GB 4789.36-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157H7NM檢驗(yàn)

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB4789.36—2016

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157:

H7

/

NM

檢驗(yàn)

2016-12-23發(fā)布2017-06-23實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局

發(fā)布

GB4789.36—2016

Ⅰ

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.

36—2008相比,主要變化如下:

———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)”;

———修改了標(biāo)準(zhǔn)的范圍;

———修改了設(shè)備和材料;

———修改了培養(yǎng)基和生化反應(yīng)的文字描述;

———?jiǎng)h除“第二法免疫磁珠捕獲法的原理”;

———?jiǎng)h除“第三法全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法”;

———?jiǎng)h除“第四法全自動(dòng)病原菌檢測(cè)系統(tǒng)篩選法”。

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1

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157:

H7

/NM檢驗(yàn)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM(EscherichiacoliO157:H7/NM)的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM的檢驗(yàn)。

2設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

2.1恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。

2.2冰箱:2℃~5℃。

2.3恒溫水浴箱:46℃±1℃。

2.4天平:感量0.1g、0.01g。

2.5均質(zhì)器。

2.6顯微鏡:10倍~100倍。

2.7無(wú)菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸頭。

2.8無(wú)菌均質(zhì)杯或無(wú)菌均質(zhì)袋:容量500mL。

2.9無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑90mm。

2.10pH計(jì)或精密

pH試紙。

2.11長(zhǎng)波紫外光燈:365nm,功率≤6W。

2.12微量離心管:1.5mL或2.0mL。

2.13磁板、磁板架、樣品混合器。

2.14微生物鑒定系統(tǒng)。

3培養(yǎng)基和試劑

3.1改良EC肉湯(mEC+n):見(jiàn)A.1。

3.2改良山梨醇麥康凱瓊脂(CT-SMAC):見(jiàn)A.2。

3.3三糖鐵瓊脂(TSI):見(jiàn)A.3。

3.4營(yíng)養(yǎng)瓊脂:見(jiàn)A.4。

3.5半固體瓊脂:見(jiàn)A.5。

3.6月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG(MUG-LST):見(jiàn)A.6。

3.7氧化酶試劑:見(jiàn)A.7。

3.8革蘭氏染色液:見(jiàn)A.8。

3.9PBS-Tween20洗液:見(jiàn)A.9。

3.10亞碲酸鉀(AR級(jí))。

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3.11頭孢克肟(Cefixime)。

3.12大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基。

3.13大腸埃希氏菌O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑。

3.14鑒定試劑盒。

3.15抗-E.coliO157免疫磁珠。

第一法常規(guī)培養(yǎng)法

4檢驗(yàn)程序

大腸埃希氏菌O157:H7/NM常規(guī)培養(yǎng)法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

圖1大腸埃希氏菌O157:H7/NM常規(guī)培養(yǎng)法檢驗(yàn)程序

5操作步驟

5.1增菌

以無(wú)菌操作取檢樣25g(或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉湯的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)

器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min;或放入盛有225mLmEC+n肉湯的均質(zhì)杯中,8000r/min~

10000r/min均質(zhì)1min~2min。36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

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5.2分離

取增菌后的mEC+n肉湯,劃線接種于CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上,

36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,觀察菌落形態(tài)。在CT-SMAC平板上,典型菌落為圓形、光滑、較小的無(wú)色

菌落,中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;在大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上的菌落特征按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行

判定。

5.3初步生化試驗(yàn)

在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上分別挑取5個(gè)~10個(gè)可疑菌落,分別接種

TSI瓊脂,同時(shí)接種MUG-LST肉湯,并用大腸埃希氏菌株(ATCC25922或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)做陽(yáng)性對(duì)照

和大腸埃希氏菌O157:H7(NCTC12900或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)做陰性對(duì)照,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~

24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中,典型菌株為斜面與底層均呈黃色,產(chǎn)氣或

不產(chǎn)氣,不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察,

MUG陽(yáng)性的大腸埃希氏菌

株應(yīng)有熒光產(chǎn)生,MUG陰性的應(yīng)無(wú)熒光產(chǎn)生,大腸埃希氏菌O157:

H7/NM為MUG試驗(yàn)陰性,無(wú)熒

光。挑取可疑菌落,在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,并進(jìn)行下列鑒定。

5.4鑒定

5.4.1血清學(xué)試驗(yàn)

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落,用O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試

驗(yàn)。對(duì)于H7因子血清不凝集者,應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂,檢查動(dòng)力,經(jīng)連續(xù)傳代3次,動(dòng)力試驗(yàn)均陰

性,確定為無(wú)動(dòng)力株。如使用不同公司生產(chǎn)的診斷血清或乳膠凝集試劑,應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

5.4.2生化試驗(yàn)

5.4.2.1自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落,進(jìn)行生化試驗(yàn)。大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化反應(yīng)特征見(jiàn)

表1。

表1大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化反應(yīng)特征

生化試驗(yàn)特征反應(yīng)

三糖鐵瓊脂底層及斜面呈黃色,H2S陰性

山梨醇陰性或遲緩發(fā)酵

靛基質(zhì)陽(yáng)性

甲基紅-伏普試驗(yàn)(MR-VP)

MR陽(yáng)性,VP陰性

氧化酶陰性

西蒙氏檸檬酸鹽陰性

賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性(紫色)

鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性(紫色)

纖維二糖發(fā)酵陰性

棉子糖發(fā)酵陽(yáng)性

MUG試驗(yàn)

陰性(無(wú)熒光)

動(dòng)力試驗(yàn)有動(dòng)力或無(wú)動(dòng)力

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5.4.2.2如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng),應(yīng)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落,用稀釋液制備成濁

度適當(dāng)?shù)木鷳乙?使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

5.4.3毒力基因測(cè)定(可選項(xiàng)目)

樣品中檢出大腸埃希氏菌O157:H7或O157:NM時(shí),如需要進(jìn)一步檢測(cè)Vero細(xì)胞毒素基因的存

在,可通過(guò)接種Vero細(xì)胞或HeLa細(xì)胞,觀察細(xì)胞病變進(jìn)行判定;也可使用基因探針檢測(cè)或聚合酶鏈反

應(yīng)(

PCR)方法進(jìn)行志賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、

hly

等基因的檢測(cè)。如使用試劑盒檢測(cè)上述基因,應(yīng)

按照產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

6結(jié)果報(bào)告

綜合生化和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果,報(bào)告25g(或25mL)樣品中檢出或未檢出大腸埃希氏菌O157:H7

或大腸埃希氏菌O157:NM。

第二法免疫磁珠捕獲法

7檢驗(yàn)程序

大腸埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕獲法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖2。

圖2大腸埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕獲法檢驗(yàn)程序

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8操作步驟

8.1增菌

同5.

1。

8.2免疫磁珠捕獲與分離

8.2.1應(yīng)按照生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行免疫磁珠捕獲與分離。當(dāng)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明與下面的描述

可能有偏差時(shí),按生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。

8.2.2將微量離心管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào),每個(gè)樣品使用1只微量離心管,然后插入到磁板架

上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.

coliO157免疫磁珠混懸液后,用開(kāi)蓋器打開(kāi)每個(gè)微量離心管的蓋子,

每管加入20μLE.coliO157免疫磁珠懸液。

8.2.3取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL,加入到微量離心管中,蓋上蓋子,然后輕微振蕩10s。每個(gè)

樣品更換1只加樣吸頭,質(zhì)控菌株必須與樣品分開(kāi)進(jìn)行,避免交叉污染。

8.2.4結(jié)合:在18℃~30℃環(huán)境中,將上述微量離心管連同磁板架放在樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微

轉(zhuǎn)動(dòng)10min,使E.coliO157與免疫磁珠充分接觸。

8.2.5捕獲:將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架,確保懸液中與蓋子上的

免疫磁珠全部被收集起來(lái)。此時(shí),在微量離心管壁中間明顯可見(jiàn)圓形或橢圓形棕色聚集物。

8.2.6吸取上清液:取1支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管,從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深入液面,輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到

液面通過(guò)免疫磁珠聚集物時(shí),應(yīng)放慢速度,以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠,則

應(yīng)將其放回到微量離心管中,并重復(fù)8.

2.5步驟。每個(gè)樣品換用1支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管。

免疫磁珠的滑落:某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上

清液時(shí),很難做到不丟失磁珠,在這種情況下,可保留50μL~100μL上清液于微量離心管中。如果在

后續(xù)的洗滌過(guò)程中也這樣做的話,脂肪的影響將減小,也可達(dá)到充分捕獲的目的。

8.2.7洗滌:從磁板架上移走磁板,在每個(gè)微量離心管中加入1mLPBS-Tween20洗液,放在樣品混合

器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)動(dòng)3min,洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟8.

2.5~8.2.7。

8.2.8重復(fù)上述步驟8.2.5~8.2.6。

8.2.9免疫磁珠懸浮:移走磁板,將免疫磁珠重新懸浮在100μLPBS-Tween20洗液中。

8.2.10涂布平板:將免疫磁珠混勻,各取50μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和大腸埃希

氏菌O157顯色瓊脂平板一側(cè),然后用無(wú)菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半,再用接種環(huán)劃線接種平

板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后,翻轉(zhuǎn)平板,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

注:若CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板表面水分過(guò)多時(shí),應(yīng)在36℃±1℃下干燥10min~

20min,涂布時(shí)避免將免疫磁珠涂布到平板的邊緣。

8.3菌落識(shí)別

大腸埃希氏菌O157:H7/NM在CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上的菌落特

征同5.

2。

8.4初步生化試驗(yàn)

同5.

3。

8.5鑒定

同5.

4。

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9結(jié)果報(bào)告

同第6章。

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附錄A

培養(yǎng)基和試劑

A.1改良EC肉湯(mEC+n)

A.1.1成分

胰蛋白胨

20.0g

3號(hào)膽鹽1.12g

乳糖

5.0g

K2HPO4·7H2O4.0g

KH2PO41.5g

NaCl5.0g

新生霉素鈉鹽溶液(

20mg

/mL)

1.0mL

蒸餾水

1000mL

A.1.2制法

除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加熱煮沸,在20℃~25℃下校正

pH

至6.

9±0.1,分裝。于

121℃高壓滅菌15min,備用。制備濃度為20mg/mL的新生霉素儲(chǔ)備溶液,過(guò)濾法除菌。待培養(yǎng)基溫

度冷至50℃以下時(shí),按1000mL培養(yǎng)基內(nèi)加1mL新生霉素儲(chǔ)備液,使最終濃度為20mg/L。

A.2改良山梨醇麥康凱(CT-SMAC)瓊脂

A.2.1山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂

A.2.1.1成分

蛋白胨

20.0g

山梨醇

10.0g

3號(hào)膽鹽1.5g

氯化鈉

5.0g

中性紅

0.03g

結(jié)晶紫

0.001g

瓊脂

15.0g

蒸餾水

1000mL

A.2.1.2制法

除瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅外,所有成分溶解在蒸餾水中,加熱煮沸,在20℃~25℃下校正

pH

至

7.2±0.2,加入瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅,煮沸溶解,分裝。于121℃高壓滅菌15min。

A.2.2亞碲酸鉀溶液

A.2.2.1成分

亞碲酸鉀

0.5g

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蒸餾水

200mL

A.2.2.2制法

將亞碲酸鉀溶于水,過(guò)濾法除菌。

A.2.3頭孢克肟(Cefixime)溶液

A.2.3.1成分

頭孢克肟

1.0mg

95%乙醇200mL

A.2.3.2制法

將頭孢克肟溶解于95%乙醇中,靜置1h待其充分溶解后過(guò)濾除菌。分裝試管,儲(chǔ)存于-20℃,有

效期1年。解凍后的頭孢克肟溶液不應(yīng)再凍存,且在2℃~8℃下有效期14d。

A.2.4CT-SMAC制法

取1000mL滅菌融化并冷卻至46℃±1℃的山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂,加入1mL亞碲酸鉀溶

液和10mL頭孢克肟溶液,使亞碲酸鉀濃度達(dá)到2.

5mg

/L,頭孢克肟濃度達(dá)到0.

05mg

/L,混勻后傾注

平板。

A.3三糖鐵瓊脂(TSI)

A.3.1成分

蛋白胨

20.0g

牛肉浸膏

5.0g

乳糖

10.0g

蔗糖

10.0g

葡萄糖

1.0g

硫酸亞鐵銨[(NH4)

2Fe(SO4)2·6H2O]0.2g

氯化鈉

5.0g

硫代硫酸鈉

0.2g

酚紅

0.025g或5.0g/L溶液5.0mL

瓊脂

12.0g

蒸餾水

1000mL

A.3.2制法

除酚紅和瓊脂外,將其他成分加于400mL蒸餾水中,煮沸溶解,在20℃~25℃下校正

pH

至7.

4

±0.2。另將瓊脂加于600mL蒸餾水中,煮沸溶解。

將上述兩溶液混合均勻后,加入5%酚紅水溶液5mL,混勻,分裝小號(hào)試管,每管約2mL~4mL。

于121°C10min或115°C15min,制成高層斜面。冷卻后呈桔紅色。如不立即使用,在2℃~8℃條

件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。

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A.4營(yíng)養(yǎng)瓊脂

A.4.1成分

蛋白胨

10.0g

牛肉膏

3.0g

氯化鈉

5.0g

瓊脂

15.0g

蒸餾水

1000mL

A.4.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,校正

pH

至7.

4±0.2,分裝。于121℃高壓滅菌

15min。

A.5半固體瓊脂

A.5.1成分

蛋白胨

1.0g

牛肉膏

0.3g

氯化鈉

0.5g

瓊脂

0.3g~0.4g

蒸餾水

100mL

A.5.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,校正

pH

至7.

4±0.2,分裝小試管,于121℃高壓

滅菌15min。直立凝固備用。

A.6月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯-MUG(LST-MUG)

A.6.1成分

胰蛋白胨

20.0g

氯化鈉

5.0g

乳糖

5.0g

磷酸氫二鉀(K

2HPO4)2.75g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

2.75g

十二烷基硫酸鈉

0.1g

4-甲基傘形酮-

β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)

0.1g

蒸餾水

1000mL

A.6.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,于20℃~25℃下校正

pH

至6.

8±0.2,分裝到帶

有倒管的試管中,每管10mL,于121℃高壓滅菌15min。

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A.7氧化酶試劑

A.7.1成分

N,N'-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽

或N,N,N',N'-四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽

1.0g

蒸餾水

100mL

A.7.2制法

少量新鮮配制,于冰箱內(nèi)避光保存,在7d內(nèi)使用。

A.7.3試驗(yàn)方法

用無(wú)菌棉拭子取單個(gè)菌落,滴加氧化酶試劑,

10s內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色,即為氧化酶試驗(yàn)