CRISPRCas9技術(shù)解讀ppt課件

1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用程序，introduction and applications of CRISPR-Cas S9 for genome engineering，anliang dong apr.16th，2010， Crispr/Cas-clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Crispr-associated proteins Crispr loci connection Cas genes-CRISPR-associated genes which are translated into pro

2、teins 1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史在1987年日本課題組在K12大腸桿菌堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了連續(xù)重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)它廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中2002年，官方以集群有規(guī)律的間隔命名的短回文重復(fù)序列發(fā)現(xiàn)了2005年CRISPR的間隔序列(spacer)牙齒宿主菌染色體外的遺傳物質(zhì)和高度動(dòng)員，據(jù)推測(cè)，細(xì)菌可以通過(guò)CRISPR系統(tǒng)以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。2007年，Barrangou等人首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵。2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)可以阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISP

3、R系統(tǒng)的功能。2013年初，MIT研究小組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)人類293T細(xì)胞EMX1和PVALB基因、鼠標(biāo)Nero2A細(xì)胞Th基因?qū)崿F(xiàn)了頂點(diǎn)突變。同年，Mali利用CRISPR/Cas9在人類293T細(xì)胞和K652細(xì)胞基因的靶區(qū)形成雙鏈或單鏈切口，激活細(xì)胞的DNA恢復(fù)機(jī)制，有效誘導(dǎo)外源基因部位插入。1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，CRISPR-Cas系統(tǒng)的構(gòu)成主要是由間隔序列S(spacers)間隔組成的CRISPR群集，其長(zhǎng)度與不連續(xù)重復(fù)序列R(repeat)相似，前置序列l(wèi) (lead Cas蛋白是雙鏈DNA核酸酶它類似于滑石粉酶功能，但不需要形成二聚體。(阿爾伯特愛(ài)

4、因斯坦，美國(guó)電視電視劇，)，Crispr/cas-clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Crispr-associated(cas)genes and Crispr array a series of repeat sequences(direct repeats)inter spaced by variable sequences 作為候選人。然后在CRISPR基因座的5段中合成重復(fù)序列。最后，新的間隔序列集成在兩個(gè)重復(fù)序列之間。當(dāng)再次侵入1.3 CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)制、CRIPSR基因座的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)

5、錄和轉(zhuǎn)錄后成熟處理)牙齒細(xì)菌時(shí)，CRISPR簇首先轉(zhuǎn)換為長(zhǎng)crRNA前驅(qū)體，然后逐漸加工為小而成熟的crRNA。發(fā)揮CRISPR/Cas系統(tǒng)活性或外源遺傳物質(zhì)的干擾crRNA結(jié)合相關(guān)Cas蛋白形成crRNA-Cas蛋白復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)正確結(jié)合目標(biāo)DNA，然后Cas蛋白折斷目標(biāo)DNA并分解。，1.3 CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)制，2，CRISPR-CAS系統(tǒng)的應(yīng)用，2.1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確剪輯技術(shù)基因組剪輯技術(shù)是基因操作技術(shù)，該技術(shù)可以在基因組層面對(duì)DNA序列進(jìn)行改造。牙齒技術(shù)的原理是構(gòu)建在預(yù)定的基因組位置切割DNA的人工內(nèi)切酶。被切割的DNA是在細(xì)胞內(nèi)DNA

6、修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)的過(guò)程中發(fā)生突變，達(dá)到特定部位改造基因組的目的。通過(guò)阿爾伯特愛(ài)因斯坦、美國(guó)電視電視劇(Northern Exposure)的恢復(fù)途徑，基因組剪輯技術(shù)成為研究基因功能的重要手段之一基因敲除、特異性突變的引入和固定基因基因基因組編輯這種技術(shù)也可以用于治療人類遺傳性疾病，因此成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，2.1 CRISPRMali等利用來(lái)自膿桿菌和熱鏈球菌的CRISPR相關(guān)蛋白Cas9，在人工重組的small-guide RNA(sgRNA)的地圖下，正確切下老鼠和人類基因組的特定基因片段。通過(guò)可編程RNA的DNA改造技術(shù)開(kāi)創(chuàng)了基因組編輯的新方法。例如：在基因敲除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，1，從基因

7、序列中找到NGG序列，獲得附近20多個(gè)堿基的序列，將其與tracrRNA序列融合，設(shè)計(jì)并合成sgRNA。2，將牙齒序列和cas9基因連接到載體，如圖所示。3、變形感覺(jué)狀態(tài)，質(zhì)粒小提取，測(cè)序驗(yàn)證。4、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染5，檢測(cè)敲除效果。6、建立穩(wěn)定的敲孔細(xì)胞系，抑制2.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和激活轉(zhuǎn)錄，CRISPR/Cas9型系統(tǒng)中Cas9的切割域突變失去了Cas9蛋白對(duì)的切割活性，但不影響與它結(jié)合的能力。失去牙齒切割活性的Cas9蛋白被稱為Dead as9。Cas9和gRNA在細(xì)胞中一起表達(dá)，gRNA可以與Cas9蛋白結(jié)合。如果Cas9結(jié)合在目標(biāo)基因的讀取盒中，就可以阻止RNA聚合

8、酶的擴(kuò)張。Cas9結(jié)合在目標(biāo)基因的子區(qū)域，可以阻止基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始、2.2crISPR/Cas9介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄激活。CRISPRCas9系統(tǒng)用于抑制PAM(bp)和至少12bp的gRNA對(duì)。利用CR介導(dǎo)的dCas9，可以正確識(shí)別目標(biāo)基因的特征，并將Cas蛋白與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)合使用。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可以通過(guò)將Cas9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活因子16結(jié)合獲得。3，CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和前景，3.1CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，以及實(shí)際應(yīng)用程序方面，CRISPRs比TALENs更易于操作。因?yàn)槊繉?duì)TALENs需要重新合成，CRISPR用的gRNA只需要替換20萬(wàn)，所以只需合成一個(gè)sgRNA，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修正，Cas蛋白沒(méi)有特異性。編碼SgRNA的序列不會(huì)超過(guò)100bp，因此比配置TALENs和ZFNs更容易、更方便。短sgRNA序列也避免了長(zhǎng)而高重復(fù)的TALENs編碼向量引起的并發(fā)癥。3.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用前景，目前應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的研究主要集中在基因編輯上。Cas9的真正優(yōu)點(diǎn)是它具有結(jié)合主要生物聚合物(，蛋白質(zhì))的特殊能力。各種功能性蛋白質(zhì)可以與Cas9蛋白融合，然后將gRNA的靶向作用結(jié)合到ds的隨機(jī)部位，發(fā)揮人們期待的功能。例如：