中藥化學試驗技術

1、（4）洗脫：開啟輸液泵，按適當流速輸入展開劑。（5）收集：按一定ml數(shù)或依據(jù)色帶（可見或紫外）分部收集。（6）鑒定：洗脫液TLC鑒定，相同斑點合并，濃縮結(jié)晶。4、例（P137）人參葉提取物經(jīng)硅膠柱層析分離后，得到收集流份，某流份經(jīng)TLC檢查，出現(xiàn)4個斑點。此混合物250mg溶于1ml展開劑及2ml乙醇中展開劑：n-BuOH：CHCl3：MeOH：H2O（40：20：15：20），流速為1.7ml / min。TLC板：硅膠GF25435g + 0.5CMC-Na 75ml，90。C活化3h收集流份25份（56ml/份）：流份5人參皂苷Rb2 流份911人參皂苷Rc 流份151720-glc人參

2、皂苷Rf 流份1923人參皂苷Rd（六）離心液相色譜法（CLC） CLC是在離心TLC的基礎上發(fā)展起來的一種制備分離技術。1、特點a) 不用預制板，制板體積固定。b) 載量大，厚度可達1cm，厚度均勻，分離效果好，制備量大于CTLC。c) 填充劑可用多種分離材料：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、凝膠、離子交換樹脂。擴大了使用范圍。d) 與柱層相比，因引進了離心，所以分離速度快，效果好。2、儀器（1）控制器：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速（由此控制流速），分離時間，收集時間。（2）洗脫器：進樣，注入展開劑。有進樣通道，展開通道。（3）分離盤：由底盤、墊圈、盤蓋、柱芯、旋蓋組成，由墊圈的不同規(guī)格，控制裝填厚度。注入吸附劑，在離心

3、作用下，圓盤封閉體系內(nèi)逐漸被分離材料充滿，形成一定厚度的平整涂層。（4）分部收集器3、操作（1）制備填充劑 硅膠填料的用量墊圈規(guī)格 防漏層硅膠（g） 鋪板用硅膠（g） 調(diào)糊用溶劑（ml） 3mm 8 80 450 5mm 12 120 600 10mm 16 160 1000（2）填裝防漏層（3）裝填填充劑（4）進樣、洗脫（5）收集、鑒定：分部收集器收集，TLC鑒定，洗脫液處理同常法。4、實例（P141） 紅秦艽MeOH提取物，上樣量200mg，60g硅膠G制板，板厚2mm，轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/min。展開劑Pet：四氫呋喃：MeOH（100：10：3），分離時間1h，得丹參酮IIA，丹參酸甲酯，丹

4、參酮I。（七）電泳1937年開始，現(xiàn)在中藥成分研究中，成功地用于生物堿、有機酸、氨基酸、蛋白質(zhì)的分離、鑒定。1、原理帶電荷的化合物在電場作用下產(chǎn)生定向移動，由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)（+、）、數(shù)量、強度及分子量不同，各組分移動的方向及速度均不相同，從而達到分離。2、電泳速度的影響因素 電泳速度cm2/秒/伏=電子遷移率a、分子的性質(zhì)，離子態(tài)，電泳速度快。 極性基團多，電泳速度快，在電場作用下，發(fā)生極化，產(chǎn)生電性。b、電場強度（電位降/cm），電場強度高，電泳速度快。c、溶液離子強度：介質(zhì)（緩沖液），離子強度高，成分移動慢。d、電滲（液體對于支持體的相對移動） 支持物的極性基團在電場作用下產(chǎn)

5、生電性，支持物上的溶液產(chǎn)生相反的電性，這樣，影響到各個組分的電泳速度。此外，緩沖液黏度、溫度也有一定的影響。3、紙電泳（簡單、易行）（1）裝置：穩(wěn)壓器，電極，緩沖液槽（2）緩沖液的選擇：離子強度0.020.2，控制電泳速度恒定。（3）點樣：點狀或帶狀，點在濾紙中央。 點樣后紙兩端浸入緩沖液，至距樣品45cm取出，讓緩沖液擴散至樣品。（4）電泳：點好樣的濾紙放在支架上，二端下垂浸入緩沖液槽中，通電流。 一般電場強度為10伏/cm，電泳2h（5）顯色：同一般PC（6）作用：了解各組分酸堿性及強弱，再針對性地提取、分離。 紙電泳譜位及判斷 緩沖液 正極 負極 結(jié)果判斷酸性緩沖液 中性成分堿性緩沖液

6、酸性緩沖液 中性成分堿性緩沖液 酸性緩沖液 弱堿性成分堿性緩沖液 酸性緩沖液 強堿性成分堿性緩沖液 酸性緩沖液 弱酸性成分堿性緩沖液 酸性緩沖液 強酸性成分堿性緩沖液 酸性緩沖液 兩性成分堿性緩沖液 4、瓊脂板電泳以瓊脂板為支持物的一種凝膠電泳。制板 點樣 電泳 染色常用于分離測定蛋白質(zhì)，因為瓊脂對蛋白質(zhì)吸附極微。三、柱層析法分離原理同平面層析，不同在于將分離材料加入玻璃柱中，再洗脫分離。分離樣品量大，0.150g，多為制備性分離。 吸附柱層 分配柱層 離子交換柱層 凝膠帶柱層（一）氧化鋁、硅膠吸附柱層氧化鋁生物堿、揮發(fā)油、內(nèi)酯、甾體等親脂性成分。硅膠親脂性、親水性化合物分離，亦可用于分配。程

7、序：裝柱 上樣 洗脫 鑒定1、裝柱 樣品：吸附劑 Al2O3 1 : 20 50 （極性小的可 1 : 100） SiO2 1 : 30 100 （極性相近的可 1: 300 400） 層析柱規(guī)格 1 : 10 30（直徑 : 高度） 原則 ： 均勻、致密，無氣泡、縫隙。( 1 ) 干法裝柱 ： 底部塞脫脂棉，敲擊，頓擊。( 2 ) 濕法裝柱 ： 倒入溶劑后，加吸附劑； 吸附劑 + 溶劑 攪拌后，倒入柱中 2、上樣 a 樣品 + 展開劑 溶液、 上樣 ，（注意： 柱床表面防沖擊） b 樣品 + 易溶溶劑 溶液 + 少量吸附劑 拌勻、干燥、過篩 裝于干柱頂端 裝于（上端留有一定體積溶劑）濕柱溶劑

8、中 3、洗脫 洗脫液由TLC 摸索確定 常用梯度洗脫法：eg、 Pet- EtOAC 、CHCl3 - MeOH 注意 ：少用 OH-、 H+ 、三相溶劑 分部收集洗脫液、體積小、組分交叉少、但后處理麻煩 a 體積大、組分交叉多、但后處理便利 b a 用于 Rf 值差異小、or 單體純化 b 用于 Rf 值差異大、 粗分 常根據(jù)上樣量、柱子大小、分離度好壞來決定2、 鑒定 TLC 、PC 熒光檢測、微生物活性顯示 相同組分合并、濃縮后析晶，結(jié)晶法如前述 5、實例， 粉防己中漢防己甲、乙素的分離 P153 漢防己甲素 R = CH3 漢防己乙素 R = H 漢防己根粗粉200 g + 95% E

9、tOH1400 ml 回流3次 濾液濃縮至糖漿狀 殘渣 50C +1%HCl300 ml 邊加邊攪 濾液 環(huán)乙烷 : EtOAC (1:3) 萃取2次 有機層 水層 + NH4OH pH = 9 環(huán)乙烷 ：EtOAC(1:3) 有機層 水層 無水Na2SO4 脫水 ，蒸干抽松，Me2CO結(jié)晶 總堿 硅膠柱層，加壓：0.5 0.6Kg/cm2 環(huán)乙烷 : ETOAC : 二乙烷(6:2:1)洗脫 流速0.7 0.8 ml/min 漢防己甲素 漢防己乙素 （二）聚酰胺柱層析1、分離原理(1)氫鍵吸附（60年代初形成）聚酰 OCH OHH ETOAC 聚酰胺 化合物溶劑洗脫難易：水 MeOH EtO

10、H Me2CO 稀NH3OH CH3CH2CH2COOH b 對、間位酚OH 鄰位酚OH c 芳香核、共軛雙鍵多、吸附力強d 形成分子內(nèi)氫鍵、吸附力弱 （2）極性吸附原理，（雙重層析性能：氫鍵 + 極性吸附） 既有酰胺基，又有非極性脂肪鏈 適于難與聚酰胺形成氫鍵的：萜類、甾體、生物堿 適于以非水性有機溶劑為洗脫劑，如CHCl3 : MeOH 如 黃酮苷(A)、相應的黃酮苷元(B) 含水溶劑洗脫（含水醇）： A B（水中氫鍵牢固，且對苷溶解性大） 非水溶劑洗脫（如CHCl3-MeOH）：B A （極性吸附原理）2、聚酰胺的制備與再生： 制備：市售聚酰胺（1530目 +H20，浸1224h 研磨

11、過篩（80100目） 混懸液 裝柱 抽濾 60-80C，2-3h 備用 再生： 5% NaOH 洗至無色，水洗中性 含多元酚液（鞣質(zhì)）+5% NaOH 浸泡過夜 換5% NaOH 反復數(shù)次 水洗至pH =9 2倍10%HAC洗 水洗中性3、 柱層操作： 裝柱：混懸液直接裝柱，自然沉降，水與柱床表面齊平即可。 細粉 +H2O 攪拌至氣泡除去 裝柱，同上 加樣：20 30% 樣品水液 樣品：聚酰胺 = 1：40 60 a、除雜，樣品量可大大增加 b、樣品不溶于水，可用少量醇溶后，拌入少量聚酰胺粉，揮去溶劑，懸浮于洗脫劑中上樣 洗脫：一般H2O 10% EtOH 30% EtOH 50% EtOH

12、70% EtOH 95% EtOH 3% NH4OH 5%NaOH. 梯度更換，根據(jù)洗脫液顏色掌握 鑒定： TLC檢索，相同流份合并，濃縮后適當溶劑結(jié)晶4、實例 甘草葉中黃酮類成分的提取分離 甘草葉1050 g + 95% EtOH滲漉 乙醇提取液 殘渣 回收EtOH后，Pet萃取 有機層 水層 + 175g硅膠拌勻， MeOH：H2O（7：3）洗脫 洗脫液 濃縮 依次用CHCl3、EtOAC、n-BuOH萃取CHCl3液 EtOAC液 n-BuOH液 濃縮 總黃酮17g 聚酰胺干柱層析 CHCl3：MeOH（6：1）展開，切割，MeOH洗脫 A部分3.5g B部分1.5g C部分 聚酰胺干柱

13、層析 聚酰胺柱層析 MeOH-H2O重結(jié)晶 CHCl3：MeOH（6：1）展開 CHCl3：MeOH（1：2）洗脫 Sephadex LH-20純化 naouralenol 100mg Uralenol 50mg 聚酰胺柱層析 CHCl3：MeOH梯度洗脫晶50mg Uralenin 250mg（三） 炭柱層析法價廉，吸附力大，適用于大量制備分離。 1、原理 非極性吸附 對非極性化合物吸附力強 對極性化合物吸附力弱 規(guī)律： a 在極性大的水中吸附力強 在極性小的有機溶劑中吸附力弱 所以，一般以不同梯度含水有機溶劑洗脫，極性大 小 b 化合物極性基團（-COOH，NH2，OH .）多，吸附力弱

14、極性基團少，吸附力強 c 化合物母核大，吸附力強；反之，吸附力弱。 所以，吸附力：多糖 低聚糖 單糖 多肽 氨基酸d 吸附力：芳香族 脂肪族e 吸附力：生物堿：堿水液中酸水液中（離子態(tài)，極性大）有機酸、酚類：酸水液中堿水液中（離子態(tài)，極性大）f一般用于水溶性化合物：氨基酸、單糖、多糖、苷類2、活性炭的處理特點：易吸附空氣，氣體占據(jù)吸附表面，俗稱“中毒”，所以用前一般需要活化（120150。C活化26小時），錦綸活性炭80。C活化數(shù)小時（高溫變形）。3、操作（1）裝柱：水中，同聚酰胺粉狀活性炭+硅藻土（1：1）（增加流速），再以蒸餾水混懸，裝柱。（2）上樣：2040%樣品水液；不溶樣品醇溶后上樣

15、。 上樣量：樣品：活性炭 = 1：1020（3）洗脫、鑒定：同聚酰胺4、實例：人參中糖類成分分離 人參根100g2 +水提取 提取液 殘渣 +EtOH放置 沉淀 濾液 50以下減壓濃縮 糖漿狀液 H2O 5%EtOH 15%EtOH 20%EtOH 30%EtOH 洗脫液 洗脫液 洗脫液 洗脫液 洗脫液 減壓濃縮 葡萄糖及果糖 濃縮液 三糖 四糖 更高寡糖 通過AmberliteIRl20、 IR45離子交換樹脂 脫鹽溶液 纖維素柱層析 異丙醇丙酮水（40 4218） 蔗糖 蔗糖 麥芽糖 （含少量麥芽糖）（四）分配柱層1、原理 樣品隨流動相通過含有固定相填料的層析柱時，成分在固定相流動相之間不

16、斷分配，而達到分離。分配系數(shù)差異越大 ，越易分離。2、支持劑a、中性多孔性粉末。b、化學惰性，不溶于固定相、移動相。c、能吸附相當量的固定相，且流動相能自由通過。 如：硅藻土、纖維素、硅膠3、溶劑系統(tǒng)選擇文獻記載（PC）預試（分配TLC或PC）4、 操作（1）裝柱a 支持劑 + 固定相（流動相已飽和）攪勻 抽濾 吸附了固定相的支持劑 + 流動相 劇烈攪拌使兩相平衡 混懸液 b柱中加入流動相（固定相已飽和） 加入支持劑混懸液 自然沉降 流動相與柱床表面平齊，敲擊均勻（2）上樣能溶流動相+流動相 溶液 上樣樣品 能溶固定相+固定相 溶液 + 支持劑 上樣能溶其它溶劑+其它溶劑 溶液 + 支持劑 揮

17、去溶劑 上樣（3）洗脫（同前）注意：流動相預先用固定相飽和（4）鑒定（同前）5、實例：P164狄戈辛（異羥基洋地黃毒苷）的分離裝柱：硅膠 + H2O（EtOAC飽和）攪勻、抽濾 +EtOAC（H2O飽和）浸泡 混懸液濕法裝柱上樣：毛花洋地黃次生苷總苷 + EtOAC（H2O飽和）溶解 上樣 洗脫：0.5%MeOH-EtOAC（H2O飽和）洗脫 鑒定:各流份TLC或PC檢查，相同流份合并，減壓濃縮，MeOH結(jié)晶得：洋地黃毒苷（Digitoxin）、 羥基洋地黃毒苷（Gitoxin）、異羥基洋地黃毒苷（Digoxin）（五）凝膠柱層析 六十年代發(fā)展起來的一種分離技術有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊

18、脂糖凝膠等。本節(jié)主要介紹葡聚糖凝膠。1、分離原理凝膠吸水后形成凝膠粒子，凝膠粒子構(gòu)成網(wǎng)眼，小分子進入，大分子流下。如同按照分子大小過篩一樣，故稱為“篩層析”。G型：水或含水醇上樣、洗脫分離水溶性大分子化合物。 LH-20（引入羥丙基）：可用有機溶劑極性大、極性小化合物均可分離。2、操作（1）凝膠的選用不同分子量范圍的化合物選用不同規(guī)格的凝膠。對于分子量相近，難分離的，要對凝膠預處理，篩選粒度范圍較窄的；水浮去除粉末、碎片。（2）裝柱裝柱前按不同的規(guī)格要求充分膨脹，同前述濕法裝柱，均勻、致密、無氣泡、無縫隙。層析床裝填均勻與否，是分離成敗的關鍵。（3）上樣洗脫劑與柱床表面平齊時，移液管吸取樣品液

19、，上樣同前述液體樣品上樣。（4）洗脫水溶性強的大分子水、電解質(zhì)（鹽類或緩沖液）水溶性較差的大分子醇-水、丙酮-水系統(tǒng)親脂性的（Sephadex LH-20）醇-Me2CO-CHCl3系統(tǒng)，分部收集（5）鑒定 一般化合物PC、TLC蛋白質(zhì)、多肽、多糖在UV特定波長檢測，相同流份合并（6）濃縮與干燥（多為水液）6080薄膜或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮多糖可濃縮后加醇沉淀熱不穩(wěn)定化合物（蛋白質(zhì)、多肽、酶），冷凍干燥。（7）凝膠的再生一般用洗脫劑洗至平衡即可。有污染（有色）0.2N NaOH與0.5N NaCl浸泡、水洗凈，洗脫劑洗平衡即可。3、實例 山楊中活性成分的分離山楊的皮、葉提取物 Sephadex G-2

20、5柱層析 MeOH-H2O洗脫 水楊苷 白楊苷 特里楊亭 大齒楊素 柳葡萄苷 (Salicin) (Populin) (Tremuloidin) (Grandidentatin) (Salireposide)（六）離子交換柱層析 1、原理 利用大分子樹脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在的交換基團而進行的交換性柱層析。離子交換樹脂是由有機高分子化合物組成的網(wǎng)狀多孔性結(jié)構(gòu)材料，由二部分組成。 母體結(jié)構(gòu)組成多孔性網(wǎng)狀骨架 交換基團多孔骨架內(nèi)部連接著相當數(shù)量的交換基團陽離子交換樹脂： R-SO3-H+ + M+OH R-SO3-M+ + H2O 陰離子交換樹脂： R3-N+OH- + M-OH+ R3N+M- + H2

21、O 被分離成分由于酸性或堿性化合物的解離系數(shù)不同，結(jié)合能力也就有所區(qū)別。當用一定酸性或堿性溶液洗脫時，這些化合物根據(jù)解離系數(shù)的差異而被分離。分離遵循化學平衡規(guī)律進行，在層析柱上，由于連續(xù)添加新的樣品液或洗脫液，平衡反應不斷向正反應方向進行。 2、影響離子交換因素 溶液酸堿度 陽離子樹脂： 交換溶液酸度過高，則抑制樹脂中酸性基團的解離。 強酸性樹脂，樣品液 pH 3 弱酸性樹脂，樣品液 pH 6 陰離子樹脂：交換溶液堿度過高，則抑制樹脂中堿性基團的解離。強堿性樹脂，樣品液 pH 10 弱堿性樹脂，樣品液 pH 7 成分的性質(zhì)：取決于成分的介離離子電荷、半徑及酸堿性強弱 介離常數(shù)大，酸堿性強，介離

22、離子價數(shù)高，易交換，洗脫難 反之，難交換，易洗脫。 成分的濃度：濃度略低較好，濃度過高則樹脂網(wǎng)孔易失水而造成收縮，影響成分離子進入網(wǎng)孔內(nèi)。 交換液的溫度：溫度高，樹脂及成分的介離系數(shù)增大，交換速度快，洗脫也是如此，但熱不穩(wěn)定成分，避免加溫。 交換溶劑：一般為水，也可是稀醇。極性小的有機溶劑由于介離能力差，難以交換或不能進行交換。 交換流速：快，不完全，成分易泄漏；慢，交換充分，但時間長。 一般，1:1525 的柱子， 12 ml/cm2min 樹脂用量： 理論上 ：根據(jù)樹脂的交換容量，樣品中成分的大致含量計算。實際上：中藥提取液中常含可介離的無機鹽成分。故一般用量要大得多。 可用小試方法3、操

23、作： 樹脂預處理 ：a 篩選：過篩 或 浮選 b 充分膨脹2 3 天c 轉(zhuǎn)型 強酸型（Na型）：裝柱 + 10 倍 2M HCl H型 浸泡 交換 + H2O 至中性 + 10 倍 1M NaOH (或NaCl) Na型 + H2OpH 78 +10 倍1N HCl H型+ H2O pH 7 Na- H- Na- H- 強堿型（Cl- 型）：裝柱 + 10 倍2M NaOH OH - 型 + H2O pH 9 + 10 倍 1M HCl Cl- 型 + H2O pH 7 + 10 倍 1M NaOH OH - 型 Cl- OH - Cl- OH - 裝柱：（樹脂處理時已裝好） 交換：放出多余液

24、體，待液面與樹脂面平齊時，加入樣品液。 樣品液的pH值：原則，樣品與樹脂均可介離。 生物堿， pH 偏酸； 有機酸， pH 偏堿。 洗脫，先以水洗至無色，再以適宜溶劑洗脫。 酸性化合物，酸洗(0.11N HCl)后，有機溶劑洗； 堿性化合物，堿化(0.11N NH4OH)后，有機溶劑洗，化合物堿性由弱強洗脫 再生，同樹脂預處理。 4、實例：南瓜子氨酸（Cucurbitine）的提取分離南瓜子(壓榨去油) +H2O溫浸5次 水提取液 殘渣 通過磺酸型陽離子交換樹脂柱 水溶液 樹脂柱 H2O洗凈 1%NH4OH洗脫 氨水洗脫液 減壓蒸發(fā)至除盡NH3 固體物 溶于水(2倍),+乙醇(10倍) 上清液

25、 沉淀 +過氯酸至pH5, 濾除沉淀 +乙醇至渾濁, 放置 粗晶 母液 溶于少量水中 通過弱堿型陰離子交換樹脂柱水溶液 樹脂柱(吸附過氯酸) 濃縮、析晶南瓜子氨酸（七）閃式柱層析（Flash chromatography）： 1、閃式硅膠：4063um微球形，分離速度、效果均優(yōu)于普通硅膠。2、操作：方法同普通硅膠。 3、實例：山莨菪堿和樟柳堿的分離吸附劑：閃式硅膠洗脫劑：氯仿-甲醇（9：1） 據(jù)TLC選擇溶劑系統(tǒng)，以氯仿洗脫至柱底后，以上述系統(tǒng)洗脫，10ml/份鑒定：TLC檢查后，合并相同流份結(jié)果： 成分 山莨菪堿 成分 樟柳堿 流 份 13 45 612 1317 洗脫體積 30ml 20m

26、l 70ml 50mL（八）大孔吸附樹脂分離法： 1、原理： 吸附性（范德華引力或氫鍵） 篩性 （多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)） 依據(jù)分子體積大小及吸附力不同而分離水液中吸附力強。2、影響分離的因素： a 分子極性大小 極性大的成分中極性樹脂分離； 極性小的成分非極性樹脂分離。 b 分子體積大?。悍肿哟?，吸附力強，選擇大孔徑樹脂。 c pH值影響： 酸性成分： 酸性條件下易被吸附 堿性成分： 堿性條件下易被吸附 中性成分： 中性條件下易被吸附 3、洗脫液的選擇： 可選用不同濃度的MeOH、EtOH、Me2CO，流速0.55ml/cm2.min。非極性大孔樹脂 洗脫劑極性越小，洗脫能力越強。 中極性大孔樹脂 用

27、極性較大有機溶劑。4、預處理與再生： 預處理：MeOH 或Me2CO浸泡過夜，裝柱后連續(xù)洗滌至流出液加等量水無渾濁。 再 生：EtOH洗滌（上樣液一般為水液） 或 0.1 1 mol/L NaOH (or HCl)洗滌，再用水洗至中性。 實例 ：黃芪皂苷的分離黃芪根粉 +EtOH提取 提取液 殘渣 減壓濃縮，+H2O 清液 通過D101大孔樹脂柱 30%EtOH洗脫，90%EtOH洗脫 30%EtOH洗脫液 90%EtOH洗脫液 濃縮 硅膠柱層析 黃芪皂苷Ed200mg Ec80mg W2120mg（九）減壓柱層析： 簡便、實用、快速。原理同吸附層析。 1977年澳大利亞學者Cool首次創(chuàng)用。

28、 特點：1、應用：極性分段； 較大量制備性分離。 2、裝置：G-4垂熔玻璃漏斗，磨底抽濾瓶， 減壓泵，收集瓶。 3、層析條件：吸附劑硅膠或氧化鋁 上樣量1：30200（樣品：吸附劑）4、操作：吸附劑裝入（5cm）后，減壓泵抽緊。 加樣；干法 洗脫；（減壓下）可梯度洗脫，分部收集 鑒定 實例 黑芨草中訕酮類化合物的分離（減壓柱層析法） 樣品：黑芨草總訕酮100mg吸附劑：硅膠H洗脫劑：Pet：EtOAc梯度洗脫，100ml/份鑒定：TLC，展開劑：Pet：EtOAc（7：3）結(jié)果：Pet：EtOAc（90：10）部分得1-OH-2,3,7-OCH3訕酮65mg Pet：EtOAc（86：14）部

29、分得1-OH-2,3,5-OCH3訕酮13mg（十）短柱層析： 1、有關理論： 過去認為，柱效隨柱徑的加大而下降 近年來認為，柱徑加大后，在適當條件下柱效反而提高。 Konx:“無限直徑效應”理論：柱徑粗，層析集中于中部進行，減少“柱壁效應”，柱效提高； 另一方面，柱短可使洗脫液在柱內(nèi)受阻減少，加之載面增大，使流速增加，從而為高細度吸附劑提供了條件。 2、方法： 柱直徑：3 20cm , 長度：1:2 5 3、實例（1）黃芪醇提物通過大孔樹脂的水洗脫液，：520cm硅膠柱，EtOAc-MeOH洗脫，得W2 0.2g。（2）茜草乙醇提取液：1640cm硅膠柱，得蒽醌類成分。（3）暴馬子醇提物：6

30、30cm硅膠柱，CHCl3-MeOH梯度洗脫，得粗晶，Pet重結(jié)晶，得純品。（4）人參總皂苷苷元：35cm氧化鋁柱，環(huán)己烷-乙酸乙酯洗脫，得人參二醇、人參三醇。（5）天麻醇提物：525cm硅膠柱，苯、乙酸乙酯-苯、乙酸乙酯-甲醇洗脫，得對羥基苯甲醇、天麻苷。（十一）低壓柱層析： 采用1040u的填料，在加壓情況下進行。1、裝置：低壓柱上端磨口連有溶劑球體的優(yōu)質(zhì)玻璃層析柱，玻璃承受壓力約為24Kg/cm2。壓力源多為N2氣，適于易氧化破壞的成分分離。 空氣壓縮機（小型）及皮球袋，適于穩(wěn)定性好的成分分離。 控制壓力0.3 1.2kg/cm2自動部分收集器2、操作：裝柱 上樣 洗脫 加壓 收集 鑒定

31、3、特點 ：a、效果好；分離材料粒度小、均勻性好，加之恒壓，使得理論塔板值增加，分離度提高。b、速度快；分離速度與壓力成正比，且使用優(yōu)良吸附劑，故一次可達分離目的，而常壓柱層往往需幾次才可分離得單體。c、應用范圍廣，對空氣中穩(wěn)定或不穩(wěn)定的化合物均適用，這一點對不穩(wěn)定的化合物尤其重要。4、實例 甲基還原青蒿素立體異構(gòu)體的分離： 吸附劑：硅-膠H，4.58cm，壓力 2kg/cm2； 洗脫劑：苯，25ml/份； 結(jié)果：15 29份b-甲基還原青蒿素49 55份a-甲基還原青蒿素（十二）高效液相層析法 第五章 提取與分離的方案的設計 已知成分查閱文獻，借鑒前人方法，針對性地設計提取分離方案。 未知成

32、分系統(tǒng)分離，藥理指標為導向，追蹤分離其中的有效成分。 提取 粗分（部位分離） 分離 細分（部位分組分離） 單離一、提取7095%EtOH 除多糖、蛋白質(zhì)外的絕大多數(shù)成分，無毒、價廉，b p較低H2O 絕大多數(shù)水溶性成分，強親脂性成分出不來無毒、價廉，b p高，EtOAc、C6H6、Me2CO、Pet 提取雜質(zhì)少，價格較貴，有毒二、分離1、部位分離 水中萃取 方法 連續(xù)回流提取法（拌入硅藻土） 短柱或減壓層析（拌入硅膠）不同學者的部位分離法 Dragendorff Power FB Zeliner J 剎米達夫 stahl 丘晨波非極性 Pet Pet Pet Pet、C6H6 Pet Pet、

33、C6H6較非極性 CHCl3 Et2O CHCl3 CHCl3 CHCl3 Et2O Et2O Et2O Et2O 中極性 無水EtOH 戊醇 醋酸鉛法 EtOAc Me2CO EtOAc EtOH MeOH n-BuOH極性 水 水 酸性水 堿性水 * 若只想重點分離中等極性成分時，可略去非極性部分，非極性部分與水溶性部分也是這樣。2、部位分組分離 某些含量高并易于結(jié)晶的，在濃縮或放置的情況下，可直接析出粗晶。大部分情況下，需對不同部位成分再分組分離。非極性部位的分組分離a、直接進行層析分離，有時需要進行幾次層析才可得到單體。b、分為酸性、酚性和中性三部分 非極性部位 溶于Et2O或Pet 2%Na2CO3 萃取35 次（每次約為母液的1/3） 有機層 堿水層 2%NaOH萃取3次 HCl酸化，Et2O或C6H6萃取3次