8高效液相色譜.ppt

1、第八章高效液相色譜8.1概述8.2 HPLC儀器如下：高壓注入裝置；注入系統(tǒng)分離系統(tǒng)測試系統(tǒng)輔助系統(tǒng)8.3流動(dòng)相和固定相介紹8.4高效液相色譜法對分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排斥色譜和親和色譜進(jìn)行簡要說明，8.1概述高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法?？梢愿鶕?jù)固定相分割：液-液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；大小排斥色譜(凝膠滲透色譜)。還有親和層析、平板色譜(薄層色譜)等。包括Tswett在內(nèi)的早期液相色譜在直徑15厘米、長度50500厘米的玻璃柱上進(jìn)行。為了確保恒定的柱流速，填充的固定相粒子直徑在150200m范圍內(nèi)更多。但是流速仍然很低(1mL

2、/min)，分析時(shí)間仍然很長！如果壓力增加流速(真空或空氣泵)，則即使分析時(shí)間減少，柱托盤高度Hmin也會(huì)相應(yīng)增加！或者柱子效果下降了。為了解決分析時(shí)間和柱效果問題，最有效地增加柱效果的唯一方法是減少填充物的粒度(310 m)！1 .高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜的比較快速：HPLC采用高壓注入設(shè)備，流速大大增加，分析速度非常快，只需幾分鐘；經(jīng)典方法通過重力供給完成分析需要幾個(gè)小時(shí)。高效：填充物顆粒很細(xì)，有規(guī)律，固定相斑點(diǎn)均勻，傳質(zhì)阻力小，柱效果高。幾分鐘內(nèi)就能完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：探測器靈敏度極高：UV10-9g，熒光探測器10-11g。2.HPLC和GC的比較分析對象和范圍：GC分析

3、僅限于有機(jī)物總數(shù)的20%的氣體和低沸點(diǎn)穩(wěn)定化合物。HPLC可以分析穩(wěn)定或不穩(wěn)定的化合物，該化合物占高沸點(diǎn)、高分子質(zhì)量和有機(jī)物總數(shù)的80%。移動(dòng)相選擇：GC在移動(dòng)上是有限的幾種“惰性”氣體，它只起到搬運(yùn)的作用，對組件起較小的作用。HPLC采用的流化床有很多機(jī)會(huì)混合選擇液體或各種液體。它不僅能起到承載作用，還能起到成分作用，與固定相對成分的作用競爭。也就是說，流動(dòng)相對分離的貢獻(xiàn)較大，可以通過溶劑控制和提高分離。工作溫度：GC需要高溫。HPLC通常在室溫下進(jìn)行。結(jié)論：從色譜的發(fā)展來看，HPLC比GC更有用，更有發(fā)展?jié)摿Γ?.2 HPLC設(shè)備HPLC設(shè)備包括：高壓注入裝置；注入系統(tǒng)分離系統(tǒng)測試系統(tǒng)還配

4、備了梯度浸出、自動(dòng)注入和數(shù)據(jù)處理裝置。工作流程如圖所示。1 .高壓注入系統(tǒng)(150350105 Pa) 1)罐：裝有溶劑過濾器(Ni合金)的1-2L玻璃瓶，約2米的孔徑可防止粒子進(jìn)入泵。2)脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑從除氧器中去除薄膜，通過阻止相對分子量較小的氣體(氣泡影響檢測)從溶劑中去除。3)高壓泵：注入泵要求：密封好，注入流動(dòng)脈動(dòng)穩(wěn)定，可調(diào)節(jié)范圍寬度，耐腐蝕性。注入泵類型：靜壓和恒流類型。靜壓泵(類似于波紋管)可以快速獲得高壓，適用于柱的均勻填充。但是泵腔體積大，往復(fù)推進(jìn)時(shí)發(fā)生脈動(dòng)，輸出流量隨著色譜系統(tǒng)阻力(主要是柱填充物)而變化，因此不再使用。恒流型溶劑流量恒定，與柱充填無關(guān)

5、，常用。機(jī)器注入和機(jī)器往復(fù)兩種。最常用的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵(見下圖)。每分鐘往返25100次，脈動(dòng)很小。對流量變化敏感的探測器也有噪聲干擾。這時(shí)可以連接脈動(dòng)阻尼器。3 .柱1)柱要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱節(jié)點(diǎn)的死體積盡可能小。列長1030厘米，內(nèi)徑為45mm(尺寸排除列通常大于5mm，準(zhǔn)備列具有更大的內(nèi)徑)；2)柱填充：主要是均勻化方法。根據(jù)均質(zhì)試劑的使用特性，填充方法：填充時(shí)用上述方法制作均質(zhì)漿料，用流動(dòng)相填充柱及其延長管，將均質(zhì)漿料倒入均質(zhì)器，在高壓力下快速注入柱。需要充填速度(防止凝結(jié)、沉淀或聚集)和進(jìn)氣(影響充填均勻性)。5)電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜檢測?；谀承┙橘|(zhì)

6、中電離后可能發(fā)生的電導(dǎo)(電阻的倒數(shù))變化測量電離物質(zhì)含量的原理。電導(dǎo)檢測器的主要組件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度的影響很大，因此必須將電導(dǎo)池放在溫度調(diào)節(jié)器上。此外，在pH7中，探測器不夠靈敏。其他探測器包括MS、IR、evporative light scattering detector、polar等。8.3 HPLC移動(dòng)相和固定相介紹1，移動(dòng)相不同于GC流，HPLC移動(dòng)相參與了搬運(yùn)作用和固定相的組件競爭，因此溶劑選擇對分離非常重要。理想的溶劑必須具有以下特性：1)測量具有一定的極性和選擇性。2)與探測器匹配。使用UV探測器時(shí)，溶劑截止波長必須小于測量波長(溶劑截止波長低于此波長時(shí)，溶劑吸收會(huì)影響

7、溶質(zhì)測量)。使用折射率探測器，溶劑的折射率必須與被測量物體的折射率大不相同。3)高純度。否則，基線不穩(wěn)定或產(chǎn)生噪聲時(shí)，截止波長可能會(huì)增加。4)化學(xué)穩(wěn)定性好；5)適當(dāng)?shù)恼扯?。粘度過高會(huì)增加柱壓力。太低容易產(chǎn)生氣泡。1 .按壓力分類的剛性固體：SiO2為矩陣，內(nèi)壓為7.01081.0109 Pa?？梢允怪睆健⑿螤詈涂讖讲煌牧Ｗ?。主要用于吸附、分配和結(jié)合色譜法。硬質(zhì)粘合劑：聚合物基(通常通過苯乙烯和二乙烯苯的交聯(lián)使用)，壓力上限為3.5 108 Pa，主要用于離子交換和尺寸排除色譜。2.按孔深度分類的表面多孔：以固體玻璃珠為基質(zhì)，在基質(zhì)表面復(fù)蓋多孔活性物質(zhì)(如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰

8、胺等)的層。表面多孔固定上的大顆粒(著床柱)、小孔層和淺孔(滲透性、峰值速度)；但是交換容量很小。適用于現(xiàn)有分離分析。全多孔：所有硅或氧化鋁粒子聚集在一起，粒子非常細(xì)，因此光圈小，導(dǎo)電性快，柱效果高。特別適用于復(fù)雜混合物的分離。3.根據(jù)分離原理：根據(jù)分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排斥色譜和親和層析等，2、固定相載體、8.4高效液相色譜理論分離原理，可以將HPLC分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排斥色譜和親和層析等?，F(xiàn)在另外介紹一下。一、分配色譜原理：在兩種互不溶的溶液中，每個(gè)測定物的溶解度不同，分配系數(shù)也不同。在熱中，由于流動(dòng)相移動(dòng)，這種分配平衡進(jìn)行了多次，每個(gè)測量對象的移動(dòng)

9、速度不同，因此執(zhí)行了分離過程。2.移動(dòng)相： HPLC分析表明，為了防止固定相損失，兩者不能相互溶解，成為流動(dòng)相和固定液，或者兩者的極性差異越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相和固定相極性的差異，液相色譜可分為兩相分配色譜(流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小于固定相極性，極性成分分離適合于極性成分分離)和逆相分配色譜(流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大于大電流，適合于非極性成分分離)。正相色譜：極性移動(dòng)相c先流出，反相色譜：極性移動(dòng)相a先流出，中極性移動(dòng)相，中極性移動(dòng)相，時(shí)間，時(shí)間，時(shí)間，測量對象極性：ABC，正相，反相色譜的極性和保留時(shí)間按照固定相原理，GC中使用的固定相也可以將HPLC用作固定相。但是，H

10、PLC固定液容易脫落，因此以極性為基準(zhǔn)，僅高到低，ODPN、聚乙二醇(PEM)、三甲基二醇(TMG)、C18和角鯊烯(SQ)經(jīng)常使用。根據(jù)漬法，固定床可以分為機(jī)械漬和化學(xué)結(jié)合型，后者應(yīng)用更廣。1)機(jī)械涂層固定床：通過機(jī)械混合將固定液噴射到表面多孔(0.5-1.5%涂層量)或整個(gè)多孔載體(5-10%涂層量)上而形成的液相色譜固定床。這種固定相的最大缺點(diǎn)是固定液容易脫落，分離穩(wěn)定性和再現(xiàn)性差，不適合梯度浸出。為了減少固定液的損失，通常在柱前與分析柱相同，但涂上更高含量的固定液，以在流動(dòng)相進(jìn)入分析柱前添加固定液預(yù)先飽和的非常短的先行股。2)化學(xué)鍵固定相：化學(xué)鍵固定相是通過化學(xué)反應(yīng)在載體表面結(jié)合有機(jī)分

11、子形成的支柱填充物，具有穩(wěn)定、損失小、適合梯度浸出的特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)制不是簡單吸附或單一液體分布，而是兩者?；瘜W(xué)鍵的表面覆蓋決定了哪些機(jī)制起主要作用。在大多數(shù)結(jié)合上，分配機(jī)制占主導(dǎo)地位。通常，化學(xué)鍵的載體主要是硅膠(表面有硅):Si-O-R:熱不穩(wěn)定性、水、乙醇等強(qiáng)極性水解，導(dǎo)致酯鏈斷裂，因此僅適用于沒有水或酒精的流動(dòng)相。Si-R(或Si-N):不水解，熱穩(wěn)定性優(yōu)于硅酸質(zhì)。但是使用的他的反應(yīng)很不方便。使用水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，pH必須在4-8之間。Si-O-Si-R:不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。ii .液固色譜(吸附色譜)原理：根據(jù)固體吸附劑活性部位分離不同成分的吸附強(qiáng)

12、度。成分的吸附力強(qiáng)弱取決于吸附劑的表面特性、溶質(zhì)結(jié)構(gòu)和流動(dòng)相特性。固定相：固體吸附劑：多孔二氧化硅、氧化鋁等；活性炭、石墨炭黑、聚合物微球。應(yīng)用：溶質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)空間效應(yīng)和作用對維持值有很大影響，純結(jié)構(gòu)具有更高的保留度，大量替代物降低了元件的保留度。通常用于異構(gòu)或順反異構(gòu)的分離。第三，離子交換色譜是將離子交換原理與液相色譜相結(jié)合，確定各種陰離子和陽離子的分離分析方法的方法。不僅適用于無機(jī)離子，還適用于蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等有機(jī)物的分離。1.原理：利用不同測量對象離子對固定相的親和力(或離子交換力)的差異進(jìn)行分離。測量對象離子采用離子交換樹脂固定相電荷組或自由離子的可逆交換反應(yīng)：Temporal

13、course，離子交換分離機(jī)制，緩慢的中速，色譜分離，一般負(fù)離子分離，固定相根據(jù)離子交換器類型分為4種，3 .流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相是具有一定pH和離子強(qiáng)度的鹽緩沖溶液，通過改變pH、緩沖劑類型、離子強(qiáng)度、有機(jī)試劑和配位劑等條件控制分配比k，改變了交換劑的選擇性，影響了樣品中待測試物質(zhì)的分離。PH:影響酸或堿的離解平衡，控制成分離子形式的分?jǐn)?shù)。如果元件以分子形式存在，則不會(huì)保留。離子得分越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸、醋酸、醋酸、氨等。與離子強(qiáng)度I: pH相比，對保留值的影響更大。成分保留值由流動(dòng)相中的鹽總濃度控制。增加加號(hào)和正離子將增加他們對R或R-的競爭力，從而減少成分保留值。添加不同種類的鹽會(huì)影響柱的選擇性，因?yàn)椴煌镔|(zhì)對交換劑的親和力不同。有機(jī)溶劑：添加的有機(jī)溶劑通常會(huì)降低成分的保留值。極性越小，保留值越小。常用的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、乙腈、二氧雜環(huán)己烷等。配體l:當(dāng)大量l和成分x沿流動(dòng)方向進(jìn)入列時(shí)，發(fā)生配體交換。RM-L X RM-X L此方法用于分離各種氨基酸或堿類。想法：在離子交換色譜中，流動(dòng)相經(jīng)常使用無機(jī)鹽的緩沖液作為流動(dòng)相。緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度對分離有何影響？離子交換色譜通常用作檢測儀嗎？4、大小排斥色譜大小排斥色譜也稱為凝膠色譜，主要用于大分子分離。這是因?yàn)楸粶y量分子的大小和