酵母RNA的提取、組分鑒定和含量測定.ppt

1、,實(shí)驗(yàn)六,酵母RNA的提取、組分鑒定和含量測定,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?【實(shí)驗(yàn)原理】,1.學(xué)習(xí)稀堿法提取RNA的原理和操作方法。 2.了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸組分的方法。 3.掌握地衣酚顯色法及紫外分光光度法測定酵母RNA含量的原理和方法,酵母核酸中RNA含量較多。RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。,核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。 RNA含量測定,除可用紫外吸收法、定磷法外,常用地衣酚法測定。其反應(yīng)原理是：當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時,即發(fā)生降解,形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變

2、為糠醛,后者與3,5-二羥基甲苯(地衣酚orcinol)反應(yīng),在Fe3+或Cu2+催化下,生成鮮綠色復(fù)合物。,反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收,RNA濃度在10-100g/ml范圍內(nèi),光吸收與RNA濃度成正比。地衣酚法特異性差,凡戊糖均有此反應(yīng),DNA和其他雜質(zhì)也能與地衣酚反應(yīng)產(chǎn)生類似顏色。因此,測定RNA時可先測得DNA含量再計(jì)算RNA含量。,1.實(shí)驗(yàn)材料： 酵母粉(或酵母片),【實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器、試劑】,2.實(shí)驗(yàn)儀器： 研缽、150mL錐形瓶、恒溫水浴鍋、布氏漏斗 及抽濾瓶、離心機(jī)、漏斗、分光光度計(jì)。,3.實(shí)驗(yàn)試劑： 0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇 溶液、1.5mo

3、l/L硫酸溶液 、濃氨水、 0.1mol/L硝酸銀溶液 、氯化鐵濃鹽酸溶 液、苔黑酚乙醇溶液、鉬酸銨試劑（將2g 鉬酸銨溶解在100ml10%硫酸中）、標(biāo)準(zhǔn) RNA母液、標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液、樣品溶液、地衣 酚-銅離子試劑,【實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器、試劑】,【操作步驟】,1.RNA的提取：將5g酵母懸浮30mL0.04mol/L氫氧化鈉溶液中，并在乳缽中研磨均勻。將懸浮液轉(zhuǎn)移至100毫升錐形瓶中。在沸水浴上加熱30分鐘后，冷卻。離心(3000r/min)15分鐘，將上清液緩緩傾入15 mL酸性乙醇溶液中。注意要一邊攪拌一邊緩緩傾入。待核糖核酸沉淀完全后，離心(3000r/min)3分鐘。棄去清液。用95

4、乙醇洗滌沉淀兩次，乙醚洗滌沉淀一次后，再用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。沉淀可在空氣中干燥。,2.RNA的水解：取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加熱10分鐘。制成水解液并進(jìn)行組分的鑒定。,3.RNA的組分鑒定 （1）嘌呤堿 取水解液1mL加入過量濃氨水，然后加入約1 mL 0.1mol/L硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物絮狀沉淀生成。,3.RNA的組分鑒定 （2）核糖 取1支試管加人水解液1mL、三氯化鐵濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10分鐘。注意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。 （3）磷酸 取1支試管，加入1ml水解液，

5、加入5滴濃HNO3和1ml鉬酸銨試劑后，在沸水浴中加熱，觀察有無黃色磷鉬酸銨沉淀產(chǎn)生，說明磷酸是否存在。,4.RNA地衣酚法顯色測定 （1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,（1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,按上表編號及加入試劑。加畢，搖勻，置沸水浴加熱25min，取出后冷水冷卻，以零號管作對照,于670nm波長處測定各管光吸收值。取測定的平均值,以RNA濃度為橫坐標(biāo),光吸收為縱坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,(2)樣品的測定取兩支試管,各加入2.0mL樣品注液,再加2.0mL地衣酚-Cu2+試劑，如前述進(jìn)行測定. (3)RNA含量的計(jì)算根據(jù)測得的光吸收值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光吸收的RNA含量，計(jì)算出制品中RNA的百分含量。

6、,【注意事項(xiàng)】,樣品中蛋白質(zhì)含量較高時,應(yīng)先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)后再測定。 本法特異性較差,凡屬戊糖均有反應(yīng).微量DNA無影響,較多DNA存在時,亦有干擾作用。如在試劑中加入適量CuCl2 .2H2O可減少DNA的干擾。此外,利用RNA和DNA顯色復(fù)合物的最大光吸收不同,且在不同時間顯示最大色度加以區(qū)分。反應(yīng)2min后,DNA在600nm呈現(xiàn)最大光吸收,而RNA則在反應(yīng)15min后,在670nm下呈現(xiàn)最大光吸收。,定磷試劑含有還原劑抗壞血酸，抗壞血酸很容易被空氣中的氧所氧化，使定磷試劑失效。因此可以改用鉬酸銨試劑定磷。核酸分子中的有機(jī)磷經(jīng)強(qiáng)酸消化后形成無機(jī)磷，在酸性條件下,無機(jī)磷與鉬酸銨結(jié)合形成黃色磷鉬酸銨沉淀。,【思考題】,1、如何得到高產(chǎn)量RNA粗制品？ 2、驗(yàn)證RNA中核糖的辦法，可否用以檢驗(yàn)脫氧核糖，為