ch03_培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特征

1、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征,洋蔥的表皮細(xì)胞,植物輸導(dǎo)水分的細(xì)胞,哺乳類的肌肉細(xì)胞,人類脊髓神經(jīng)細(xì)胞,體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,（一）貼附型： 大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)判定，僅大致分成以下四型：,粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi) 生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式 結(jié)果: 基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長(zhǎng)。,培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于粘附型細(xì)胞 粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞,類型 細(xì)胞在

2、體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位,外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面 外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同 按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型,1、成纖維細(xì)胞型： 胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的 來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如： 真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞， 血管內(nèi)皮 形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形

3、或不規(guī)則 三角形，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不等的突起， 中有卵圓形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú) 的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起,成纖維細(xì)胞,2、上皮型細(xì)胞： 細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。,名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同 來(lái)源：來(lái)源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, 如： 皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤 形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁

4、平，不規(guī)則多角形，中有圓 形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng),上皮型細(xì)胞,3、游走細(xì)胞型： 呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。 4、多型細(xì)胞型： 有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,（二）懸浮型： 見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。,概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng) 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng) 來(lái)源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫

5、細(xì)胞也可能 特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán) 優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)， 易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì) 胞),Hepatocytes,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程,（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells） 所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。,1原代培養(yǎng)（Primary Culture）期： 也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)

6、上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差?？寺⌒纬陕始醇?xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。,2傳代期： 初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞

7、稱二倍體細(xì)胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。,3衰退期： 此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)

8、志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。,（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)

9、胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：,?,1潛伏期（Latent Phase）： 細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。,初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長(zhǎng)達(dá)1024小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，1030分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)

10、雜和與多種因素相關(guān)的過(guò)程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附。另外在貼附過(guò)程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細(xì)胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過(guò)程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如 CSP），有的則來(lái)自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一。,初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約2496小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)

11、胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅624小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。,原因: 操作時(shí)，細(xì)胞表面上與其它細(xì)胞及支持物黏附與連接的分子被破壞，細(xì)胞受到損傷 接種細(xì)胞: 適應(yīng)，恢復(fù)，積累(代謝中間產(chǎn)物) 組織塊: 細(xì)胞遷移出 一般經(jīng)數(shù)小時(shí)-幾天,過(guò)程: 游離:懸浮,胞質(zhì)回縮, 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形 吸附:貼附底物,一般24小時(shí)內(nèi)貼壁 潛伏期:可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),基本無(wú)增殖, 少見分裂相,影響因素： 滯留期的長(zhǎng)短與： 細(xì)胞種類、 按種的細(xì)胞密度、 培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。,1.細(xì)胞密度 接種分散細(xì)胞,接種的密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏

12、期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會(huì)較長(zhǎng) 2.細(xì)胞類型 傳代培養(yǎng)的細(xì)胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短。 傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞,一般為6-24h;原代24-96h或更長(zhǎng) 單個(gè)細(xì)胞快,細(xì)胞大團(tuán)慢,組織塊慢 連續(xù)細(xì)胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(6-24h)比有限細(xì)胞系 與正常二倍體細(xì)胞的短 來(lái)源：胚胎組織:短,2天可見細(xì)胞生長(zhǎng) 成體:長(zhǎng),3.細(xì)胞機(jī)能狀態(tài) 不良者慢 4.培養(yǎng)條件 培養(yǎng)液,pH,底物 不利:污染,有毒,2指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）： 這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否

13、的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitotic Index：MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。,在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。 細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)

14、養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。,特點(diǎn)： 是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段 培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞群體均一 是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞,判斷細(xì)胞生長(zhǎng)的指標(biāo)： 指數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)細(xì)胞分裂活動(dòng)的程度(增殖活性)可作為判斷細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的重要指標(biāo) 1.有絲分裂指數(shù)(MI): 指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。 一般細(xì)胞的MI約為0.10.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3%5%。,判斷細(xì)胞生長(zhǎng)的指標(biāo)： 2.細(xì)胞群體倍增

15、時(shí)間: 培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間 3.MTT法：反映細(xì)胞內(nèi)一種酶活性程度 4.標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入量：反映DNA,細(xì)胞生長(zhǎng)一定階段(指數(shù)生長(zhǎng)期一般持續(xù)35 d）,即可 長(zhǎng)滿培養(yǎng)器皿，相互匯合成片(鋪滿 confluence) 當(dāng)細(xì)胞相互接觸連接成片，出現(xiàn)接觸抑制，接觸抑制以后，雖然運(yùn)動(dòng)受抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有當(dāng)細(xì)胞密度增大到一定程度，細(xì)胞便不再分裂增殖。為密度依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)抑制 當(dāng)細(xì)胞分裂停止后，細(xì)胞數(shù)量即不再增加進(jìn)入平臺(tái)期,3停滯期（Stagnate Phase）： 細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)

16、期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過(guò)晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳12兩代，通過(guò)換液淘汰死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。,概述 細(xì)胞鋪滿后再1-2倍增, 進(jìn)入細(xì)胞達(dá)飽和密度, 可存活仍有代謝活動(dòng)，但基本不分裂， 細(xì)胞數(shù)量維持在某一水平上，生長(zhǎng)活動(dòng)停滯,特點(diǎn) (1)細(xì)胞數(shù)量： 細(xì)胞達(dá)飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。 停止生長(zhǎng)原因: 細(xì)胞數(shù)量多、

17、生長(zhǎng)地區(qū)占滿、營(yíng)養(yǎng)消耗、培養(yǎng)液中代謝廢物積聚漸多，細(xì)胞停止生長(zhǎng)。 即使經(jīng)常更換培養(yǎng)液，細(xì)胞也會(huì)變性,從生長(zhǎng)基質(zhì)表面脫落、死亡唯有進(jìn)行傳代方可緩解。,(2)細(xì)胞活動(dòng)小, 細(xì)胞膜的 活動(dòng)小 (3)生長(zhǎng)組分下降: 010% (4)及時(shí)傳代：細(xì)胞已中毒，即使傳代，也會(huì)影響下一代細(xì)胞的功能狀況,?,體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程叫傳代（Passage或Subculture）。,體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類,（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直

18、接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。,（二）細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）。無(wú)限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無(wú)異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說(shuō)

19、明已惡性化。,（三）細(xì)胞株 從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）,（四）二倍體細(xì)胞 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75或80以上）的細(xì)胞群，稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同，二倍體細(xì)胞的壽命長(zhǎng)短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土10代，人胚腎只有810代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞1530代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或25代即大量?jī)龃孀鳛樵N（Stook Cells），用時(shí)再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長(zhǎng)期使用或延緩細(xì)胞的衰老。,（五）遺傳缺陷細(xì)胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要