì)粒提取等操作。恒溫培養(yǎng)箱（型號：ThermoScientificHeracell150i）購自ThermoFisherScientific公司，為細胞培養(yǎng)提供適宜的溫度和濕度環(huán)境。倒置熒光顯微鏡（型號：NikonEclipseTi-U）購自Nikon公司，用于觀察細胞形態(tài)和熒光表達情況。凝膠成像系統(tǒng)（型號：Bio-RadGelDocXR+）購自Bio-Rad公司，用于檢測DNA和蛋白質(zhì)電泳結(jié)果。流式細胞儀（型號：BDFACSCalibur）購自BD公司，用于細胞周期和凋亡分析等。2.2實驗方法2.2.1小鼠BTLA基因獲取從-80℃冰箱取出保存的pET-28a-mBTLA質(zhì)粒，置于冰上融化。以該質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲取小鼠BTLA基因。根據(jù)Genebank中登錄的小鼠BTLA基因序列（登錄號：NM_021275.3），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。上游引物5'-CCGCTCGAGATGGGGCTGCTGGTGAAG-3'，引入XhoI酶切位點（下劃線部分）；下游引物5'-GCTCTAGATTACTTGTAGTTCACACATGCTGG-3'，引入XbaI酶切位點（下劃線部分）。PCR反應體系總體積為50μL，包含5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture（各2.5mM）4μL，上下游引物（10μM）各2μL，pET-28a-mBTLA質(zhì)粒模板1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，ddH?O補足至50μL。將上述反應體系充分混勻后，短暫離心，置于PCR儀中進行擴增。PCR反應條件為：98℃預變性3min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物與6×LoadingBuffer按5:1的比例混合，加入到含EB的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時加入DL2000DNAMarker作為分子量標準。在120V電壓下電泳30min，電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。若在約1000bp處出現(xiàn)明亮條帶，與預期的小鼠BTLA基因片段大小相符，則表明PCR擴增成功。2.2.2慢病毒載體構(gòu)建將PCR擴增得到的小鼠BTLA基因片段和pMD18-T克隆載體進行雙酶切。取10μLPCR產(chǎn)物、1μgpMD18-T載體、10×BufferK2μL、XhoI和XbaI各1μL，加ddH?O補足至20μL，37℃酶切3h。酶切結(jié)束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒回收目的片段和載體片段。按照試劑盒說明書操作，將含有目的片段和載體片段的凝膠切下，放入離心管中，加入適量溶膠液，55℃水浴至凝膠完全溶化。將溶化后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體。加入漂洗液洗滌吸附柱，12000rpm離心1min，重復洗滌兩次。最后加入適量洗脫緩沖液，12000rpm離心1min，收集洗脫液，即為回收的目的片段和載體片段。將回收的小鼠BTLA基因片段與pMD18-T載體進行連接。連接體系為10μL，包含回收的目的片段5μL、pMD18-T載體1μL、SolutionI4μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。從-80℃冰箱取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上融化。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻2min。加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液5000rpm離心5min，棄去部分上清，留約100μL菌液重懸菌體，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。次日，挑取平板上的單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h。利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，具體步驟按照試劑盒說明書進行。提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切體系和條件同上述雙酶切步驟。酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，若在約1000bp處出現(xiàn)目的條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序，測序結(jié)果與Genebank中登錄序列比對，完全一致則確定小鼠BTLA基因成功克隆至pMD18-T載體。將測序正確的pMD18-T-mBTLA質(zhì)粒和慢病毒骨架專用質(zhì)粒pSL6進行雙酶切，酶切體系和條件同上述雙酶切步驟。酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收目的片段和pSL6載體片段。將回收的目的片段與pSL6載體片段進行連接，連接體系和條件同上述連接步驟。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化步驟同上述轉(zhuǎn)化步驟。挑取單菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，若在約1000bp處出現(xiàn)目的條帶，表明pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。2.2.3慢病毒包裝與滴度測定將293T細胞接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%-80%時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作，將pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體與pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV三個包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染前2h，將細胞培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基。取適量pSL6-mBTLA、pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV質(zhì)粒分別與Lipofectamine2000脂質(zhì)體混合，室溫孵育5min。將混合后的質(zhì)粒與脂質(zhì)體溶液輕輕混勻，室溫孵育20min。將混合液逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。收集細胞上清液，4℃、3000rpm離心10min，去除細胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用0.45μm濾器過濾，得到慢病毒上清液。采用TCID50法測定慢病毒滴度。將293T細胞接種于96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，細胞密度為5×10?個/mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將慢病毒上清液進行10倍梯度稀釋，從10?1到10?1?。每個稀釋度接種8孔，每孔加入100μL稀釋后的病毒液，同時設(shè)置正常細胞對照孔。培養(yǎng)72h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，記錄每孔細胞的感染情況。按照Reed-Muench公式計算病毒滴度，公式為：lgTCID50=Xm-d（ΣP-0.5），其中Xm為最高稀釋度的對數(shù)值，d為稀釋度對數(shù)之間的差值，ΣP為陽性孔率總和。2.2.4結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將小鼠結(jié)腸癌細胞株CT26從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，并不時搖動，使其盡快解凍。將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入5mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入適量培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代。棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。加入1-2mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，加入5mL以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使其完全脫落后吸出，1000rpm離心8-10min，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細胞，按1:2到1:5的比例分到新的培養(yǎng)瓶中。取生長狀態(tài)良好的CT26細胞接種于24孔板中，每孔加入500μL細胞懸液，細胞密度為2×10?個/mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將構(gòu)建好的Lenti-mBTLA慢病毒按照不同的MOI值（感染復數(shù)）加入到24孔板中，同時設(shè)置對照組（加入等量的PBS）。感染6h后，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。2.2.5表達鑒定方法采用RT-PCR鑒定BTLA在結(jié)腸癌細胞中的mRNA表達水平。收集感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞和未感染的CT26細胞，利用TRIzol試劑提取細胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，引物序列為：上游引物5'-CCGCTCGAGATGGGGCTGCTGGTGAAG-3'，下游引物5'-GCTCTAGATTACTTGTAGTTCACACATGCTGG-3'。PCR反應體系總體積為25μL，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O補足至25μL。PCR反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。利用Westernblot鑒定BTLA在結(jié)腸癌細胞中的蛋白表達水平。收集細胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間不時振蕩。4℃、12000rpm離心15min，取上清液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品與5×LoadingBuffer按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入鼠抗小鼠BTLA單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。利用化學發(fā)光法顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。通過免疫熒光染色鑒定BTLA在結(jié)腸癌細胞中的表達及定位。將感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24-48h。取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5min。4%多聚甲醛固定細胞15min，PBS洗滌3次，每次5min。0.1%TritonX-100破膜10min，PBS洗滌3次，每次5min。5%BSA封閉30min，然后加入鼠抗小鼠BTLA單克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，每次5min。加入FITC標記的羊抗鼠IgG二抗（1:200稀釋），室溫避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min。DAPI染核5min，PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片置于載玻片上，滴加適量抗熒光淬滅封片劑，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。2.2.6細胞功能檢測采用CCK-8法檢測表達BTLA的結(jié)腸癌細胞生長能力。將感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞和未感染的CT26細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h和96h時，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。在酶標儀上測定450nm處的吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線。利用Transwell小室檢測表達BTLA的結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲能力。遷移實驗：將Transwell小室放入24孔板中，上室加入200μL無血清培養(yǎng)基，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。取1×10?個感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞和未感染的CT26細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸后加入上室。培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。4%多聚甲醛固定下室遷移的細胞15min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，用PBS洗滌3次，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移的細胞數(shù)量。侵襲實驗：在Transwell小室的上室預先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，置于37℃孵箱中3-4h使其凝固。其余步驟同遷移實驗，最后計數(shù)侵襲的細胞數(shù)量。三、實驗結(jié)果3.1慢病毒載體構(gòu)建結(jié)果通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢僮鳎晒?gòu)建了小鼠BTLA慢病毒載體。首先，以pET-28a-mBTLA質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1000bp處出現(xiàn)明亮條帶，與預期的小鼠BTLA基因片段大小相符，表明PCR擴增成功（圖1）。隨后，將擴增得到的小鼠BTLA基因片段與pMD18-T克隆載體進行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在約1000bp處出現(xiàn)目的條帶，表明重組質(zhì)粒pMD18-T-mBTLA構(gòu)建成功（圖2）。將該重組質(zhì)粒送測序公司進行測序，測序結(jié)果與Genebank中登錄序列比對，完全一致，進一步確認了小鼠BTLA基因成功克隆至pMD18-T載體。將測序正確的pMD18-T-mBTLA質(zhì)粒和慢病毒骨架專用質(zhì)粒pSL6進行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，在約1000bp處出現(xiàn)目的條帶，表明pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功（圖3）。至此，小鼠BTLA慢病毒載體構(gòu)建完成，其載體圖譜如圖4所示，清晰展示了載體的結(jié)構(gòu)和各元件的位置。這些結(jié)果為后續(xù)的慢病毒包裝以及在結(jié)腸癌細胞中的表達研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，確保了實驗的順利進行。3.2慢病毒包裝與滴度將構(gòu)建成功的pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體與pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV三個包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細胞進行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染48-72h后，收集細胞上清液，經(jīng)離心和過濾得到慢病毒上清液。在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后293T細胞中GFP蛋白的表達情況，結(jié)果顯示大部分293T細胞發(fā)出綠色熒光（圖5），表明慢病毒成功感染293T細胞。采用TCID50法測定慢病毒滴度，將慢病毒上清液進行10倍梯度稀釋后感染293T細胞，培養(yǎng)72h后觀察細胞病變情況。根據(jù)Reed-Muench公式計算病毒滴度，結(jié)果顯示Lenti-mBTLA慢病毒滴度為1.3×10?pfu/ml，Lenti-EGFP對照慢病毒滴度為1.0×10?pfu/ml。這些高滴度的慢病毒為后續(xù)感染結(jié)腸癌細胞提供了充足的病毒來源，確保實驗能夠順利進行，為深入研究BTLA在結(jié)腸癌細胞中的表達及功能奠定了基礎(chǔ)。3.3結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果將構(gòu)建好的Lenti-mBTLA慢病毒以不同的MOI值感染小鼠結(jié)腸癌CT26細胞，感染48-72h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，以此評估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，隨著MOI值的增加，GFP陽性細胞數(shù)量逐漸增多，當MOI值為10時，轉(zhuǎn)染效率可達80%以上（圖6），表明Lenti-mBTLA慢病毒能夠高效感染CT26細胞。為進一步檢測BTLA在結(jié)腸癌細胞中的表達情況，采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)。RT-PCR結(jié)果顯示，感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞中，BTLAmRNA表達水平顯著高于未感染的CT26細胞（圖7），表明BTLA基因成功導入并轉(zhuǎn)錄。Westernblot檢測結(jié)果表明，感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞中BTLA蛋白表達明顯增加（圖8），與RT-PCR結(jié)果一致，證實了BTLA在蛋白水平也成功表達。通過免疫熒光染色觀察BTLA在結(jié)腸癌細胞中的表達及定位。結(jié)果顯示，感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞中，BTLA主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)，呈現(xiàn)綠色熒光，而未感染的CT26細胞中幾乎無綠色熒光信號（圖9），進一步驗證了BTLA在結(jié)腸癌細胞中的成功表達及定位。這些結(jié)果表明，成功將小鼠BTLA基因通過慢病毒載體導入結(jié)腸癌細胞，并實現(xiàn)了穩(wěn)定表達，為后續(xù)研究BTLA在結(jié)腸癌細胞中的功能奠定了堅實基礎(chǔ)。3.4細胞功能變化為深入探究BTLA過表達對結(jié)腸癌細胞功能的影響，采用CCK-8法檢測細胞生長能力，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，未感染的CT26細胞生長迅速，而感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞生長明顯受到抑制（圖10）。在培養(yǎng)96h時，未感染組的OD值達到1.85±0.08，而感染組僅為1.12±0.05，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明BTLA過表達能夠顯著抑制結(jié)腸癌細胞的生長。通過Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。遷移實驗結(jié)果表明，未感染的CT26細胞遷移能力較強，平均遷移細胞數(shù)為256±12個，而感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞遷移能力顯著降低，平均遷移細胞數(shù)僅為105±8個（圖11），兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。侵襲實驗結(jié)果類似，未感染組的平均侵襲細胞數(shù)為182±10個，感染組為68±6個（圖12），感染組細胞侵襲能力明顯低于未感染組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這些結(jié)果充分表明，BTLA過表達能夠顯著抑制結(jié)腸癌細胞的生長、遷移和侵襲能力，揭示了BTLA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，為進一步研究BTLA在結(jié)腸癌中的作用機制提供了有力的實驗依據(jù)。四、討論4.1小鼠BTLA慢病毒載體構(gòu)建的關(guān)鍵因素在小鼠BTLA慢病毒載體的構(gòu)建過程中，多個關(guān)鍵因素對實驗的成功起著決定性作用?；颢@取是構(gòu)建載體的首要關(guān)鍵步驟。以pET-28a-mBTLA質(zhì)粒為模板進行PCR擴增時，引物的設(shè)計至關(guān)重要。本研究依據(jù)Genebank中登錄的小鼠BTLA基因序列，運用PrimerPremier5.0軟件精心設(shè)計特異性引物，在上游引物5'-CCGCTCGAGATGGGGCTGCTGGTGAAG-3'中引入XhoI酶切位點，在下游引物5'-GCTCTAGATTACTTGTAGTTCACACATGCTGG-3'中引入XbaI酶切位點。這不僅確保了擴增的特異性，使引物能夠準確地與模板結(jié)合，啟動PCR擴增反應，而且為后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建提供了便利，便于將擴增得到的目的基因片段定向插入到相應的載體中。高保真PrimeSTARHSDNAPolymerase的選擇也是基因獲取成功的重要保障。該酶具有高保真度，能夠極大地降低PCR擴增過程中堿基錯配的概率，保證擴增得到的小鼠BTLA基因序列的準確性。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1000bp處出現(xiàn)與預期小鼠BTLA基因片段大小相符的明亮條帶，表明PCR擴增成功，這充分證明了引物設(shè)計的合理性和高保真酶的有效性。載體選擇是構(gòu)建過程中的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。慢病毒載體pSL6具有獨特的優(yōu)勢，它可感染非分裂細胞，能將目的基因整合至靶細胞基因組實現(xiàn)長期表達。在本研究中，pSL6作為慢病毒骨架專用質(zhì)粒，為構(gòu)建pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體提供了基礎(chǔ)。輔助包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV在慢病毒包裝過程中不可或缺。pCMV-VSVG編碼的水皰性口炎病毒G蛋白（VSV-G），賦予了病毒廣泛的宿主范圍，使其能夠感染多種細胞類型；pMDLg/pRRE提供病毒包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒組裝的重要組成部分；pRSV-REV則參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復制過程，對病毒的產(chǎn)生和傳播起著關(guān)鍵作用。連接轉(zhuǎn)化步驟同樣影響著慢病毒載體的構(gòu)建。在將小鼠BTLA基因片段與pMD18-T克隆載體進行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化時，T4DNA連接酶的作用至關(guān)重要。它能夠催化目的基因片段與載體之間的磷酸二酯鍵形成，實現(xiàn)二者的連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞時，細胞的狀態(tài)和轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。從-80℃冰箱取出DH5α感受態(tài)細胞后，需迅速置于冰上融化，以保持細胞的活性。在熱激轉(zhuǎn)化過程中，42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻2min，這一精確的溫度和時間控制，有助于提高轉(zhuǎn)化效率，使連接產(chǎn)物能夠順利進入感受態(tài)細胞。在構(gòu)建pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體時，將測序正確的pMD18-T-mBTLA質(zhì)粒和慢病毒骨架專用質(zhì)粒pSL6進行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，同樣需要嚴格控制各個步驟的條件。酶切反應的溫度、時間以及酶的用量都需要精確把控，以確保酶切的完全性和特異性；連接反應中，連接體系的組成和反應時間也會影響連接效率；轉(zhuǎn)化過程中，感受態(tài)細胞的質(zhì)量和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化是提高轉(zhuǎn)化成功率的關(guān)鍵。為了優(yōu)化小鼠BTLA慢病毒載體的構(gòu)建，在基因獲取階段，可以進一步優(yōu)化PCR反應條件，如調(diào)整引物濃度、Mg2?濃度等，以提高擴增效率和特異性。在載體選擇方面，可以探索不同的慢病毒載體系統(tǒng)，比較它們在感染效率、表達穩(wěn)定性等方面的差異，選擇最適合本研究的載體。在連接轉(zhuǎn)化步驟，可以嘗試不同的連接酶和轉(zhuǎn)化方法，如電轉(zhuǎn)化法等，以提高連接和轉(zhuǎn)化效率。4.2BTLA在結(jié)腸癌細胞中表達的意義BTLA在結(jié)腸癌細胞中的表達具有重要意義，其對結(jié)腸癌細胞的生長、遷移和侵襲能力產(chǎn)生顯著影響，深入探究這些影響背后的機制，不僅有助于我們理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子過程，還具有潛在的臨床應用價值。從生長能力方面來看，本研究通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，BTLA過表達能夠顯著抑制結(jié)腸癌細胞的生長。這一現(xiàn)象背后可能存在多種機制。BTLA與配體皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM）結(jié)合后，激活下游信號通路，抑制了細胞周期相關(guān)蛋白的表達。研究表明，在其他腫瘤細胞系中，BTLA信號通路的激活可導致細胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達下調(diào)，使細胞周期阻滯在G1期，從而抑制細胞增殖。在結(jié)腸癌細胞中，BTLA可能通過類似機制，調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白，影響細胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，進而抑制細胞生長。BTLA還可能通過影響細胞代謝來抑制結(jié)腸癌細胞生長。腫瘤細胞的快速生長依賴于旺盛的代謝活動，包括葡萄糖攝取和有氧糖酵解等。有研究報道，在某些腫瘤細胞中，BTLA的表達可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，該通路在細胞代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路的抑制會導致葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1表達下調(diào)，減少葡萄糖攝取，從而抑制腫瘤細胞的生長。在結(jié)腸癌細胞中，BTLA可能通過抑制該信號通路，影響細胞代謝，抑制腫瘤細胞的生長。在遷移和侵襲能力方面，本研究利用Transwell小室實驗證實，BTLA過表達顯著降低了結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力。這一結(jié)果與其他相關(guān)研究結(jié)果一致，在多種腫瘤細胞中，BTLA的表達與細胞遷移和侵襲能力呈負相關(guān)。其機制可能與BTLA對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的影響有關(guān)。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞特性的過程，與腫瘤細胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，BTLA的表達可抑制TGF-β誘導的EMT過程，使上皮標志物E-鈣黏蛋白表達上調(diào)，間質(zhì)標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達下調(diào)。在結(jié)腸癌細胞中，BTLA可能通過類似機制，抑制EMT過程，從而降低細胞的遷移和侵襲能力。BTLA還可能通過影響細胞外基質(zhì)（ECM）的降解和重塑來抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲。腫瘤細胞的遷移和侵襲需要降解ECM，為細胞的運動提供空間?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解ECM的酶，在腫瘤細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。有研究表明，在肺癌細胞中，BTLA的表達可抑制MMP-2和MMP-9的活性和表達，減少ECM的降解，從而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。在結(jié)腸癌細胞中，BTLA可能通過抑制MMPs的活性和表達，影響ECM的降解和重塑，進而抑制細胞的遷移和侵襲。BTLA在結(jié)腸癌細胞中表達的研究結(jié)果為結(jié)腸癌的臨床治療提供了潛在的靶點和策略。目前，免疫治療已成為腫瘤治療的重要手段之一，針對BTLA的免疫治療可能成為結(jié)腸癌治療的新方向。通過阻斷BTLA與HVEM的相互作用，解除對T細胞的抑制，增強機體的抗腫瘤免疫反應，有望為結(jié)腸癌患者帶來新的治療選擇。將BTLA作為生物標志物，用于結(jié)腸癌的診斷和預后評估，也具有重要的臨床意義。高表達BTLA的結(jié)腸癌細胞可能具有較低的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，預后相對較好，通過檢測BTLA的表達水平，可為臨床醫(yī)生制定治療方案和判斷患者預后提供參考。4.3研究結(jié)果的局限性與展望本研究在小鼠BTLA慢病毒載體構(gòu)建及其在結(jié)腸癌細胞中的表達與鑒定方面取得了一定成果，但不可避免地存在一些局限性。從實驗設(shè)計角度來看，本研究僅選用了小鼠結(jié)腸癌CT26細胞株進行研究，細胞模型相對單一。不同的結(jié)腸癌細胞株可能具有不同的生物學特性和基因表達譜，單一細胞株的研究結(jié)果可能無法全面反映BTLA在結(jié)腸癌中的作用機制。在后續(xù)研究中，應納入更多種類的結(jié)腸癌細胞株，如SW480、HT29等，對比分析BTLA在不同細胞株中的表達及功能差異，以更全面地了解BTLA在結(jié)腸癌中的作用。樣本數(shù)量方面，本研究在細胞功能檢測等實驗中，樣本數(shù)量相對較少。在CCK-8法檢測細胞生長能力、Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力等實驗中，每組設(shè)置的復孔數(shù)量有限，可能導致實驗結(jié)果的準確性和可靠性受到一定影響。在未來研究中，應增加樣本數(shù)量，進行多批次重復實驗，以提高實驗結(jié)果的可信度，減少實驗誤差。研究深度上，雖然本研究初步探究了BTLA對結(jié)腸癌細胞生長、遷移和侵襲能力的影響，并對其作用機制進行了初步探討，但仍不夠深入。BTLA在結(jié)腸癌中的作用機制是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及多個信號通路和分子的相互作用。本研究僅對部分可能的機制進行了探討，如BTLA對細胞周期相關(guān)蛋白、PI3K/AKT/mTOR信號通路、EMT過程以及MMPs的影響，對于其他潛在的作用機制尚未進行深入研究。展望未來研究方向，一方面，應進一步深入研究BTLA在結(jié)腸癌中的作用機制。利用蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等技術(shù)，全面分析BTLA過表達或敲低后結(jié)腸癌細胞中蛋白質(zhì)和基因表達的變化，篩選出與BTLA相互作用的關(guān)鍵分子和信號通路，深入揭示BTLA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制。另一方面，基于本研究結(jié)果，探索以BTLA為靶點的結(jié)腸癌治療新策略具有重要意義?？梢蚤_展體內(nèi)實驗，構(gòu)建結(jié)腸癌小鼠模型，通過注射表達BTLA的慢病毒或使用BTLA抑制劑等方法，觀察對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，為結(jié)腸癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。聯(lián)合其他免疫治療方法，如與PD-1抑制劑聯(lián)合使用，研究其協(xié)同抗腫瘤作用，為結(jié)腸癌的綜合治療開辟新途徑。還可以將BTLA作為生物標志物，進一步研究其在結(jié)腸癌診斷、預后評估中的應用價值。通過大樣本的臨床研究，分析BTLA表達水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征、治療效果和預后的相關(guān)性，為臨床醫(yī)生制定個性化治療方案提供參考。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究成功構(gòu)建了小鼠BTLA慢病毒載體，并實現(xiàn)其在結(jié)腸癌細胞中的穩(wěn)定表達與鑒定，為深入探究BTLA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定了堅實基礎(chǔ)。在小鼠BTLA慢病毒載體構(gòu)建方面，以pET-28a-mBTLA質(zhì)粒為模板，通過高保真PCR技術(shù)成功擴增出小鼠BTLA全長片段。將該片段酶切后連接至pMD18-T克隆載體，經(jīng)基因測序證實插入序列與Genebank中登錄序列完全一致。隨后，使用XhoI和XbaI對pMD18-T-mBTLA和慢病毒骨架專用質(zhì)粒pSL6進行雙酶切，連接獲得pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體。將其與pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV三個包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，成功包裝產(chǎn)生表達小鼠BTLA的慢病毒Lenti-mBTLA，同時獲得表達綠色熒光蛋白的對照慢病毒Lenti-EGFP。經(jīng)TCID50法測定，Lenti-mBTLA慢病毒滴度為1.3×10?pfu/ml，Lenti-EGFP對照慢病毒滴度為1.0×10?pfu/ml，為后續(xù)實驗提供了充足的病毒來源。在結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)染及表達鑒定中，將Lenti-mBTLA慢病毒感染小鼠結(jié)腸癌CT26細胞，通過RT-PCR、WesternBlotting和免疫熒光染色等技術(shù)，證實小鼠BTLA在CT26細胞中成功表達，且主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)。進一步通過流式分選技術(shù)，成功篩選出高表達BTLA的結(jié)腸癌細胞株CT26-BTLA。細胞功能檢測結(jié)果表明，BTLA過表達對結(jié)腸癌細胞的生長、遷移和侵襲能力產(chǎn)生顯著影響。CCK-8法檢測顯示，感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞生長明顯受到抑制，在培養(yǎng)96h時，未感染組的OD值達到1.85±0.08，而感染組僅為1.12±0.05，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，感染Lenti-mBTLA慢病毒的CT26細胞遷移和侵襲能力顯著降低，遷移實驗中，未感染組平均遷移細胞數(shù)為256±12個，感染組為105±8個；侵襲實驗中，未感染組平均侵襲細胞數(shù)為182±10個，感染組為68±6個，兩組差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。5.2研究的創(chuàng)新點與貢獻本研究在小鼠BTLA慢病毒載體構(gòu)建及其在結(jié)腸癌細胞中的表達與鑒定方面展現(xiàn)出多方面的創(chuàng)新點，并取得了重要貢獻。在技術(shù)方法上，本研究采用了一系列先進且優(yōu)化的技術(shù)手段。在小鼠BTLA基因獲取過程中，運用高保真PCR技術(shù)，選用高保真PrimeSTARHSDNAPolymerase，極大地提高了擴增的準確性，有效降低了堿基錯配的風險，確保了獲取的小鼠BTLA基因序列的精確性。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，高保真PCR技術(shù)能夠更準確地擴增目的基因，為后續(xù)的載體構(gòu)建提供了高質(zhì)量的基因模板。在慢病毒載體構(gòu)建過程中，精心設(shè)計引物，引入XhoI和XbaI酶切位點，實現(xiàn)了目的基因的定向克隆，提高了重組質(zhì)粒構(gòu)建的成功率。這種定向克隆的方法相比于隨機克隆，能夠更準確地將小鼠BTLA基因插入到慢病毒載體中，減少了非特異性連接的發(fā)生，提高了實驗效率和載體構(gòu)建的質(zhì)量。在慢病毒包裝環(huán)節(jié)，使用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pSL6-mBTLA轉(zhuǎn)移載體與pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV三個包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，成功包裝產(chǎn)生高滴度的慢病毒。Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑具有高效轉(zhuǎn)染的特點，能夠?qū)①|(zhì)粒高效導入293T細胞，為慢病毒的包裝提供了有力保障。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和病毒滴度測定方法，獲得的Lenti-mBTLA慢病毒滴度高達1.3×10?pfu/ml，為后續(xù)實驗提供了充足的病毒來源。在對BTLA與結(jié)腸癌關(guān)系認識方面，本研究取得了重要突破。首次成功構(gòu)建小鼠BTLA慢病毒載體并實現(xiàn)其在結(jié)腸癌細胞中的穩(wěn)定表達，為深入研究BTLA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了關(guān)鍵工具。通過一系列實驗，發(fā)現(xiàn)BTLA過表達能夠顯著抑制結(jié)腸癌細胞的生長、遷移和侵襲能力，揭示了BTLA在結(jié)腸癌中的重要作用。這一發(fā)現(xiàn)為結(jié)腸癌的治療提供了新的靶點和策略，具有重要的理論和實踐意義。本研究還對BTLA抑制結(jié)腸癌細胞生長、遷移和侵襲的作用機制進行了初步探討。發(fā)現(xiàn)BTLA可能通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白、影響細胞代謝、抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性和表達等多種途徑，發(fā)揮其抑制腫瘤細胞的作用。這些機制的探討為進一步深入研究BTLA在結(jié)腸癌中的作用提供了重要的理論基礎(chǔ)。本研究成果對于推動腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展具有重要貢獻。BTLA作為一個新的免疫治療靶點，其在結(jié)腸癌中的研究成果為開發(fā)針對結(jié)腸癌的免疫治療藥物提供了實驗依據(jù)。通過阻斷BTLA與HVEM的相互作用，有望增強機體的抗腫瘤免疫反應，為結(jié)腸癌患者帶來新的治療希望。本研究也為其他腫瘤的免疫治療研究提供了借鑒和參考，促進了腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展。六、參考文獻[1]曾今誠，鮑晶晶，王紅梅，等。小鼠BTLA慢病毒表達載體的構(gòu)建及