第34講-基因工程及蛋白質(zhì)工程-一輪復(fù)習(xí).ppt

1、第34講 基因工程,考點(diǎn)一基因工程的操作工具,考點(diǎn)二基因工程的操作過程與應(yīng)用,考點(diǎn)三蛋白質(zhì)工程,啟動(dòng)子,能識(shí)別啟動(dòng)子并與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，催化DNA轉(zhuǎn)錄（合成）出RNA。也有解旋DNA的作用。,RNA聚合酶,終止子,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn),阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，從DNA模板上脫落,不能編碼蛋白質(zhì) 可調(diào)控遺傳信息的表達(dá) (調(diào)控序列),RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),RNA聚合酶,RNA聚合酶,RNA聚合酶,原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),與RNA聚合酶 識(shí)別結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,

2、內(nèi)含子：,外顯子：,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,基因工程又叫_通俗的來說，就是按照人們的意愿，把一種生物的_提取出來，加以_，然后放到_，定向的改造生物的_,一、基因工程的概念及原理,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),某種基因,修飾改造,另外一種生物的細(xì)胞中,遺傳性狀,抗蟲棉的培育：,蘇云金桿菌,Bt毒蛋白基因,毒蛋白,棉花細(xì)胞,殺死害蟲,1.供體：提供_。 2.操作環(huán)境：_。 3.操作水平：_水平。 4.原理：_。 5.受體：表達(dá)目的基因。 6.本質(zhì)：性狀在_體內(nèi)表達(dá)。 7.優(yōu)點(diǎn)：克服_ _障礙，定向改 造生物_。,目的基因,體外,分子,基因重組,受體,遠(yuǎn)緣雜交不親和,性狀,對(duì)基因工程的

3、概念的理解,二、基因工程的工具,準(zhǔn)確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”） DNA片段的連接工具（“分子縫合針”） 基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運(yùn)輸車”）,工具工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱“限制酶”）,DNA連接酶,運(yùn)載體,來源：,種類：,特點(diǎn)：,主要從原核生物中分離純化而來,大約4000種，限制酶是一類酶，而不是一種酶,能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定_，使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的_斷開。,1、“分子手術(shù)刀” 限制酶,限制酶在原核生物中主要起切割外源DNA，使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。,化學(xué)本質(zhì)：,蛋白質(zhì),作用：,可用于目的基因和載體的切割,結(jié)果：,產(chǎn)生_或_。,黏性末端,平末端,磷

4、酸二酯鍵,核苷酸序列,G A A T T C,C T T A A G,黏性末端,黏性末端,大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)能特異性識(shí)別_，并在_之間切開。,限制酶的作用,GAATTC序列,G和A,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,SmaI只能識(shí)別_，并在_之間切開。,CCCGGG序列,C和G,一GGATCC一 一CCTAGG一,一GATC 一 一 CTAG 一,限制酶I,限制酶,GAATTC CTTAAG,EcoR,同一種DNA片段用不同限制性酶處理，形成的黏性末端一般不相同，但也有相同的。,黏性末端相同,黏性末端不相同,作用：,兩類,將_“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的_

5、,這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。,2、分子縫合針DNA連接酶,雙鏈 DNA片段,磷酸二酯鍵,種類：,(注：形成的是磷酸二酯鍵而不是氫鍵，無特異性),連接黏性末端和平末端,只能連接黏性末端,都能催化形成磷酸二酯鍵,形成重組DNA分子,形成DNA的一條鏈,基因工程,DNA復(fù)制,DNA連接酶與DNA聚合酶的比較,將單個(gè)脫氧核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵,在兩DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,3、基因的運(yùn)輸工具運(yùn)載體,作用：,如果直接把外源基因?qū)爰?xì)胞，外源基因在細(xì)胞中不能進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定保存。,常用的運(yùn)載體分為兩類：,a.質(zhì)粒,b.噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒,(是擬核外能夠自主復(fù)制

6、的小型環(huán)狀DNA）,有侵染或進(jìn)入宿主細(xì)胞的能力,作為運(yùn)載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去； 使外源基因能在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存、復(fù)制和表達(dá)。,載體的化學(xué)本質(zhì):,能夠自我復(fù)制的DNA分子,作為運(yùn)載體必須具備哪些條件？,4)對(duì)受體細(xì)胞無害,5)大小合適,在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。,1)能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。 2)一至多個(gè)限制酶切點(diǎn) 3)標(biāo)記基因,便與外源基因連接,供重組DNA的鑒定和選擇,(如抗菌素抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等),二、基因工程基本操作過程,1、目的基因的獲取,(一)目的基因的獲取,1、目的基因主要是指 _也

7、可以是一些具有_。,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,2、目前常用的獲取方法：,人工合成法,反轉(zhuǎn)錄法,化學(xué)合成法,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,從基因文庫中獲取,調(diào)控作用的因子,初始目的基因的來源,從自然界中已有物種中分離,人工合成,目的基因序列未知,目的基因序列已知,(1)從基因文庫中獲取目的基因,基因文庫,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,基因庫是指一個(gè)種群中全部個(gè)體所含有的全部基因。,含有一種生物的全部基因,只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫,基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。,種類,提取某

8、種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,重組載體,基因組文庫,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,-鳥槍法,基因組文庫構(gòu)建,包含了這種生物的所有基因,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,重組載體,基因組文庫,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,-鳥槍法,基因組文庫構(gòu)建,cDNA文庫的構(gòu)建,提取生物某發(fā)育時(shí)期mRNA,單鏈DNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,雙鏈的cDNA,與載體連接導(dǎo)入受體菌群儲(chǔ)存起來,DNA聚合酶,只含該生物的部分基因,-逆轉(zhuǎn)錄法,基因組文庫和部分基因文庫的比較,小,大,無,有,無,有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可

9、以,部分基因可以,思考： 如何從基因文庫中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色體上的位置； 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA； 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。, 概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng) 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),條件：_、 _ 、 _ 、 _,原理：_,方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA雙鏈復(fù)制,已知基因的核苷酸序列（前提）,四種脫氧核苷酸,一對(duì)DNA引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶 （Taq酶）,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增,(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目

10、的基因,根據(jù)已知目的基因的核苷酸序列來合成引物,模板DNA,第一步DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,氫鍵,單鏈DNA,過程：,模板DNA,第二步退火（復(fù)性55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,雙鏈,模板DNA,模板DNA,第三步延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。,模板DNA,模板DNA,PCR技術(shù)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA的半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖所示)。,(4)DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是_。引物的實(shí)質(zhì)是_，若將1個(gè)DNA分子拷貝10次，則需要在

11、緩沖溶液中至少加入_個(gè)引物。,DNA的復(fù)制不能從頭開始，DNA聚合酶只能從引物的3端延伸DNA鏈,單鏈RNA或者單鏈DNA分子,2112,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì),四種脫氧核苷酸,原料、模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq 酶）,DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代，使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用,目的基因 啟動(dòng)子 終止子 標(biāo)記基因 復(fù)制原點(diǎn),(位于基因的首端，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位),(位于基因的末端，使轉(zhuǎn)錄停止),鑒別和篩選受體細(xì)胞是否含有

12、目的基因，一般為抗性基因或熒光基因,(二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心,表達(dá)載體的組成：,注意目的基因插入的位置，選擇限制酶的種類,載體,限制性內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切酶,重組運(yùn)載體,運(yùn)載體自連,目的基因自連,AATTC G,G CTTAA,思考：形成的重組DNA分子中，由2個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有哪些種類？,重組DNA,通常用兩種不同的限制酶切割目的基因和運(yùn)載體,原因：防止目的基因自身環(huán)化、運(yùn)載體自我連接、運(yùn)載體和目的基因反向連接，提高所需重組DNA的概率,限制酶的選擇原則,(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn),切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶,不能切基因內(nèi)部,（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶

13、的種類,切割目的基因與質(zhì)粒要具有相同的黏性末端 切割后具備標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子。 切割位點(diǎn)在啟動(dòng)子和終止子之間 質(zhì)粒上標(biāo)出TDNA片段，則所選限制酶切點(diǎn)應(yīng)位于TDNA片段,若要利用某目的基因(見圖甲)和P1噬菌體載體(見圖乙)構(gòu)建重組DNA(見圖丙)，限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)分別是Bgl(AGATCT)、EcoR(GAATTC)、Sau3A(GATC)。下列分析合理的是(),A.用EcoR切割目的基因和P1噬菌體載體 B.用Bgl和EcoR切割目的基因和P1噬菌體載體 C.用Bgl和Sau3A切割目的基因和P1噬菌體載體 D.用EcoR和Sau3A切割目的基因和P1噬菌體載體,

14、D,（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,對(duì)象、過程、原理 (課本P12),2)基因槍法,3)花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,顯微注射法 (步驟),Ca2+處理法（原理、步驟）,為什么大多用微生物作為受體細(xì)胞？,用原核生物和真核生物作為受體細(xì)胞的區(qū)別?,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程,-轉(zhuǎn)化,(四）目的基因的檢測(cè)與鑒定,目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測(cè)與鑒定才能知道,分子水平檢測(cè),檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA是否插入目的基因(目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定表

15、達(dá)的關(guān)鍵) 提取DNA，DNA分子雜交,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 提取mRNA，分子雜交,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 提取蛋白質(zhì)、抗原-抗體雜交,個(gè)體水平檢測(cè)：檢測(cè)性狀,也可利用重組質(zhì)粒上的抗性基因(標(biāo)記基因)進(jìn)行篩選,抗蟲（抗?。┙臃N實(shí)驗(yàn),1.植物基因工程：主要用于提高農(nóng)作物的_，以及改 良_和利用植物_等方面。 2.動(dòng)物基因工程：主要應(yīng)用于動(dòng)物品種改良、建立_ _等方面。 3.基因工程藥物：來源于轉(zhuǎn)基因的_。 4.基因治療：把_導(dǎo)入病人體內(nèi)，使該基因的_ _發(fā)揮功能。,抗逆能力,農(nóng)作物的品質(zhì),生產(chǎn)藥物,生物反應(yīng)器,器官移植,工程菌,正常基因,表達(dá)產(chǎn)物,基因工程的應(yīng)用,體外基因治療

16、,體內(nèi)基因治療,嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷癥,(腺苷酸脫氨酶基因),嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷癥,(腺苷酸脫氨酶基因),比較基因治療與基因診斷：,基因表達(dá),正常基因,堿基互補(bǔ)配對(duì),DNA探針,將 基因與 等調(diào)控組件重組在一起，通過 等方法，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的 中，將 其 送入母體，使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)入泌乳期后，可以通過分泌乳汁生產(chǎn)所需要的藥品，稱為乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。,乳腺生物反應(yīng)器,乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)： 產(chǎn)量高；質(zhì)量好；成本低；易提取。,藥物蛋白,乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子,顯微注射,受精卵,2、蛋白質(zhì)工程的基本原理,基因 DNA,氨基酸序列 多肽鏈,蛋白質(zhì) 三維結(jié)構(gòu),預(yù)期功能,生物功能,mRNA,轉(zhuǎn)錄,翻譯,折疊,DNA合成,分子設(shè)計(jì),蛋白質(zhì)的功能是DNA決定的，要制造出新的蛋白質(zhì)， 就要改造