3.金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn)ppt課件

1、金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn),1、 金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性 2、 金黃色葡萄球菌的抗原構(gòu)造及分型簡介 3、 金黃色葡萄球菌的致病性 4、 金黃色葡萄球菌的流行病學(xué) 5、 金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法 6、 金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測 7、 金黃色葡萄球菌的快速檢測方法 8、 金黃色葡萄球菌污染的控制,一、金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性,1、形態(tài)與染色：(staphylococcus aureus) 典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。 金黃色葡萄球菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。 革蘭氏染色陽性。,金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性,2、培養(yǎng)特性： 金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在

2、普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37C，最適生長pH 7.4。 平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。 金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長。,附：,金黃色葡萄球菌平板菌落照片。,金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性,3、生化特性： 可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。 許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。 金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。,二、金黃色葡萄球菌的抗原構(gòu)造和分型（簡介）,對分型進(jìn)行簡單的了解

3、、血清學(xué)分型： 金葡水解，獲得兩種抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。 蛋白抗原是凝集抗原，無特異性。 多糖抗原有特異性。 絕大多數(shù)金葡含有A型抗原，B型抗原主要存在于凝固酶陰性菌株，C型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。 、噬菌體分型： 、根據(jù)腸毒素分型： 、根據(jù)血漿凝固酶分型：,三、金黃色葡萄球菌的致病性,金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。,金黃色葡萄球菌的致病性,金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶： a.溶血毒素：外毒素，分、四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺

4、血和壞死； b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞； c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)； d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌； e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E及F五種血清型。 當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時，經(jīng)8-10小時即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。腸毒素可耐受100C煮沸30分鐘而不被破壞,它引

5、起的食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉。 此外，金黃色葡萄球菌還產(chǎn)生溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。,四、金黃色葡萄球菌的流行病學(xué),金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。作為人和動物的常見病原菌，其主要存在于人和動物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機(jī)會很多。 近年來，美國疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。,金黃色葡萄球菌的流行病學(xué),金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有如下特點(diǎn)： 季節(jié)分布，多見于春夏季；中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米

6、糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。 一般說，金黃色葡萄球菌可通過以下途徑污染食品： 食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；熟食制品包裝不嚴(yán)，運(yùn)輸過程受到污染；奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r，對肉體其他部位的污染。,金黃色葡萄球菌的流行病學(xué),金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生問題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。腸毒素形成條件： 存放溫度

7、，在37C內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時間越短； 存放地點(diǎn)，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素； 食物種類，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。,食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 五、 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法,1主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。 2引用標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑 3設(shè)備和材料(略) 4培養(yǎng)基和試劑(略) 5檢驗(yàn)程序(略),金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法,定性試驗(yàn) 定量檢測（Baird Parker平板法）,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法 6操作步驟,6.1增菌培養(yǎng)法6

8、.1.1檢樣處理稱取25g固體樣品；吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。6.1.2增菌及分離培養(yǎng)吸取5mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯50mL培養(yǎng)基內(nèi)，置361溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種血平板和BairdParker平板，361培養(yǎng)24h，挑取金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。6.1.3形態(tài)本菌為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.51m。6.1.4在肉湯中呈混濁生長，在胰酪陳大豆肉湯內(nèi)有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，也有時為白色，大而

9、突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。6.1.5血漿凝固酶試驗(yàn)吸取14新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，放361溫箱或水浴內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽性

10、結(jié)果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。6.2直接計(jì)數(shù)方法6.2.1吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行十倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入三塊BairdParker平板，每個平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個平板。如水分不多吸收，可將平板放在361溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置361溫箱培養(yǎng)。6.2.2在三個平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個菌落，分別接種血平板，36124h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。6.2.3菌落計(jì)數(shù)：將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿

11、凝固酶陽性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法,用3 mm接種環(huán),從有細(xì)菌生長的各管中移取1 環(huán),劃線接種于表面干燥的Baird- Parker瓊脂平板,置361培養(yǎng)4548h。 怎樣在平板上進(jìn)行細(xì)菌的劃線分離。 1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,金黃色葡萄球菌的單個菌落在Baird-Parker瓊脂平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕 潤,直徑23mm?；液谏梁谏?有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈 (沉淀),其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣粘稠感。有時可見到不分 解脂肪的菌株,除沒有

12、不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫 水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。,金黃色葡萄球菌在BP平板上的菌落形態(tài),金黃色葡萄球菌血漿凝固酶,按血漿凝固酶的機(jī)理不同可分兩種 結(jié)合凝固酶：又稱凝聚因子，是一種結(jié)合菌體細(xì)胞壁的酶，直接作用于血漿中的纖維蛋白原，使之變成纖維蛋白而使葡萄球菌凝集成塊。于該酶存在菌體表面，故可用玻片法測之。 分泌型凝固酶：是游離于菌體外的游離凝固酶，類似凝血酶原樣物質(zhì)，不直接作用于血漿纖維蛋白原而是和一種凝固酶反應(yīng)因子結(jié)合形成一種穩(wěn)定復(fù)合物。該復(fù)合物具有凝血酶樣活性作用于纖維蛋白原而使血漿凝固。因此該酶只能用試管

13、法檢測。,金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn),取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿于8mm100mm試管內(nèi)充分混合,置 361培養(yǎng),定時觀察是否有凝塊形成,至少觀察6 h,以內(nèi)容物完全凝固,使試管倒置或 傾斜時不流動者為陽性。試驗(yàn)中需同時做巳知陽性和陰性對照。,六、金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測（簡介）,一、動物學(xué)試驗(yàn)：主要用幼貓和猴。 二、血清學(xué)試驗(yàn)： 腸毒素作為抗原，可以和特異性抗體發(fā)生結(jié)合性反應(yīng)，產(chǎn)生可見沉淀。 用血清學(xué)反應(yīng)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌腸毒素，方法主要有： 免疫瓊脂擴(kuò)散法 反向間接血凝試驗(yàn) 免疫熒光法 酶聯(lián)免役吸附法,七、金黃色葡萄球菌快速檢測方法（簡介）,目前，隨著研究的深入

14、，一些快速和采用現(xiàn)代技術(shù)的檢測方法不斷出現(xiàn)，這些新的快速方法，一般都縮短了傳統(tǒng)檢測方法的時間，能夠較快地得到檢測結(jié)果，并且操作相對簡單。比如：法國梅里埃公司生產(chǎn)的RPF試劑盒、API檢測系統(tǒng)等。梅里埃公司生產(chǎn)的miniVIDAS利用熒光免疫的方法檢測葡萄球菌腸毒素，在儀器上45分鐘可以得到結(jié)果。 附：梅里埃公司生產(chǎn)的miniVIDAS 比如：美國3M公司生產(chǎn)的金黃色葡萄球菌快速檢測試片，可以直接計(jì)數(shù)產(chǎn)生耐熱核酸酶的金黃色葡萄球菌，操作簡單，縮短了時間。,原理 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，最后測藍(lán)色熒光（ELFA）抗原（細(xì)菌、蛋白）的檢測是應(yīng)用一種夾心的技術(shù)，包被針上有抗體包被，所測得的熒光與標(biāo)本中抗原的含量成正比。 測試范圍 用以食品及環(huán)境樣本中的致病菌包括：沙門氏菌、李斯特菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、葡萄球菌腸毒素、大腸埃希菌O157、彎曲菌、免疫濃縮沙門氏菌、免疫濃縮大腸埃希菌O157。,八、金黃色葡萄球菌污染的控制,防止金黃色葡萄球菌污染食品 防止帶菌人群對各種食物的污染：定期對生產(chǎn)加工人員進(jìn)行健康檢查，患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等）的人員要暫時停止其工作或調(diào)換崗位