2017-2018年高中生物 第1部分 微生物的利用 實驗1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離學(xué)案 浙科版選修1

1、實驗1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離課標(biāo)解讀重點難點1.進(jìn)行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)。3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。1.微生物實驗的無菌操作。2.利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。3.利用LB固體培養(yǎng)基分離大腸桿菌。4.劃線分離法和涂布分離法。一、大腸桿菌1大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。2在腸道中，大腸桿菌一般對人無害，但也有一些菌株可以侵襲腸黏膜并產(chǎn)生毒素，任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。3大腸桿菌是基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具。二、實驗內(nèi)容1本實驗的內(nèi)容是將大腸桿菌擴大培養(yǎng)

2、和劃線分離。分離后，一個菌體便會形成一個菌落，這是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡便方法之一。2本實驗用LB液體培養(yǎng)基(通用的細(xì)菌培養(yǎng)基)擴大培養(yǎng)大腸桿菌。培養(yǎng)后再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行分離，隨后培養(yǎng)基上便會形成一個個單獨的菌落。三、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離1細(xì)菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，約20分鐘分裂一次。人們在培養(yǎng)細(xì)菌時，一般用接種環(huán)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。接種時，先將接種環(huán)在明火上燒紅后冷卻，再操作。2細(xì)菌的分離(1)劃線分離法：在液體培養(yǎng)基中，只要接種后培養(yǎng)8 h，每毫升培養(yǎng)基中就有幾億個細(xì)菌?？捎媒臃N環(huán)蘸菌液在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中接種環(huán)

3、上的菌液逐漸減少，因此，劃線到最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)1020 h后，可由一個細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細(xì)菌產(chǎn)生的后代。這種方法也可用于分離細(xì)菌，將污染的雜菌除去。接種環(huán)在取菌種前和劃線前都要灼燒、而后都要冷卻、操作完畢后又要灼燒的原因是什么？【提示】取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者。(

4、2)涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋105107倍，然后取0.1 mL不同稀釋度的稀釋菌液加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個培養(yǎng)皿有20個以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。細(xì)菌的兩種分離法各有優(yōu)點，都可采用。劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些。四、滅菌操作1各種器皿必須是無菌的：實驗用具用牛皮紙或報紙包好，所有容器都先封口，然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(1 kg/cm2壓力、121 、15 min)處理，并在超凈臺上使用。注意：實驗中所需棉花不能用

5、脫脂棉，因為脫脂棉易吸水。2各種培養(yǎng)基必須是無菌的。3細(xì)菌轉(zhuǎn)移過程要避免雜菌污染和菌種外泄。注意：培養(yǎng)皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基，沖散菌落。五、大腸桿菌培養(yǎng)與分離的實驗步驟1在兩個250 mL三角瓶中分別裝入50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基，加上封口膜。將培養(yǎng)皿包好，連同培養(yǎng)基一同滅菌15 min。2滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至60 時，關(guān)閉紫外燈，點燃酒精燈，并用酒精棉球擦拭桌面和實驗者的手。在酒精燈火焰旁用右手持盛有固體培養(yǎng)基的三角瓶，左手拿培養(yǎng)皿，并將培養(yǎng)基倒入4個培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于水平位置上，待其凝固。為什么要在酒精燈火焰旁進(jìn)行操作？【提示

6、】酒精燈火焰旁約10 cm的空間是一個無菌區(qū)，在酒精燈火焰旁操作能防止雜菌污染。3擴大培養(yǎng)先將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒紅，再深入到大腸桿菌斜面，使環(huán)冷卻后，取菌體，并將菌體放入三角瓶液體培養(yǎng)基中，封瓶后在37 每分鐘200轉(zhuǎn)的搖床上振蕩培養(yǎng)12 h。4劃線分離用在酒精燈火焰上灼燒后的接種環(huán)深入到搖床上培養(yǎng)后的菌液中，然后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)需蘸菌液1次，劃線后蓋好皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置，在37 ，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1224 h后，可在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已被分離。5. 在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37 培養(yǎng)24 h后，置于4 冰箱中保存。

7、微生物培養(yǎng)的基本條件1.培養(yǎng)基及其類型(1)培養(yǎng)基：概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，此即培養(yǎng)基。作用：在提供主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)及O2的需求，如培養(yǎng)乳酸桿菌時需在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時需將pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)厭氧型微生物需給予無氧條件等。(2)培養(yǎng)基的種類劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基不加凝固劑微生物的擴大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運動、分類鑒定固體培養(yǎng)基微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種用途選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促

8、進(jìn)所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物(如培養(yǎng)酵母菌和霉菌，可在培養(yǎng)基中加入青霉素；培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，可在培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽)用途鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤)2.無菌技術(shù)進(jìn)行微生物培養(yǎng)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染，無菌技術(shù)即圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下幾個方面：(1)對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。(2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。(3)為避免周圍環(huán)境中微生物的污染

9、，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。(4)實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。3消毒和滅菌的比較概念常用方法應(yīng)用的范圍消毒使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法：在100 開水中煮沸56 min一般物品巴氏消毒法：7075 煮30 min或在80 煮15 min對于一些不耐高溫的液體，如牛奶化學(xué)藥劑消毒法如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等滅菌使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物(包括芽孢和孢子)灼燒滅菌：酒精燈火焰接種工具的滅菌干熱滅菌：干熱滅菌箱內(nèi)160170 下滅菌12 h玻璃器皿、金屬工具的滅菌高壓蒸汽滅菌：1

10、21 條件下，滅菌1530 min培養(yǎng)基及容器的滅菌注：消毒與滅菌的最大區(qū)別是芽孢和孢子能否存活某小組同學(xué)為了調(diào)查湖水中細(xì)菌的污染情況而進(jìn)行了實驗。實驗包括制備培養(yǎng)基、滅菌、接種及培養(yǎng)、菌落觀察計數(shù)。請回答與此實驗相關(guān)的問題。(1)制備培養(yǎng)基：根據(jù)物理性質(zhì)的不同，可以將培養(yǎng)基分為液體、半固體和固體培養(yǎng)基。對細(xì)菌進(jìn)行大量的擴增，用_培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；對細(xì)菌進(jìn)行分離，用_培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。(2)滅菌：在培養(yǎng)微生物時必須進(jìn)行無菌操作，包括各種_都必須是無菌的。對它們進(jìn)行滅菌，通常用_法滅菌。(3)接種及培養(yǎng)：接種時常用的工具是_和玻璃三角刮刀。 為了盡快觀察到細(xì)菌培養(yǎng)的實驗結(jié)果，應(yīng)將接種了湖水樣品的平板

11、置于_中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度設(shè)定在37 。要使該實驗所得結(jié)果可靠，還應(yīng)該同時在另一平板上接種_作為對照進(jìn)行實驗。(4)菌落觀察計數(shù)：培養(yǎng)20小時后，觀察到平板上有形態(tài)和顏色不同的菌落，這說明湖水樣品中有_種細(xì)菌。一般說來，菌落總數(shù)越多，湖水遭受細(xì)菌污染的程度越_。(5)選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長。如果提高培養(yǎng)基中NaCl的濃度，可以用于篩選耐_細(xì)菌?！舅悸伏c撥】(1)細(xì)菌擴大培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基，分離用固體培養(yǎng)基。(2)無菌操作包括所有的器皿要無菌，所有的培養(yǎng)基要無菌，接種過程要防止雜菌污染。實驗室中常用高壓蒸汽滅菌法。(3)接種時常用

12、接種環(huán)，用恒溫培養(yǎng)箱保持溫度。在實驗過程中，除實驗變量以外的其他各變量應(yīng)適宜且相同，以利于更好地實現(xiàn)實驗?zāi)康摹?4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、顏色、透明度、光滑度等。)(5)選擇培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。【答案】(1)液體固體平面(2)器皿和培養(yǎng)基 高壓蒸汽滅菌(3)接種環(huán)恒溫培養(yǎng)箱無菌水 (4)多高(5)鹽(或NaCl)1細(xì)菌培養(yǎng)過程中分別采用了高壓蒸汽、用酒精棉球擦試、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌()A接種環(huán)、手、培養(yǎng)基B高壓鍋、手、接種環(huán)C培養(yǎng)基、手、接種環(huán)D接種環(huán)、手、高壓鍋【解析】此題考查對無菌技術(shù)的掌握。高壓

13、蒸汽滅菌鍋是滅菌的一個設(shè)備，通常用于培養(yǎng)基的滅菌。用酒精擦拭雙手是消毒的一種方法?；鹧孀茻?，可以迅速徹底地滅菌，適用于微生物接種工具的滅菌，如接種環(huán)。【答案】C大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1.LB培養(yǎng)基的制備(1)計算：根據(jù)LB培養(yǎng)基配方的比例，計算配制50 mL 的培養(yǎng)基時各種成分的用量。(2)稱量：準(zhǔn)確地稱取各種成分。即：蛋白胨0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化鈉0.5 g，加水50 mL。(如配LB固體培養(yǎng)基，則再加1 g 瓊脂)(3)制備空白斜面：將LB液體培養(yǎng)基配好，加入瓊脂并加熱使之融化后，通過玻璃漏斗加入試管中，每試管2 mL，加棉塞并將試管捆在一起，上端加蓋一張牛皮紙，滅菌。滅菌

14、后斜靠于平放的鉛筆上，冷卻后即成空白斜面培養(yǎng)基。2進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)與分離操作(1)滅菌(2)制備LB固體平面培養(yǎng)基倒平板操作待培養(yǎng)基冷卻至60 左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作描述如下：(3)擴大培養(yǎng)左手持大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角瓶，右手拿接種環(huán)并用無名指、小指夾住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。將接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使其冷卻后取菌體。將菌體放入三角瓶液體培養(yǎng)基中(將封口膜及斜面棉塞復(fù)原)。三角瓶在37 搖床振蕩培養(yǎng)12 h。(4)劃線分離取種在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，將上述培養(yǎng)后的菌液打開，接種環(huán)部分深入到菌液中取種。平板劃線操作在LB固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃

15、線(如下圖所示)，劃線后蓋好培養(yǎng)皿。培養(yǎng)將上述劃線操作后的培養(yǎng)皿倒置放至37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1224 h，可看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已被分離。(5)菌種純化與保藏在無菌操作下，將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種至斜面上，37 培養(yǎng)24 h后，4 冰箱保存即可。劃線的目的是將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，以期在連續(xù)劃線后，可以分離到由單個細(xì)胞繁殖而來的子細(xì)胞群體(菌落)，從而達(dá)到純化菌種的目的，為此，在劃線操作時，接種環(huán)只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的劃線操作時，須從上一次劃線的末端劃線如此可使菌體數(shù)量隨劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散，最終實現(xiàn)在平板上

16、得到單菌落的目的。下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實驗的基本流程：請回答：(1)滅菌常用_法，滅菌后，要待_時才能打開鍋蓋。(2)倒平板和接種前要用_擦手。接種和劃線前使用_的方法對接種環(huán)滅菌。(3)劃線分離時，接種環(huán)在菌液中蘸取_次。下圖甲表示在平板培養(yǎng)基上的第一次和第二次劃線，請在乙圖中畫出第三次劃線。(4)劃線后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿須倒置，目的是_。(5)實驗完成后，接觸過細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理？_?！舅悸伏c撥】此題考查大腸桿菌的培養(yǎng)和分離過程，具體分析如下：(1)滅菌是指對LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行的滅菌。對培養(yǎng)基進(jìn)行的滅菌應(yīng)該是用滅菌鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。滅菌后，滅菌鍋內(nèi)的

17、壓力與大氣壓相同時，才能打開滅菌鍋，否則會造成培養(yǎng)液濺出。(2)在進(jìn)行實驗操作時，操作者的雙手要用酒精棉球擦拭消毒，接種環(huán)要用火焰燒灼滅菌。(3)劃線分離時，接種環(huán)在菌液中蘸取菌液1次然后連續(xù)劃線。(4)在培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿須倒置，目的是防止冷凝后形成的水滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基，沖散菌落。(5)實驗完成后，接觸過細(xì)菌的器皿應(yīng)滅菌處理以防止污染?！敬鸢浮?1)高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)壓力與大氣壓相同(2)酒精棉球(酒精燈火焰上)灼燒(3)1(見右圖)(4)避免水滴污染培養(yǎng)基(5)接觸過細(xì)菌的器皿應(yīng)作滅菌處理劃線分離操作第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒滅菌，劃線操作結(jié)束仍需灼燒接種環(huán)，每次灼燒的目的如下表：

18、第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結(jié)束灼燒目的避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使每次劃線的菌種來自上次劃線末端殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。劃線時最后一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連。劃線用力要大小適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。2下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實驗的基本流程，請回答：(1)A過程配制的是通用細(xì)菌培養(yǎng)基，稱為_培養(yǎng)基。配制時除了加入特定的營養(yǎng)物質(zhì)以外，還要加入一定量的氯化鈉，以維持_。對培養(yǎng)基酸堿度的調(diào)節(jié)，應(yīng)該在B過程的_(填“前面”或“后面”)。(2)D過程與C

19、過程相比，培養(yǎng)基中增加的物質(zhì)是_。E過程所需的溫度是_。(3)D過程后，一個菌體便會形成一個_，這種分離方法是_的通用方法，也是篩選特定菌株的最簡便方法之一?！敬鸢浮?1)LB滲透壓前面(2)瓊脂4 (3)(單)菌落消除污染雜菌(純化菌種)1下列有關(guān)倒平板操作錯誤的是()A將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上B使打開的錐形瓶瓶口迅速通過火焰C將培養(yǎng)皿打開，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌面上D等待平板冷卻凝固后需要將平板倒過來放置【解析】整個倒平板過程要防止外來雜菌的入侵，因此，滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，打開的錐形瓶瓶口迅速通過火焰，培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能將培養(yǎng)皿蓋完全打開，等待平板冷卻凝固后需要

20、將平板倒過來放置?！敬鸢浮緾2無菌技術(shù)包括以下幾個方面的敘述，其中錯誤的是()A對培養(yǎng)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行滅菌B對培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌C為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行D實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸【解析】滅菌是采用強烈的理化因素對用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基進(jìn)行處理，使物體內(nèi)外一切微生物，包括芽孢和孢子都要被殺死；實驗操作者的衣著和手以及操作空間只能進(jìn)行消毒。【答案】A3下列依次表示倒平板、接種的位置，以及劃線法接種的路徑示意圖，其中錯誤的是()【解析】在劃線時，應(yīng)在第一區(qū)的劃線末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線，在第二區(qū)的劃線末端開始往第三區(qū)劃線?！敬鸢浮緿4關(guān)于大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗以下敘述不正